CN109400739B

CN109400739B - 一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用

Info

Publication number: CN109400739B
Application number: CN201811268305.5A
Authority: CN
Inventors: 陈贵堂; 廖登未; 黄德春; 程抒劼; 曹崇江
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: CN109400739A

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其主要由以下步骤分离纯化所得：(1)取生姜粉，加入10‑35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取；(2)将提取液依次进行离心、过滤、浓缩、除蛋白和醇沉，对醇沉物进行洗涤后，用蒸馏水复溶，进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；(3)将生姜粗多糖采用纤维素阴离子交换层析柱上样与洗脱；(4)将上述洗脱后样品采用葡聚糖凝胶层析柱上样与洗脱，即得所述生姜多糖。本发明采用超声波冰浴法，经过分离纯化，得到一种对肿瘤有较强抑制作用的多糖UIP1，为今后在食品、医药等实际生产应用中奠定了坚实的基础。同时本发明实验操作简单，且效率高，所获得多糖药理活性高，可应用于大规模的工业生产。

Description

一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用

技术领域

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用，属于生姜多糖技术领域。

背景技术

生姜(Zingiber officinale Roscoe)，又名百辣云、姜根，传统中医认为生姜具有止咳、化痰、散寒等功效，目前主要分布于我国四川、贵州、福建、广西等地。现代科学研究表明生姜提取物具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑制细菌生长、抗动脉粥样硬化等作用，其中姜酮、姜酚对肿瘤均有较显著的抑制生长作用。生姜作用药食同源的代表，具有较高的药用价值，同时具有加高经济价值和开发利用前景。

生姜多糖作为一种植物多糖，具有抗氧化、抗疲劳、抗炎抗菌等药理作用。目前在生姜多糖的提取工艺中多采用传统提取方法，多糖中蛋白、核酸等物质较多，多糖纯度较低，且目前国内外尚未有研究报道生姜多糖对肿瘤具有抑制作用。

发明内容

发明目的：为解决上述技术问题，本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖及其应用，本发明通过特定的分离纯化方法，得到一种生姜多糖，其具有显著的抗肿瘤活性，尤其对于人结肠癌。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种具有抗肿瘤活性的生姜多糖，其主要由以下步骤分离纯化所得：

(1)取生姜粉，加入10-35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取；

(2)将提取液依次进行离心、过滤、浓缩、除蛋白和醇沉，对醇沉物进行洗涤后，用蒸馏水复溶，进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；

(3)将生姜粗多糖采用纤维素阴离子交换层析柱上样与洗脱；

(4)将上述洗脱后样品采用葡聚糖凝胶层析柱上样与洗脱，即得所述生姜多糖。

作为优选：

步骤(1)中生姜粉为干燥的生姜粉，且加入蒸馏水之前，进行过筛处理。

步骤(1)中超声提取的条件为：超声功率200-600W，超声时间20-45min。

步骤(2)中浓缩采用旋蒸浓缩；除蛋白采用sevag法除蛋白。

步骤(2)中对醇沉物进行无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤。

步骤(3)中采用DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱，用氯化钠溶液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，浓缩，透析除杂，冷冻干燥，备用。

步骤(4)中采用Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱，将蒸馏水过0.45μm微孔滤膜，制备成过膜水，用过膜水配制不同浓度的NaCl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，即得所述生姜多糖。

所述的生姜多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，优选，所述肿瘤为结肠癌。

技术效果：相对于现有技术，本发明采用超声波冰浴法(ultrasonic ice bath)，经过分离纯化，得到一种对肿瘤有较强抑制作用的多糖UIP1，为今后在食品、医药等实际生产应用中奠定了坚实的基础。同时本发明实验操作简单，且效率高，所获得多糖药理活性高，可应用于大规模的工业生产。

附图说明

图1：生姜多糖的DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱洗脱曲线。

图2：生姜多糖的Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线。

图3：不同浓度的UIP1对HCT116细胞的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步详细的说明。

实施例1生姜多糖(UICP)的分离纯化

1.实验试剂及主要仪器

1.1实验试剂

干姜片亳州市常富药业有限公司；PBS缓冲液(10X)、MTT(噻唑兰)、RPMI-1640不完全培养基(含双抗)南京凯基生物试剂有限公司；DMSO南京化学试剂有限公司；北美胎牛血清(FBS)Gibco公司；HCT116人结肠癌细胞中国药科大学食品教研室；其它试剂均为国产分析纯试剂。

2.1主要仪器

ATX224型分析天平岛津(香港)有限公司；HH-42数显恒温搅拌循环水箱常州国华电器有限公司；Nikon显微镜南京江南永新光学有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台苏州净化设备厂；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；多功能酶标仪Promega公司；CO₂培养箱ThermoForma公司，超低温冰箱；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机温岭市林大机械有限公司；TU-1901型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；LXJ-IIB型离心机上海安亭科学仪器厂；JY-92IIN型超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司；PD-1C-50型真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；ATX224型分析天平日本岛津仪器公司；RE-5205型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。

1.2生姜多糖提取步骤

取干燥的生姜粉，过60目筛，加入20倍质量蒸馏水，超声功率400W，超声时间35min，置于冰浴中提取；

将提取液进行离心、过滤、旋蒸浓缩、sevag法除蛋白、醇沉，然后对醇沉物进行无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤(2次)后，用蒸馏水复溶后进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；

