CN111675771B - 一种北沙参多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种北沙参多糖及其制备方法和应用,属于生物医药技术领域。所述制备方法包括北沙参粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子以及利用DEAE‑纤维素填充柱分离精制北沙参多糖等步骤。本发明获得的北沙参多糖其单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及半乳糖醛酸，通过RAW264.7细胞氧化损伤模型发现所述北沙参多糖具有良好的抗氧化活性。此种方法不仅操作简单、耗时短而且成本低廉。本发明获得的精制北沙参多糖能够为进一步探索北沙参多糖的结构、活性研究和开发北沙参多糖的药用价值奠定基础。

Description

一种北沙参多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种北沙参多糖及其制备方法和应用。

背景技术

沙参分为南沙参和北沙参，药典记载北沙参为常用中药，是伞形科植物珊瑚菜(GLPhnia littoralis Fr.schmidt ex Miq.)的干燥根。北沙参是卫生部公布的药食两用资源，被《本草纲目》列为五参之一，其性凉味甘，归肺胃经，具有清肺补阴、涵养肝阴、解郁潜阳、制火益气、清养心阴、补脾肺阴、和中降逆和安神除烦等多种功效。北沙参的化学组分，包括香豆素类、多糖类、氨基酸类、磷脂类及微量元素等，其中多糖比重最大，总糖含量达70％以上。目前为止，对于北沙参多糖的研究，主要集中于生物活性研究、提取工艺优化和含量测定方面。对其药理活性的研究也仅集中在粗多糖组分，有关北沙参总多糖的分离、纯化、结构表征及活性研究的报道较为少见。

不同的提纯工艺，所获得的多糖结构不同，其药理活性也呈现出较大差异。如中国专利CN 105985452A使用水提醇沉法，获得的是北沙参粗多糖，周红英等通过正交设计，使用微波辅助提取北沙参多糖，他们对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基具有明显的清除能力，多糖的结构未见详细报道；中国专利CN 105859903A的提取制备工艺分为除酯，水提醇沉，除蛋白，脱色素，透析，离子交换层析柱分离以及凝胶柱除盐，其获得的北沙参多糖，其单糖组成和摩尔比为：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖＝2.05:1.00:7.06。所得北沙参多糖能够清除DPPH自由基，螯合亚铁离子，具有良好的体外抗肿瘤活性，能够抑制小鼠S180移植瘤的生长。其多糖中的蛋白含量未见报道。杜宝香等发现通过水提醇沉，Sevage法除蛋白，活性炭脱色素，DEAE纤维素DE-52柱色谱法及葡聚糖凝胶G-75(Sephadex G-75)柱色谱法分离与纯化得到的北沙参多糖，相对分子量23.01kDa，由甘露糖-葡萄糖醛酸-鼠李糖-葡萄糖-半乳糖-阿拉伯糖组成，摩尔比为81.86:0.12:0.17:1259.7:0.54:0.33，对体外脾脏淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用，有较好的体外免疫活性。但获得的最终产物糖含量不高，且结构不明确。

目前尚未分离纯化制得北沙参均一多糖，这不利于进行多糖结构分析，无法深入探讨其作用机制。此外，北沙参多糖的生物活性研究大多数局限于对免疫系统的调节方面。纵观目前北沙参多糖的研究现状，发现存在单个化学成分与药理活性关系研究较少、相关化合物的提取和含量测定研究不足、大部分活性作用机制以及结构尚不明确等需要解决的问题。因此，为了进一步开发北沙参多糖的药用价值，保障北沙参用药的准确性和安全性，需要对北沙参化学组分、多糖结构、药理作用及其关系进行深入系统研究，并完善质量控制体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种北沙参多糖及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种北沙参多糖，所述北沙参多糖的分子量为15.8kDa，其单糖组成摩尔比为：葡萄糖:半乳糖:半乳糖醛酸:阿拉伯糖:鼠李糖＝18.6:6.6:5.9:5.4:1.0，蛋白含量＜0.2％。

本发明还提供所述的北沙参多糖的制备方法，包括以下步骤：北沙参粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子和制备精制北沙参多糖。

进一步的，所述北沙参粉碎为将北沙参粉碎后过筛，筛网孔径为40-80目。

进一步的，所述水提醇沉步骤为将粉碎后的北沙参进行水浴回流提取，料水比为1:20-1:100(g:mL)，回流时间为1-5h，回流温度为40-80℃，此步骤的目的为提取北沙参中的水溶性多糖。将获得的北沙参水提液使用旋转蒸发仪进行浓缩，之后在浓缩后的提取液中加入无水乙醇，最终得到的乙醇浓度范围是30-95％，静置6-24h后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀。

进一步的，所述除蛋白步骤为将收集的沉淀用200mL去离子水溶解，得到溶液，加入Sevage试剂，溶液与试剂体积比为4:1-1:1，振摇30分钟后，离心，弃去下层有机试剂和蛋白层，收集上清液，再加入Sevage试剂，剩余步骤同上，此步骤重复多次，直到两层交界处无明显变形蛋白，收集上清液，得到除蛋白的北沙参多糖溶液。

进一步的，所述除小分子步骤为将除蛋白的北沙参多糖溶液进行浓缩，采用透析的方式取去除小分子杂质，选用截留分子量为1000–5000Da的有机或者无机膜，放置于去离子水中透析两天，每2-6小时换水，透析后溶液稍有浑浊，离心弃去沉淀，离心转速12000r/min，离心时间10-15min，将透析后的水溶液使用旋转蒸发仪进行浓缩，于-40℃冰箱中放置过夜，进行冷冻干燥，得到北沙参粗多糖。

进一步的，所述精制北沙参多糖的步骤为将北沙参多糖使用去离子水溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于DEAE-纤维素色谱柱(2.5cm×30cm)，先以去离子水洗脱2CV，流速为10ml/min，再分别以0.4mol/L NaCl、1mol/L NaCl溶液等度洗脱2.5CV，流速为10ml/min，每分钟收集一管洗脱液。洗脱液中的糖含量采用苯酚-硫酸法检测。合并滤液，使用500-1000Da的有机或无机膜进行透析除盐，浓缩后冻干即得精制北沙参多糖。

进一步的，所述Sevage试剂为三氯甲烷：水饱和正丁醇以4：1的体积比混合而成的溶液。

本发明还提供所述北沙参多糖的应用，所述应用为北沙参多糖在制备抗肿瘤药物或抗氧化活性药物中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

通过本发明方法制备得到的北沙参多糖其单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸。通过RAW264.7细胞氧化损伤模型发现该北沙参多糖具有良好的抗氧化活性。本发明的方法不仅操作简单、耗时短并且成本低廉。本发明获得的精制北沙参多糖能够为进一步探索北沙参多糖的结构、活性研究和开发北沙参多糖的药用价值奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中经DEAE-纤维素色谱柱分离后得到的GLP-1和GLP-2糖含量分布图；

图2是本发明实施例1中制得的北沙参粗多糖的单糖组成色谱图，标准品出峰顺序为1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.氨基半乳糖；5.氨基葡萄糖；6.半乳糖；7.葡萄糖；8.甘露糖或木糖；9.果糖；10.半乳糖醛酸；11.葡萄糖醛酸；

图3是本发明实施例1中制得的精致北沙参多糖两个组分GLP-1和GLP-2的单糖组成色谱图，标准品出峰顺序为1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.半乳糖；5.葡萄糖；6.甘露糖或木糖；7.果糖；8.半乳糖醛酸；9.葡萄糖醛酸；

图4是本发明实施例1中GLP-2的核磁共氢谱图；

图5是本发明实施例1中GLP-2的核磁共碳谱图；

图6是本发明实施例1中GLP-2的核磁COSY图；

图7是本发明实施例1中GLP-2的核磁HSQC图；

图8是本发明实施例1中不同浓度的H₂O₂与RAW264.7细胞存活率的关系图；

图9是本发明中实施例1的不同剂量的GLP-1、GLP-2对H₂O₂氧化损伤的RAW264.7细胞保护作用关系图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

将北沙参打粉后，过40目筛，称取50g，按料水比为1:50(g:mL)进行回流提取，回流时间5小时，回流温度为80℃。使用500ml茄形旋蒸瓶将提取液进行浓缩，之后冻干。取水提冻干后的北沙参2.00g，置于500ml烧杯中，加入50ml去离子水，在80℃水浴中使其溶解，分别进行70％醇沉，醇沉后离心(4500r/min，15min，下同)得到醇沉多糖，醇沉多糖依次以无水乙醇、丙酮洗涤离心。取离心后沉淀分别用200ml去离子水溶解，加入Sevage试剂(三氯甲烷：水饱和正丁醇＝4：1)50ml，振摇30分钟后，离心，弃去下层有机试剂和蛋白层，收集上清液，再加入Sevage试剂，剩余步骤同上，此步骤重复多次，直到两层交界处无明显变形蛋白。取上清液置于500ml茄形旋蒸瓶旋蒸，用少量去离子水洗出，浓缩液置于3500D透析膜，放置于去离子水中透析两天，每4小时换水，透析后溶液稍有浑浊，离心(12000r/min，15min)，置于50ml离心管中于-40℃冰箱中冷冻一夜，冷冻后置于冻干机中抽真空冻干，冻干后得到70％醇沉北沙参多糖冻干品。采用二乙氨基乙基-纤维素(简称DEAE-纤维素)柱对70％醇沉北沙参多糖进行分离纯化。称取70％醇沉北沙参多糖1g，加入20mL去离子水使其溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过后，上样于DEAE-纤维素色谱柱(2.5cm×30cm)。先以去离子水洗脱2CV，流速为10ml/min，再分别以0.4mol/L NaCl、1mol/L NaCl溶液等度洗脱2.5CV，流速为10ml/min，每分钟收集一管洗脱液，每管10ml。洗脱液中的糖含量采用苯酚-硫酸法检测。经DEAE-纤维素色谱柱分离后得到的GLP-1和GLP-2糖糖含量的分布见图1，因此分步收集8-16min、40-46min洗脱液并合并，经蒸馏水透析除盐后，冻干备用，得到两个组分：294.2mg的GLP-1和243.7mg的GLP-2，蛋白含量＜0.2％，多糖收率为7.5％。

对实施例1中所得的产品分别进行单糖组成分析、核磁共振分析。

(1)单糖组成分析

分别称取北沙参二级粗多糖、GLP-1和GLP-2各15mg置于棕色瓶中，加入1mol/L三氟乙酸溶液3ml，配制为5mg/mL溶液，放置于100℃烘箱中12h，取酸解后的样品1mL进行旋蒸，不断加入水旋蒸带出三氟乙酸，直到无酸味。旋蒸后转移入20mL定容瓶中，定容后取200μL，加入1.8mL水，稀释为浓度25ppm，备用。精密称取岩藻糖、鼠李糖、氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸各5mg，配制为10mg/mL溶液，分别取10μL加入5mlEP管中，然后加3.88ml超纯水配制为4mL混合液，其浓度为25ppm，备用。Dionex CarboPac PA-1色谱柱(4×250mm)，流动相A为15mM NaOH溶液，流动相B为15mM NaOH+1M NaOAc，流速为1mL/min；梯度程序为0～10min，0％B；10～40min，0-100％B；40～45min，100％B；45～50min，100-0％B；50～60min，0％B。根据单糖的保留时间确定样品中存在的各单糖组成成分。实施例1中制得的北沙参粗多糖的单糖组成色谱图见图2，实施例1中制得的精致北沙参多糖两个组分GLP-1和GLP-2的单糖组成色谱图见图3，北沙参粗多糖中含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及半乳糖醛酸。GLP-1只含有葡萄糖。GLP-2含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及半乳糖醛酸。

(2)核磁共振分析

称取70mg GLP-2样品，加入700μL的D₂O，充分溶解，装入核磁管中，进行一维氢谱(¹H-NMR)、碳谱(¹³C-NMR)分析、二维核磁分析。实施例1中GLP-2的核磁共氢谱图见图4，实施例1中GLP-2的核磁共碳谱图见图5，实施例1中GLP-2的核磁COSY图6，实施例1中GLP-2的核磁HSQC图见图7。

北沙参多糖的体外抗氧化活性研究

对实施例1中制备所得精制北沙参多糖进行体外抗氧化活性评价。

(1)样品处理：分别精密称取GLP-1、GLP-2各5mg，转移至超净工作台内，加入1mL无菌PBS使其溶解，即配制为浓度5mg/mL样品溶液，此溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，然后使用DMEM高糖培养基稀释为1mg/mL的样品溶液，再稀释为300μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL样品溶液。

(2)RAW264.7细胞的培养：取出冻存在-80℃的RAW264.7细胞迅速转移至37℃水浴中，当细胞将要完全融化时，在超净台内转移至加入装有4mL细胞培养液的15mL离心管内，离心(800r/min 5min)。弃去上清液，然后加入1mL细胞培养液，慢慢轻柔地吹打沉淀使细胞重新悬浮，细胞重悬后转移至细胞培养皿中，然后将培养皿置于37℃、5％CO₂的培养箱内培养。24h后观察细胞生长的情况，如果细胞贴壁生长良好则更换新鲜细胞培养液，继续培养24h后观察细胞生长情况。重复此操作直至细胞密度达到70-80％时，用胰酶消化2min，轻轻吹打均匀，即可传代。

(3)CCK-8检测：当细胞密度达到70-80％时，用胰酶消化并用DMEM培养基稀释至密度约为10×10⁴个/mL，按100μL/每孔接种至96孔板中，为了扣除背景吸收，设置一行空白孔(此行仅加相同体积的培养基)，将PBS溶液在96孔板的边缘孔按100μL/每孔加入，然后将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。吸去上清液，分别加入300μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL浓度的GLP-1、GLP-2样品溶液各100μL，每个样品五个平行组，对照组更换100μL新鲜培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。24h后观察细胞生长状况，若细胞贴壁良好且达到生长对数期则按10μL/每孔在避光条件下加入CCK-8溶液，然后将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中继续孵育1.5h后在450nm下测定其吸光度，根据公式细胞存活率(％)＝(A给药-A空白)/(A对照-A空白)*100％计算存活率。

(4)RAW264.7细胞氧化损伤模型的建立:当细胞密度达到70-80％时，用胰酶消化后使用DMEM培养基稀释至密度约为10×10⁴个/mL，按100μL/每孔接种至96孔板中，为了扣除背景吸收，设置一行空白孔(此行仅加相同体积的培养基)，将PBS溶液填充在96孔板的边缘孔，将其置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。用DMEM培养基将摩尔浓度为0.88mol/L的3％的H₂O₂溶液稀释至100mmol/L，再稀释为0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1、2、5、10mmol/L 10个不同的浓度，加入96孔板。再培养24h后，观察细胞生长状况，若细胞贴壁良好且达到生长对数期则在避光条件下加入CCK-8溶液，10μL/每孔，然后继续孵育1.5h后测定吸光度(450nm)，计算细胞存活率。

(5)用H₂O₂氧化损伤模型检测GLP-1、GLP-2是否具有保护作用:当细胞生长到密度为70-80％时，用胰酶消化，消化后用DMEM培养基稀释至密度约为10×10⁴个/mL，然后按照100μL/每孔接种至96孔板中，为了扣除背景吸收，设置一行空白孔(此行仅加相同体积的培养基)，将PBS溶液填充在96孔板的边缘孔，将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。吸去上清液，分别加入300μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL浓度的GLP-1、GLP-2样品溶液各100μL，每个样品五个平行组，对照组和损伤组更换100μL新鲜培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，以(4)中氧化损伤模型给出的H₂O₂浓度向给药组和H₂O₂损伤组加入此浓度的H₂O₂溶液。继续培养24h后，观察细胞生长状况，若细胞贴壁良好且达到生长对数期则在避光条件下加入CCK-8溶液，10μL/每孔，然后继续孵育1.5h后在450nm下测定吸光度计算细胞存活率。

(6)细胞氧化损伤模型中H₂O₂浓度的选择:各梯度浓度的H₂O₂溶液与空白对照组相比之下均有抑制RAW264.7细胞的生长的作用，同时随着H₂O₂浓度的升高细胞存活率逐渐下降。不同浓度的H₂O₂与RAW264.7细胞存活率的关系图见图8。在选择H₂O₂浓度时，考虑到低浓度的H₂O₂不能有效地抑制细胞增殖，而过高浓度的H₂O₂过高又会引起细胞死亡过量，不利于实验的进行，因此，从实验结果看来，细胞存活率约为50％时，H₂O₂浓度处于0.8mmol/L，则以此浓度作为半致死浓度。所以，采用0.8mmol/L浓度的H₂O₂。

(7)实验结果：北沙参多糖对H₂O₂诱导RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用。不同剂量的GLP-1、GLP-2对H₂O₂氧化损伤的RAW264.7细胞保护作用关系图见图9，GLP-1在10μg/mL剂量下具有保护作用，100μg/mL、300μg/mL剂量组的存活率保持在90％以上，并呈现出的剂量依赖关系，表明GLP-1对H₂O₂诱导损伤的RAW264.7细胞显示出较强的保护作用，且其保护作用随着剂量的增加而逐渐增强。给予1μg/mL剂量GLP-2处理组的细胞存活率就明显高于H₂O₂损伤模型组(46.20％vs71.66％)，且10μg/mL、100μg/mL、300μg/mL剂量组的存活率分别保持在104.6％、99.25％、90.58％，表明GLP-2对H₂O₂诱导损伤的RAW264.7细胞显示出较强的保护作用。实验数据表明GLP-1、GLP-2对H₂O₂导致的RAW264.7细胞氧化损伤具有保护作用，GLP-1对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用呈剂量依赖关系，GLP-2对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用不呈剂量依赖关系。

实施例2

将北沙参打粉后，过60目筛，称取50g按料水比为1:50(g:mL)进行回流提取。回流时间5小时，回流温度为70℃。使用500ml茄形旋蒸瓶将提取液进行浓缩，之后冻干。取水提冻干后的北沙参2.00g，置于500ml烧杯中，加入50ml去离子水，在80℃水浴中使其溶解，分别进行30％醇沉，醇沉后离心(4500r/min，15min，下同)得到醇沉多糖，醇沉多糖依次以无水乙醇、丙酮洗涤离心。取离心后沉淀分别用200ml去离子水溶解，加入Sevage试剂(三氯甲烷：水饱和正丁醇＝4：1)50ml，振摇30分钟后，离心，弃去下层有机试剂和蛋白层，收集上清液，再加入Sevage试剂，剩余步骤同上，此步骤重复多次，直到两层交界处无明显变形蛋白。取上清液置于500ml茄形旋蒸瓶旋蒸，用少量去离子水洗出，浓缩液置于3500D透析膜，放置于去离子水中透析两天，每4小时换水，透析后溶液稍有浑浊，离心(12000r/min，15min)，置于50ml离心管中于-40℃冰箱中冷冻一夜，冷冻后置于冻干机中抽真空冻干，冻干后得到30％醇沉北沙参多糖冻干品。采用二乙氨基乙基-纤维素(简称DEAE-纤维素)柱对30％醇沉北沙参多糖进行分离纯化。称取30％醇沉北沙参多糖1g，加入20mL去离子水使其溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过后，上样于DEAE-纤维素色谱柱(2.5cm×30cm)。先以去离子水洗脱2CV，流速为10ml/min，再分别以0.4mol/L NaCl、1mol/L NaCl溶液等度洗脱2.5CV，流速为10ml/min，每分钟收集一管洗脱液，每管10ml。洗脱液中的糖含量采用苯酚-硫酸法检测。糖含量的分布见附图1，因此分步收集8-16min、40-46min洗脱液并合并，经蒸馏水透析除盐后，冻干备用，得到两个组分：253.9mg的GLP-1和190.3mg的GLP-2。

实施例3

将北沙参打粉后，过40目筛，称取50g按料水比为1:50(g:mL)进行回流提取。回流时间5小时，回流温度为60℃。使用500ml茄形旋蒸瓶将提取液进行浓缩，之后冻干。取水提冻干后的北沙参2.00g，置于500ml烧杯中，加入50ml去离子水，在80℃水浴中使其溶解，分别进行95％醇沉，醇沉后离心(4500r/min 15min，下同)得到醇沉多糖，醇沉多糖依次以无水乙醇、丙酮洗涤离心。取离心后沉淀分别用200ml去离子水溶解，加入Sevage试剂(三氯甲烷：水饱和正丁醇＝4：1)50ml，振摇30分钟后，离心，弃去下层有机试剂和蛋白层，收集上清液，再加入Sevage试剂，剩余步骤同上，此步骤重复多次，直到两层交界处无明显变形蛋白。取上清液置于500ml茄形旋蒸瓶旋蒸，用少量去离子水洗出，浓缩液置于3500D透析膜，放置于去离子水中透析两天，每4小时换水，透析后溶液稍有浑浊，离心(12000r/min 15min)，置于50ml离心管中于-40℃冰箱中冷冻一夜，冷冻后置于冻干机中抽真空冻干，冻干后得到95％醇沉北沙参多糖冻干品。采用二乙氨基乙基-纤维素(简称DEAE-纤维素)柱对95％醇沉北沙参多糖进行分离纯化。称取95％醇沉北沙参多糖1g，加入20mL去离子水使其溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过后，上样于DEAE-纤维素色谱柱(2.5cm×30cm)。先以去离子水洗脱2CV，流速为10ml/min，再分别以0.4mol/L NaCl、1mol/L NaCl溶液等度洗脱2.5CV，流速为10ml/min，每分钟收集一管洗脱液，每管10ml。洗脱液中的糖含量采用苯酚-硫酸法检测。糖含量的分布见附图1，因此分部收集8-16min、40-46min洗脱液并合并，经蒸馏水透析除盐后，冻干备用，得到两个组分265.1mg的GLP-1和212.4mg的GLP-2。

本发明所述方法与传统方法相比，优势见表1。

表1：本发明与传统方法对比

表1中传统方法1为景永帅,苏蕾,韩钰,张丹参,张瑞娟,吴兰芳,郑玉光,秦璇.北沙参多糖的提取工艺、理化性质及生物活性研究[J].食品与机械,2018,34(06):152-157.传统方法2为侯宗福,张彬,周武,李福星,刘伟.北沙参水溶性多糖提取工艺[J].南昌大学学报(理科版),2007(01):79-81.

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种北沙参多糖，其特征在于，所述北沙参多糖的分子量为15.8kDa，其单糖组成摩尔比为：葡萄糖:半乳糖:半乳糖醛酸:阿拉伯糖:鼠李糖＝18.6:6.6:5.9:5.4:1.0，蛋白含量＜0.2％；

所述北沙参多糖的制备方法，包括以下步骤：北沙参粉碎至40-80目，水提醇沉，除蛋白，除小分子，制备精制北沙参多糖；

所述水提醇沉步骤为将粉碎后的北沙参进行回流提取，料水比为1:50(g:mL)，之后在提取液中加入无水乙醇，最终得到的乙醇浓度范围是30-95％，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀；

所述除蛋白步骤为将收集的沉淀用200mL去离子水溶解，得到溶液，加入Sevage试剂，溶液与试剂体积比为4:1，摇，离心取上清，重复1-3次，得到除蛋白的北沙参多糖溶液；

所述除小分子步骤为将除蛋白的北沙参多糖溶液进行浓缩，采用透析的方式去除小分子杂质，选用截留分子量为1000–5000Da的有机或者无机膜，干燥后得到北沙参粗多糖；

所述制备精制北沙参多糖的步骤为使用二乙氨基乙基-纤维素装填的色谱柱进行纯化北沙参多糖，流动相为水和氯化钠溶液，流速为10ml/min，每分钟收集一管滤液，使用苯酚-硫酸法测定糖含量分布，合并滤液得到精制北沙参多糖；

所述Sevage试剂为三氯甲烷：水饱和正丁醇以4：1的体积比混合而成的溶液。

2.一种权利要求1所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：北沙参粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子，制备精制北沙参多糖。

3.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述北沙参粉碎至40-80目。

4.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述水提醇沉步骤为将粉碎后的北沙参进行回流提取，料水比为1:50(g:mL)，之后在提取液中加入无水乙醇，最终得到的乙醇浓度范围是30-95％，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀。

5.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述除蛋白步骤为将收集的沉淀用200mL去离子水溶解，得到溶液，加入Sevage试剂，溶液与试剂体积比为4:1，摇，离心取上清，重复1-3次，得到除蛋白的北沙参多糖溶液。

6.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述除小分子步骤为将除蛋白的北沙参多糖溶液进行浓缩，采用透析的方式去除小分子杂质，选用截留分子量为1000–5000Da的有机或者无机膜，干燥后得到北沙参粗多糖。

7.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述制备精制北沙参多糖的步骤为使用二乙氨基乙基-纤维素装填的色谱柱进行纯化北沙参多糖，流动相为水和氯化钠溶液，流速为10ml/min，每分钟收集一管滤液，使用苯酚-硫酸法测定糖含量分布，合并滤液得到精制北沙参多糖。

8.根据权利要求5所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述Sevage试剂为三氯甲烷：水饱和正丁醇以4：1的体积比混合而成的溶液。

9.权利要求1所述的一种北沙参多糖的应用，其特征在于，北沙参多糖在制备抗氧化活性药物中的应用。

10.权利要求1所述的一种北沙参多糖的应用，其特征在于，北沙参多糖在制备抗氧化损伤药物中的应用。

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