CN111100217B - 一种黄芪葡聚糖及其提取方法与应用 - Google Patents

一种黄芪葡聚糖及其提取方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，本发明提供了一种黄芪葡聚糖及其提取方法与应用，该黄芪葡聚糖通过对黄芪进行提取得到，主要由葡萄糖结构单元和半乳糖结构单元组成，以α‑(1→4)葡萄糖苷键连接方式为主；所述葡萄糖结构单元相对摩尔比含量在95％以上。本发明所述的黄芪葡聚糖在单糖组成等方面不同于传统黄芪多糖，可对皮肤细胞产生有效的抗紫外损伤的效果，能延缓衰老，可用于制备预防和/或治疗UVA引起的皮肤细胞损伤的产品。所述黄芪葡聚糖来源属于纯天然产物，无副作用，具有良好的市场应用前景。

Description

一种黄芪葡聚糖及其提取方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄芪葡聚糖及其提取方法与应用。
背景技术
防止皮肤衰老，一直是人们研究的热点。皮肤衰老现象通常被认为与皮肤结构密切相关。以表皮为例，表皮角质层是皮肤的最外层部分，主要由10至20层扁平、没有细胞核的死亡细胞组成，其可以抵御外界各种物理、化学和紫外线等有害因子对皮肤的侵袭，同时防止色素沉积。因此，保护好表皮角质层，将有利于抗氧化并防止衰老。
多糖具有多种生物功能，对人体副作用小，在抗衰老方面受到人们重视。近年来，有人报道了金福菇多糖、牡蛎多糖和党参多糖等具有抗衰老的功效。其中，黄芪多糖(Astragalus membranaceus polysaccharide，AMP)具有抗氧化作用，且无毒副作用。黄芪多糖提取于黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.)，其为多年生草本传统中药材，高50-100厘米，产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，多以根入药，具有归脾、肺经之功效，同时具有增强机体免疫功能、抗病毒、抗氧化等多种药理功效，能提升机体免疫器官功能和促进抗体产生。
人们也对不同多糖的抗衰老机制进行了探究，如有些多糖可以直接作用于活性氧自由基、羟自由基以及脂过氧自由基，减缓过氧化的进程，起到清除自由基作用。近年来，对黄芪多糖的研究发现，其具有抗氧化及抗菌等生物活性。然而，现有技术提取的黄芪多糖对提高皮肤免疫功能、延缓衰老方面未见有功效。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种黄芪葡聚糖及其提取方法与应用，本发明提供的黄芪葡聚糖可对皮肤细胞产生有效的抗紫外损伤的效果，能延缓衰老。
本发明提供一种黄芪葡聚糖，通过对黄芪进行提取得到，所述黄芪葡聚糖主要由葡萄糖结构单元和半乳糖结构单元组成，以α-(1→4)葡萄糖苷键连接方式为主；所述葡萄糖结构单元摩尔比含量占95％以上。
多糖属于生物大分子化合物，不同提取方法所得到的多糖的结构以及组成会有很大的差异。根据以往报道，所得黄芪多糖的基本单糖组成主要以葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖为主，且含有一定甘露糖和木糖，属于杂多糖。
本发明提供的黄芪葡聚糖，主要在单糖组成方面与已知黄芪多糖明显不同；本发明所述黄芪葡聚糖主要由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖含量占95％以上。并且，所述黄芪葡聚糖的结构中以α-(1→4)葡萄糖苷键连接方式为主。
在本发明的实施例中，所述黄芪葡聚糖的分子量分布与已知黄芪多糖也明显不同；本发明实施例所述黄芪葡聚糖的分子量范围为10～300kDa，其中分子量32kDa的组分含量占90％以上。
本发明实施例提供一种如前所述的黄芪葡聚糖的提取方法，包括以下步骤：
S1、将黄芪粉末用水提取，经分离，收集液相；
S2、将所述液相浓缩后与乙醇混合，经分离，得到固相；
S3、将所述固相用水复溶后冻干，再利用强阴离子交换色谱柱进行分离纯化，得到黄芪葡聚糖。
本发明实施例首先提供黄芪粉末：以黄芪药材为原料，依次经过干燥、粉碎和过筛，得到黄芪粗粉。中药材的不同的种植地域、采收季节和加工贮藏方式等，一定程度上会对中药材的药效成分产生影响。作为优选，本发明采用产自甘肃的黄芪药材。本发明实施例可将黄芪药材烘干，然后粉碎、过筛，得到呈60～80目颗粒的黄芪粉末。
本发明实施例称取一定量的黄芪粉末置于容器中，按料液比加入水(通常采用蒸馏水)，优选搅拌提取。为保证提取效率，本发明一般提取2次。具体地，待初次提取的物料稍微冷却，本发明实施例通过过滤等分离方式，收集上清液，同时将得到的滤渣用水再次提取，过滤，收集并合并两次的上清液，得到液相。
在本发明的具体实施例中，所述料液比可为1g：(15～20)mL。所述搅拌提取的温度优选为75～85℃，更优选为80℃；所述搅拌提取的时间优选为1h～5h，更优选为2～3h。此外，所述过滤可采用纱绢进行。
本发明实施例可将合并后的上清液浓缩后加入乙醇，其中优选旋蒸浓缩，乙醇加入后浓度为75～85％，优选为80％；经分离，得到固相。本发明实施例通过上述醇沉过程，优选离心去除上清，收集得到固相(沉淀)。
本发明实施例将所述固相用水复溶后冻干；本发明对所述冻干的工艺条件没有特殊限制，所述冻干得到的粗多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。
本发明实施例取冻干后粗多糖，利用强阴离子交换(QFF)色谱柱进行分离纯化，得到黄芪葡聚糖。
其中，所述强阴离子交换色谱柱的填料为Sepharose系列树脂，具体为QSepharose Fast Flow。Sepharose系列树脂是应用最广泛的离子交换介质，具有刚性好、容量大、非特异性作用低、对碱稳定等特征，易于放大。
本发明利用QFF分离纯化粗多糖的方法具体如下：取所述冻干后的粗多糖，用水溶解后，离心，取上清上样；选择0M、0.2M、0.4M的氯化钠溶液，进行梯度洗脱，流速5mL/min，每个梯度可洗脱600mL(2.4个柱体积)，用收集器收集洗脱组分。本发明实施例对所收集的样品进行硫酸苯酚检测，并绘制吸光度曲线，其中，0M氯化钠洗脱组分为纯化黄芪葡聚糖，经浓缩冻干，即为本发明所述的黄芪葡聚糖。
本发明实施例所述的提取方法不同于以往的辅助酶降解、螺旋输送提取等方法，本发明得到的是黄芪粗多糖经过QFF纯化的精致多糖，其组成和分子量与以往报道的黄芪多糖有显著差别。具体地，所述黄芪葡聚糖经HPLC分子量测定，重均分子量范围为10-300kDa，其中分子量32kDa的组分含量占90％以上。采用HPLC柱前衍生法测定所述黄芪葡聚糖主要含有葡萄糖和半乳糖，其中葡萄糖摩尔比含量为95％以上。利用核磁共振氢谱、碳谱及HSQC二维谱测定，所述黄芪葡聚糖以α-(1→4)葡萄糖苷键连接方式为主。
本发明所述黄芪葡聚糖为用于皮肤免疫延衰的功效物质，其对UVA引起的HacaT细胞损伤有明显保护作用，可对细胞产生有效的抗紫外损伤的效果，能够有效延缓衰老。并且，本发明所述黄芪葡聚糖可以对UVA引起的HSF细胞炎症及过敏有明显的调节作用。
本发明提供如前所述的黄芪葡聚糖在制备预防和/或治疗UVA引起的皮肤细胞损伤的产品的应用。
UVA波段是紫外线波长划分的一部分，波长320～420nm，又称为长波黑斑效应紫外线。UVA有很强的穿透力，可以直达肌肤的真皮层，破坏弹性纤维和胶原蛋白纤维，将皮肤晒黑。在本发明的一些实施例中，所述UVA引起的皮肤细胞损伤为UVA引起的HacaT细胞损伤。在本发明的另一些实施例中，所述UVA引起的皮肤细胞损伤为HSF细胞炎症过敏。具体地，本发明实施例中UVA照射可为15～30J/cm2。本发明所述黄芪葡聚糖可用于制备预防和/或治疗UVA引起的皮肤细胞损伤的产品，例如药物、护肤产品等，为皮肤炎症病人、光敏性皮肤病或皮肤亚健康等人提供了预防或者治疗的方案。
一方面，所述黄芪葡聚糖可显著提高UVA诱导的皮肤角质HacaT细胞存活能力；和/或，所述黄芪葡聚糖具有显著改善由UVA引起的HacaT细胞线粒体膜电位下降的能力；和/或，所述黄芪葡聚糖能显著降低由UVA引起的HacaT细胞内活性氧含量；和/或，所述黄芪葡聚糖能显著提高UVA诱导的HacaT细胞内线粒体复合物I、II的活性；和/或，所述黄芪葡聚糖能显著提高UVA诱导的HacaT细胞的内sirt1蛋白表达量。
另一方面，所述黄芪葡聚糖能显著降低由UVA引起的皮肤成纤维HSF细胞内诱导型NO的含量；和/或，所述黄芪葡聚糖能显著降低UVA诱导的HSF细胞内COX-2酶活力。
在本发明实施例中，所述黄芪葡聚糖具有上述的一种或多种功效。本发明所述黄芪葡聚糖可对皮肤细胞产生有效的抗紫外损伤的效果，有利皮肤健康，能延缓衰老。而且多糖是黄芪的主要功效成分，来源属于纯天然，无副作用，可开发成免疫调节、抗衰老、抗紫外损伤的产品，具有良好的市场应用前途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例单糖标准品与黄芪粗多糖的HPLC图；
图2是本发明实施例所述黄芪粗多糖的QFF分离纯化图；
图3是本发明实施例所述黄芪葡聚糖的分子量分析图；
图4是本发明实施例所述黄芪葡聚糖的核磁共振氢谱图；
图5是本发明实施例所述黄芪葡聚糖的核磁共振碳谱图；
图6是本发明实施例所述黄芪葡聚糖的核磁共振HSQC二维谱图；
图7是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内sirt1蛋白表达量的影响的实验结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的黄芪葡聚糖及其提取方法与应用进行具体地描述。
以下实施例中，HacaT细胞和HSF细胞源自ATCC。
实施例1、黄芪葡聚糖的制备及分析
黄芪葡聚糖的制备方法如下：取黄芪药材(产自甘肃)，经烘干后粉碎、过筛，得到60目颗粒的黄芪粗粉；称取100g所述黄芪粗粉，按1:20料液比，加入2L的蒸馏水，在5L容器内搅拌，80℃搅拌提取3h。待稍微冷却，用纱绢过滤，收集上清液。按1:15料液比，向去掉上清的沉淀中，加入1.5L的蒸馏水，80℃搅拌提取3h，再用纱绢过滤，合并两次上清液。旋蒸浓缩至1L左右，加入乙醇并使乙醇终浓度为80％，进行醇沉，离心收集沉淀，将沉淀用水复溶后冻干。
取冻干后粗多糖，进行分析测试，并利用强阴离子交换(QFF)色谱柱(填料：QSepharose Fast Flow)进行分离纯化，具体方法如下：取300mg所述粗多糖，用10mL双蒸水溶解，离心，取上清上样。选择0M、0.2M、0.4M的氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱液的流速为5mL/min。每个梯度洗脱600mL(2.4个柱体积)，用收集器收集，每管收集10mL。对收集的样品进行硫酸苯酚检测，绘制吸光度曲线。其中，QFF纯化前的冻干品粗多糖单糖组成情况参见图1。如图1所示，黄芪粗多糖在纯化前主要包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。QFF纯化后，0MNaCl洗脱组分的为纯化后黄芪葡聚糖，葡萄糖摩尔比含量为95％以上，0.2M和0.4M NaCl洗脱组分为杂多糖，主要包含阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖。
所述黄芪粗多糖经QFF纯化后，获得3个组分。其中，0M NaCl洗脱组分为AP0，产率为48.3％，其他2个组分AP 2得率为10％，AP 4得率为5.7％，因此AP 0为主要组分。另外，经QFF柱分离后，利用硫酸苯酚显色的方法，经吸光度检测后，表明第13到23管有糖类物质，因此，收集0M NaCl洗脱组分即为本发明的黄芪葡聚糖。
图2是本发明实施例所述黄芪粗多糖的QFF分离纯化图；由图2可知，0M氯化钠洗脱组分为纯化黄芪葡聚糖，经浓缩冻干，即为本发明所述的黄芪葡聚糖。
所述黄芪葡聚糖经HPLC分子量测定(图3)，重均分子量范围为10-300kDa，其中32kDa为主要多糖组分，含量在90％以上。HPLC柱前衍生法测定所述黄芪葡聚糖主要含有葡萄糖和半乳糖，其中葡萄糖摩尔比含量为95％以上。利用核磁共振氢谱、碳谱及HSQC二维谱测定，结果参见图4-6，黄芪葡聚糖以α-(1→4)葡萄糖苷键连接方式为主。
实施例2、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞存活率的影响
(1)细胞培养：将HacaT细胞接种于MEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔8000个上述细胞种植于96孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育12小时，然后加入不同浓度的黄芪葡聚糖(实施例1制得，以下实施例相同；溶剂均为双蒸水)，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后给予30J/cm2UVA照射，更换培养基，放入恒温细胞培养箱里继续孵育12小时，然后每孔加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，培养箱里继续孵育4小时。之后除去液体，每孔加入DMSO溶液150μL，混匀后放入37℃培养箱，20分钟后，酶标仪A540nm处测量吸光值。每次三个平行，实验重复三次。计算公式：细胞存活率(Cellviability)＝实验组吸光值/对照组吸光值。
(3)表1是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞存活率的影响的实验结果；如表1所示，药物孵育结束后给予30J/cm2UVA照射，模型组(UVA损伤模型，黄芪葡聚糖添加量为0，以下实施例相同)和对照组(无UVA损伤，以下实施例相同)存在显著性差异，UVA损伤模型构建成功。
以黄芪葡聚糖加入浓度为给药浓度，当给药浓度为50μg/mL时，细胞存活率开始上升，并且随着浓度的增加细胞存活率逐渐上升，说明其存在量效关系。从100-200μg/mL剂量开始，再增加药物浓度其保护效果并没有呈现明显差异，表明100-200μg/mL是药物发挥活性的优化浓度，即为达到最佳保护效果的最低浓度。同时，高浓度下药物并没有对细胞有任何毒性，表明药物安全无毒，而且能显著的提高UVA诱导的HaCaT角质细胞存活率。
表1所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞存活率的影响
Figure BDA0002351700150000071
实施例3、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞线粒体膜电位的影响
(1)细胞培养：将HacaT细胞接种于MEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔8000个上述细胞种植于96孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育24小时，然后加入不同浓度的黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后给予30J/cm2UVA照射建立模型，更换培养基，放入恒温细胞培养箱里继续孵育12小时后，除去培养基，用PBS溶液清洗一次，加入150μL染色工作液，充分混匀，细胞培养箱里孵育40min。孵育结束后，吸除液体，用100μL JC-1(1X)染色缓冲液冲洗两次，每孔加入150μL培养基，用酶标仪进行检测。检测波长为(488/585和488/535)，结果为红绿色荧光的比值。
(3)表2是本发明纯化前和纯化后黄芪葡聚糖功效比较的实验结果；表3是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞线粒体膜电位的影响的实验结果。由表2和表3可见，孵育结束后给予30J/cm2UVA照射建立模型，模型组与对照组存在显著性差异；通过比较纯化前后黄芪葡聚糖的活性发现，纯化后的样品增加线粒体膜点位的功能明显增强。同时，不同浓度的给药组与模型组存在显著差异，与对照组相比无显著性差异，并且随着浓度的增加线粒体的膜电位逐渐上升，说明其存在一定的量效关系。
表2本发明纯化前后黄芪葡聚糖对线粒体膜电位的影响
组别(μg/mL) 线粒体膜电位
对照 0.94±0.09<sup>**</sup>
模型 0.47±0.08
纯化前黄芪粗多糖100 0.72±0.12<sup>*</sup>
纯化后黄芪葡聚糖100 0.84±0.09<sup>**</sup>
表3所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞线粒体膜电位的影响
组别(μg/mL) 线粒体膜电位
对照 0.83±0.16<sup>**</sup>
模型 0.45±0.12
50 0.66±0.02
100 0.79±0.13<sup>*</sup>
200 1.05±0.06<sup>#</sup>
实施例4、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内活性氧含量的影响
(1)细胞培养：将HacaT细胞接种于MEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔8000个上述细胞种植于96孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育12小时，然后加入不同浓度的黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后给予30J/cm2UVA照射，更换培养基，放入恒温细胞培养箱里继续孵育12小时后，每孔加入200μLDCFH-DA(10μmol/L)培养箱里继续孵育20分钟，除去液体，用无血清MEM培养液洗涤三次。洗涤完毕后，每孔加入150μL无血清MEM培养液,用酶标仪进行检测，检测波长为(488/525)。每次三个平行，实验重复三次。
(3)表4为本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内活性氧含量的影响的实验结果；如表4所示，模型组与对照组存在显著性差异，不同浓度的给药组与模型组存在显著差异，与对照组相比无显著性差异，并且随着浓度的增加细胞活性氧含量下降，当给药浓度为200μg/mL时达到最低值。
表4所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内活性氧含量的影响
组别(μg/mL) 活性氧含量
对照 11865.43±3402.99<sup>#</sup>
模型 103663.77±5116.1
50 17741.91±7795.15<sup>#</sup>
100 13567.23±1267.2<sup>#</sup>
200 11590.5±975.2<sup>#</sup>
实施例5、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内线粒体复合物I活性的影响
(1)细胞培养：将HacaT细胞接种于MEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔50万个上述细胞种植于6孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育12小时，然后加入200μL(200μg/mL)黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后给予30J/cm2UVA照射，更换培养基，放入恒温细胞培养箱里继续孵育12小时，收集细胞，加入1mL线粒体复合物I提取液，用冰浴匀浆器匀浆，将匀浆600g，4℃离心5min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。弃上清，往沉淀中加入500μL提取液，超声波破碎(冰浴，功率200W，超声3s，间隔10秒，重复30次)，用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定体系：样本(10μL)+试剂一(154μL)+工作液(20μL)+试剂四(16μL)，将上述试剂分别加入96孔板中迅速吹打均匀，用酶标仪测定吸光值，记录第10s的吸光值为A1；迅速将96孔板连同反应液放入37℃恒温箱中准确反应2min，记录2min时的吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2。
复合物I活力单位的计算：单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。复合物I活力(U/mg prot)＝1608*ΔA/Cpr(Cpr:样本蛋白浓度，mg/mL)。
(3)表5是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内线粒体复合物I活性的影响的实验结果；如表5所示，模型组与对照组存在显著性差异，黄芪葡聚糖(200μg/mL)使线粒体复合物I的活性相较于模型组有了显著的上升。
表5所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内线粒体复合物I活性的影响
组别 复合物I活性
对照 99.67±0.74<sup>#</sup>
模型 33.19±9.74
200μg/mL 65.84±15.66<sup>**</sup>
200μg/mL(正常细胞) 102.00±4.98<sup>**</sup>
实施例6、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内线粒体复合物II活性的影响
(1)细胞培养：将HacaT细胞接种于MEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔50万个上述细胞种植于6孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育12小时，然后加入200μL(200μg/mL)黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48h。孵育结束后给予30J/cm2UVA照射，更换培养基，放入恒温细胞培养箱里继续孵育12小时，收集细胞，加入1mL线粒体复合物II提取液，用冰浴匀浆器匀浆，将匀浆600g，4℃离心5min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。弃上清，往沉淀中加入500μL提取液，超声波破碎(冰浴，功率200W，超声3s，间隔10秒，重复30次)，用于复合体II酶活性测定。
测定体系：样本(10μL)+试剂一(154μL)+工作液(20μL)+试剂四(16μL)，将上述试剂分别加入96孔板中迅速吹打均匀，用酶标仪测定吸光值，记录第10s的吸光值为A1；迅速将96孔板连同反应液放入37℃恒温箱中准确反应2min，记录2min时的吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2。
复合物II活力单位的计算：单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。复合物I活力(U/mg prot)＝476.2*ΔA/Cpr(Cpr:样本蛋白浓度，mg/mL)。
(3)表6是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内线粒体复合物II活性的影响的实验结果；如表6所示，模型组与对照组存在显著性差异，给药组与模型组存在显著差异，与对照组相比无显著性差异，黄芪葡聚糖(200μg/mL)使线粒体复合物II的活性相较于模型组有了显著上升。
表6所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内线粒体复合物II活性的影响
组别 复合物II活性
对照 99.33±0.94<sup>**</sup>
模型 39.94±8.33
200μg/mL 84.86±11.91<sup>*</sup>
200μg/mL(正常细胞) 114±17.54<sup>***</sup>
实施例7、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内sirt1蛋白表达量的影响
(1)细胞培养：将HacaT细胞接种于MEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔50万个上述细胞种植于六孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育12小时，然后加入200μL(200μg/mL)黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后给予30J/cm2UVA照射，更换培养基，放入恒温细胞培养箱里继续孵育12小时，弃除培养基，加入预冷的PBS溶液清洗三次，将六孔板放于冰上，每孔加入200μL细胞裂解液，充分裂解10min，收集裂解液放入1.5mL EP管中，12000rmp，4℃离心10min。取上清液，用BCA试剂盒定量，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白，冷却到室温，然后把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
待电泳结束后，转膜，将PVDF膜放入4℃孵育一抗12h，取出PVDF膜放置于1X TBST溶液中于摇床上清洗6次，每次10min，室温孵育1h，取出PVDF膜放置于1X TBST溶液中于摇床上清洗六次，每次10min，将200μL发光液均匀滴加到PVDF膜上，暗室显色5min，放在凝胶显色仪器上显色，获取图像。sirt1活性＝模型组(对照组)灰度积分值/对照组灰度积分值。
(3)表7和图7是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内sirt1蛋白表达量的影响的实验结果；如表7所示，模型组与对照组相比较，模型组sirt1蛋白表达量明显降低，此现象揭示经过30J/cm2UVA照射后，Hacat细胞内sirt1蛋白表达量发生显著变化，模型组细胞加入黄芪葡聚糖可以使HacaT细胞内sirt1蛋白表达量上升，相反对照组细胞加入黄芪葡聚糖后，细胞内sirt1蛋白表达量无显著性变化，这表明黄芪葡聚糖可有效避免紫外损伤诱发的皮肤衰老。
表7所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HaCaT角质细胞内sirt1蛋白表达量的影响
组别 SIRT1活性
对照 0.98±0.01<sup>***</sup>
模型 0.6±0.06
200μg/mL 1.19±0.07<sup>#</sup>
200μg/mL(正常细胞) 0.9±0.01<sup>***</sup>
综合以上指标，应用本发明所述的提取分离的方法制备的黄芪葡聚糖，对UVA引起的HacaT细胞损伤有保护作用，对细胞产生有效的抗紫外损伤的效果，从而达到延缓衰老的效果。
实施例8、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HSF角质细胞内NO含量的影响
(1)细胞培养：将HSF细胞接种于DMEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔8000个上述细胞种植于96孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育24小时，然后加入200μg/mL纯化的黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后经过15J/cm2能量UVA(单位：J/cm2)照射，然后放入恒温细胞培养箱里12小时，每孔加入200μLPBS溶液，清洗两遍。每孔加入200μL DAF-FM DA溶液，培养箱里继续孵育20分钟，除去液体，每孔加入无酚红的MEM培养基溶液150mL，清洗两遍，最后用酶标仪检测荧光值，检测波长(495/515)，实验重复三次。
计算公式：NO(Fluorescence per mg protein)＝荧光值/细胞存活率。
(3)表8是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HSF角质细胞内诱导型NO含量的影响的实验结果；如表8所示，不同浓度的给药组与模型组存在显著差异，当UVA照射的能量为15J/cm2时，与对照组存在显著性差异。当黄芪葡聚糖浓度为200μg/mL时，细胞内NO含量与模型组有显著性差异，且细胞内NO含量最低。
表8所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HSF角质细胞内诱导型NO含量的影响
组别(μg/mL) NO含量
对照 49954±628.89<sup>***</sup>
模型 80147.91±8015.29
50 50209.25±10695.41<sup>#</sup>
100 45547.44±10184.54<sup>#</sup>
200 39613.48±8722.51<sup>#</sup>
实施例9、黄芪葡聚糖对UVA诱导的HSF角质细胞内COX-2酶活力的影响
(1)细胞培养：将HSF细胞接种于DMEM完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)将每孔50万个上述细胞种植于6孔板里，放入恒温细胞培养箱里孵育24小时，然后加入200μg/mL纯化的黄芪葡聚糖，放入恒温细胞培养箱里孵育48小时。孵育结束后经过15J/cm2能量UVA(单位：J/cm2)照射，然后放入恒温细胞培养箱里12小时，每孔加入200μLPBS溶液，清洗两遍。每孔加入350μL细胞裂解液，冰上裂解20分钟，收集裂解液，于13000rpm，4℃离心5分钟，收集上清。最后，取20μL提取蛋白，加入底物和辅助因子在37℃孵育10分钟，然后用酶标仪检测荧光值，检测波长(565/590)，实验重复三次。计算公式：COX-2酶活力＝实验组荧光值/100％酶活组荧光值。
(3)表9是本发明所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HSF角质细胞内COX-2酶活力的影响的实验结果(注：本发明全部实施例中，n＝9,x±SD，与模型组相比，N表示无显著性差异，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，#代表****P<0.0001)。如表9所示，对照组和模型组cox-2活力存在显著性差异，由表可知，200mg/mL的黄芪葡聚糖可以使HSF细胞内的cox-2酶活显著降低。正常组细胞给予相同量的多糖，从表中可知与对照组无显著性差异。
表9所述黄芪葡聚糖对UVA诱导的HSF角质细胞内COX-2酶活力的影响的实验结果
组别 COX-2活性
对照 0.82±0.04<sup>***</sup>
模型 1.06±0.02
200μg/mL 0.75±0.02<sup>***</sup>
200μg/mL(正常细胞) 0.91±0.07<sup>**</sup>
综合以上指标，应用本发明所述的提取分离的方法制备的黄芪葡聚糖，对UVA引起的HSF细胞炎症过敏有明显的调节作用，具有免疫抗炎的作用。
经上述实验表明，本发明所述黄芪葡聚糖对于皮肤具有良好的延缓衰老，免疫抗炎的作用，可应用于皮肤免疫调节和延缓衰老的用途。所述黄芪葡聚糖与药物学或护肤产品可接受辅料混合，可形成各种形式的散剂、膏剂、粉剂、片剂、针剂、水剂或注射剂。本发明为皮肤炎症病人、光敏性皮肤病或皮肤亚健康等人提供了预防或者治疗的方案；在使用时可采取口服、皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生理盐水、葡萄糖、稳定剂、悬浮剂或乳化剂等。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。

Claims (4)

1.一种黄芪葡聚糖在制备预防和/或治疗UVA引起的皮肤细胞损伤的产品的应用；所述黄芪葡聚糖的提取方法包括以下步骤：
S1、以产自甘肃的黄芪为原料，将黄芪粉末按料液比加水，搅拌提取，所述搅拌提取的温度为75~85℃，过滤，收集上清液，并得到滤渣；
将所述滤渣用水提取，过滤，收集并合并两次的上清液，得到液相；
S2、将所述液相浓缩后与乙醇混合，乙醇加入后浓度为75~85%，经分离，得到固相；
S3、将所述固相用水复溶后冻干，所述冻干得到的粗多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，再利用强阴离子交换色谱柱进行分离纯化，得到黄芪葡聚糖；所述强阴离子交换色谱柱的填料为Sepharose系列树脂，采用氯化钠溶液进行梯度洗脱，0 M氯化钠洗脱组分为黄芪葡聚糖，且所含葡萄糖的相对摩尔比达95%以上；
所述黄芪葡聚糖的分子量范围为10~300 kDa，其中分子量32kDa的组分含量占90%以上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤S1中，所述黄芪粉末由黄芪药材依次经过干燥、粉碎和过筛得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤细胞损伤为HacaT细胞损伤或HSF细胞炎症过敏。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄芪葡聚糖具有以下至少一种功效：
提高UVA诱导的HacaT细胞存活能力；
改善由UVA引起的HacaT细胞线粒体膜电位下降的能力；
降低由UVA引起的HacaT细胞内活性氧含量；
提高UVA诱导的HacaT细胞内线粒体复合物I和/或II的活性；
提高UVA诱导的HacaT细胞的内sirt1蛋白表达量；
降低由UVA引起的HSF细胞内诱导型NO的含量；
降低UVA诱导的HSF细胞内COX-2酶活力。
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