1.3生姜多糖纯化步骤

(1)DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱的上样与洗脱

将生姜多糖用过膜水配制成10mg/mL的样品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，上样20mL。分别用0、0.1、0.3、0.5及0.7mol/L氯化钠溶液(用过膜水配制)作为洗脱液进行洗脱，流速为1mL/min，每个浓度的氯化钠溶液收集20管，每管收集10min。将各管收集液在490nm处进行硫酸-苯酚法逐管测定各管收集液中的多糖含量，并在280nm处测定蛋白含量，以管号作为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生姜多糖的DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱洗脱曲线(图1)。根据洗脱曲线，对多糖含量和蛋白含量之差最大的组分UICP1进行收集，利用旋转蒸发仪于55℃下进行蒸发浓缩，之后用截留分子量为10000Da的透析袋在4℃条件下进行透析除杂48h，冷冻干燥，用于后续实验。

(2)Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱的上样与洗脱

将蒸馏水过0.45μm微孔滤膜，制备成过膜水，将经DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱分离纯化得到的样品用过膜水配制成10mg/mL的样品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，上样2mL。用过膜水配制不同浓度的NaCl溶液作为洗脱液进行洗脱，流速为0.5mL/min，收集100管，每管收集10min。后续实验操作参照2(1)中DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱的实验方法，绘制生姜多糖的Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线(图2)，选择多糖含量与蛋白含量之差最大部分进行收集，得一种具有较强抗肿瘤活性多糖UIP1。

实施例2UIP1对HCT116人结肠癌细胞抑制生长作用

1.实验方法

1.1细胞复苏

将保存于液氮罐中的细胞取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中，细胞溶解过程中需不停的摇晃细胞液，待细胞液完全解冻后，迅速将细胞液转移至事先加有6mL培养基的离心管中，用移液枪吹打均匀，放入离心机中，1500rpm，5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，并将细胞液转移至事先加有7mL完全培养基的培养皿中，做好标记，放入培养箱中培养。

1.2细胞传代

从培养箱中取出需要传代的细胞，用移液枪吸去培养基，加入2mLPBS，轻轻摇晃，快速用移液枪吸去PBS，加入1mL胰酶，放入培养箱中进行消化2-3min，待细胞变圆时加入2mL培养基终止消化，并用移液枪将细胞吹打下来，转移至10mL离心管中，1500rpm，5min，弃上清，加入2mL培养基将细胞重悬，吸取500μL细胞悬液于事先加有7mL完全培养基的培养皿中，做好标记，放入培养箱中培养。

1.3 MTT实验

从培养箱中取出生长对数期的细胞，用移液枪吸去培养基，加入2mLPBS，轻轻摇晃，快速用移液枪吸去PBS，加入1mL胰酶，放入培养箱中进行消化2-3min，待细胞变圆时加入2mL培养基终止消化，并用移液枪将细胞吹打下来，转移至10mL离心管中，1500rpm，5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，取10μL细胞悬液于血球计数板，放至光学显微镜下迅速计数，稀释细胞悬液至8x10⁴-1x10⁵个/mL，在96孔板外围一周加上100μL的PBS，设计10个实验组，其中2个为对照组，分别为空白对照组和加DOX试剂的阳性对照组，将细胞液充分混匀，每孔加入100μL细胞悬液，每组实验4个复孔，铺好细胞后放入培养箱培养过夜，待细胞贴壁生长，加入不同浓度的各多糖样品溶液100μL，另注意加入以后的药物浓度应与最初设定相同，对照组加等体积的药物溶剂或培养基，将加药后的96孔板放入培养箱培养48h后，每孔加20μL MTT，在放入培养箱中4h，将96孔板取出放入孔板离心机中，1500rpm，5min，用注射器吸净上清，在每个细胞孔中加150μL DMSO并放入摇床中避光振荡15min，混合均匀，最后置于酶标仪490nm波长测每孔的吸光度，重复3次实验。

由图3可知，UIP1对HCT116细胞有较为明显的抑制作用。根据HCT116细胞抑制率图可看出，随给药终浓度升高，UIP1对HCT116细胞的抑制率先增加，当UIP1给药终浓度150μg/mL时抑制率最高，其抑制率可达56.843±2.405％，当浓度进一步增加时，抑制率有小幅下降，抑制率为50.106±2.005％。阳性对照组DOX的抑制率为62.438±0.2％。

实施例3

与实施例1相同，不同之处仅在于：加入10倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取，条件为：超声功率200W，超声时间45min。

所得生姜多糖，按照实施例2方法进行检测，当给药终浓度150μg/mL时对于HCT116人结肠癌癌细胞的抑制率最高，其抑制率可达51.467±2.312％。

实施例4

与实施例1相同，不同之处仅在于：加入35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取，条件为：超声功率600W，超声时间20min。

所得生姜多糖，按照实施例2方法进行检测，当给药终浓度150μg/mL时对于HCT116人结肠癌癌细胞的抑制率最高，其抑制率可达50.734±2.156％。

Claims

1.一种主要由以下步骤分离纯化所得的生姜多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为结肠癌：

（1）取生姜粉，加入10-35倍质量蒸馏水，置于冰浴中超声提取；

（2）将提取液依次进行离心、过滤、浓缩、除蛋白和醇沉，对醇沉物进行洗涤后，用蒸馏水复溶，进行真空冷冻干燥，得生姜粗多糖；

（3）将生姜粗多糖采用DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱，用氯化钠溶液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，浓缩，透析除杂，冷冻干燥，备用；

（4）将上述洗脱后样品采用Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析柱，不同浓度的NaCl溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，测定收集液中的多糖含量和蛋白含量，选择多糖含量和蛋白含量之差最大的组分，即得所述生姜多糖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药浓度为150μg/ml。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）中生姜粉为干燥的生姜粉，且加入蒸馏水之前，进行过筛处理。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）中超声提取的条件为：超声功率200-600W，超声时间20-45min。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中浓缩采用旋蒸浓缩；除蛋白采用sevag法除蛋白。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中对醇沉物进行无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤。