CN1057530C - 核酸快速抽提方法 - Google Patents
核酸快速抽提方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1057530C CN1057530C CN98110654A CN98110654A CN1057530C CN 1057530 C CN1057530 C CN 1057530C CN 98110654 A CN98110654 A CN 98110654A CN 98110654 A CN98110654 A CN 98110654A CN 1057530 C CN1057530 C CN 1057530C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- ethanol
- pcr
- water
- diethylpyrocarbonate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明是一种快速核酸抽提方法。现有技术中用强力变性剂溶解蛋白质，再采用硅藻、玻璃粉吸附和解吸附等方法提取核酸，但是操作繁琐，多次离心等不足，经常易导致实验失败。本发明研制了一种乙醇、焦碳酸二乙酯混合溶液，与一定比例的待测标本混合，经反应、浓缩、离心后，即可得用于PCR或RI-PCR的核酸溶液，方法简单、可靠，不仅提高了标本的检测稳定性，也大大提高了检测效率。
Description
本发明属分子生物学和医学检测领域，是采用较为简便可靠的方法抽取临床标本DNA、RNA，再采用DNA聚合酶链反应(PCR)或逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对其进行检测。
一般情况下DNA、RNA的提取主要是采用强力变性剂如盐酸胍或异硫氰胍或尿素-氯化锂等来溶解蛋白质，从而破坏细胞、病毒，并使核蛋白从核酸上解离下来，并灭活可能存在的RNA酶。在此基础上可采用硅藻、玻璃粉吸附和解吸附或有机溶剂抽提、乙醇(异丙醇)沉淀法提取核酸。这一方法是目前从事RT-PCR的临床实验室常规应用的方法。
有机溶剂法的原理是强力变性剂与硫基乙醇联合作用溶解蛋白灭活RNA酶，再加入乙酸钠、饱和酚、氯仿-异戊醇抽取以变性蛋白，经高速离心后得到上清，再以乙醇或异丙醇沉淀浓缩核酸再以75％乙醇洗涤沉淀和容器去除残余盐份，再经烘干去除残余乙醇，从而得到纯净的核酸。从以上实验过程我们可以看到其优点在与能有效去除蛋白，排除一些溶于有机溶剂的干扰反应的物质，而且可以有效地浓缩核酸，但是其缺点也非常明显，首先是操作非常繁琐，有机溶剂抽提后取上清的过程必须小心谨慎，通常的小体积操作时很容易吸到或碰到导致实验失败的界面处的蛋白及有机溶剂；为了浓缩核酸，往往要加入一定量的助沉淀剂，有时会造成或大或小的影响；乙醇的洗涤过程仍属小心操作，以免沉淀的丢失；整个过程中至少需要三次较长时间的离心。
硅藻、玻璃粉吸附的原理是高盐的强力变性剂作用下溶解蛋白、灭活RNA酶，核酸与同步加入的硅藻或玻璃粉吸附，经离心后小心吸尽上清，再以高盐的强力变性剂溶液洗涤，经离心后小心吸尽上清，再以乙醇、丙酮等有机溶剂洗涤，经离心后小心吸尽上清，烘干后即得吸附的核酸样品，加入低盐的反应体系即可使核酸解吸附进入反应液。这一方法的优点在于所有的离心步骤都是一分钟以内的短时间，从而大大提高了实验速度；不用酚氯仿的有机溶剂处理，从而避免了导致实验失败的一个重要影响因素。但这一方法仍有较大的缺点；其仍然需要离心步骤；上清的吸取必须彻底，否则可能导致实验失败，所以对操作的要求较高；由于吸附物质性质较为疏松，吸尽上清时很容易吸走吸附物质而导致实验失败，因此有时需要反复操作；核酸浓度太低时，解吸附的比率较低，所以有时仍需加入tRNA等辅助核酸，以提高目标核酸的得率，有时会造成或大或小的影响。
上述两种方法最大的缺点在于其需要多次离心，它极大地限制了单位时间内可处理的样品数，而某些步骤需要的精心操作，不仅限制了单位时间内可处理的样品数，增大了操作人员的劳动强度，而且使得实验的稳定性受到威胁。
RNA抽提的方法还有采用去污剂与蛋白酶联合作用标本后，经有机溶剂抽提，乙醇或异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤最后得到纯净的核酸。该方法不仅有与强力变性剂方法同样的缺点，比如多次离心，操作精度要求较高；有时需加助沉淀剂；操作失败而导致假阴性的可能性较高等等；而且该方法RNA的得率较低，因为有可能标本中的RNA酶在被蛋白酶消化或抑制前有时间发挥作用。
RNA抽提的简便方法还有去污剂与蛋白酶联合作用标本或仅用去污剂作用标本，然后直接经100℃水浴煮沸后离心取上清作为核酸制备物。但这一简便方法实际使用中发现其RNA酶不完全失活而稳定性不高。
本发明的目的是研制一种试剂，用于核酸的抽提，从而取得提高检测稳定性和提高检测效率的良好效果。
本发明研制出一种混合试剂，它们是50-90％浓度的乙醇和1-10％(V/V)焦碳酸二乙酯(DEPC)的混合液。该混合液以(0.8-1.2)∶(8-12)比例与血清或血浆或其它标本混合均匀，再经25-40℃水浴1-12分钟后，在沸水浴中置放5-20分钟，再打开试管盖置于55-70℃水浴10-30分钟即可发挥掉乙醇与DEPC及水份，目的是适当浓缩样品，最后经12000-16000转/分高速离心，一般5-15分钟即可，所得上清即可用于PCR或RT-PCR的核酸溶液。
上述混合液中，乙醇更为合适的浓度是70-85％(V/V)，DEPC更为合适的浓度是5-9％(V/V)。
应用该种溶液进行样品处理，可有效抑制临床标本中所含RNA酶，其核酸溶液的质量应用于RT-PCR扩增的效果不差于强烈变性剂处理-有机溶剂抽提-乙醇沉淀法所得的核酸，甚至PCR检测的灵敏度更高，从而使弱酸阳性的标本检出率稳定更高。利用该方法进行样品处理，操作的均一性较好，从而提高了实验的稳定性，使由于操作引起的假阴性率大大降低。该方法中离心只需一次，从而使单位时间内样品处理数得以提高，为大批标本的处理提供了可能性，该方法中不引入tRNA等辅助核酸，从而避免了对实验潜在的影响。该方法的操作时间比常规处理的方法大大缩短，使得实验结果能更早得到，进一步体现出PCR的优越性。该方法同样适用DNA的抽提，从而仅进行一次处理，可同时进行DNA及RNA的检测，为多种并发的病例的诊断提供了方便。
实施例1：一、核酸制备：
配制90％乙醇、10％DEPC溶液，取5μl临床标本的50μl血清或血浆中，混合均匀，置37℃水浴10分钟，然后转入100℃沸水浴20分钟，打开离心管盖后置68℃水浴20分钟后以15000转/分离心15分钟，上清液即为核酸溶液。二、反应液配方：10×逆转录缓冲液：Tris.cl 250mM pH8.20
(NH4)2SO4 200mM
明胶 1mg/ml10×逆转录底物：HCV逆转录引物质：5μM
dATP dTTP dGTP dCTP 各2mM
二硫苏糖醇DTT 10mM
Mncl2 20mM耐热逆转录酶为复旦大学遗传所自己研制的FDTRT。5×PCR缓冲液：Tris.cl 125mM pH8.20
Kcl 250mM
明胶0.5mg/ml
Mgcl2 10mM
Formamide 25％10×PCR底物：HCV扩增引物P3、P4各5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
EGTA 6mM耐热DNA聚合酶为复旦大学遗传所自己研制的Taq DNAPolymerase。引物P2、P3、P4由Applied Biosgstems公司的381A型DNA合成仪合成PAGE纯化，其核苷酸顺序如下：P2 5′-d(GGTGCACGGTCTACGAGACCT)-3′P3 5′-d(CTGTGAGGAACTACTGTCTTTC)-3′P4 5′-d(CCCTATCAGGCAGTACCACAA)-3′三、反应过程
1、按下列顺序配制反应系统：加入灭菌的DEPC处理重蒸水14μl至离心管，再加入2μl 10×逆转录缓冲液，2μl 10×逆转录底物，耐热逆转录酶4u，2μl制备的核酸溶液，混合均匀后离心片刻，加入液体石蜡30μl。
2、置65℃～68℃水浴3～20分钟后100℃沸水浴5分钟备用。
3、按下述顺序配制反应系统：加入灭菌重蒸水12μl至离心管，再加入4μl 5×PCR缓冲液2μl 10×PCR底物，耐热DNA聚合酶1u，2μl上述沸水浴后的下层水相中的逆转录产物混合均匀后离心片刻，加入液体石蜡30μl。
4、置91～94℃30秒。
5、按下述条件进行30～40次循环：
91℃～94℃ 20～30秒
55℃ 20～30秒
70℃～75℃ 20～30秒
6、循环后置70～75℃ 0～5分钟。四、产物检测：
样品取下层水相101μl加2μl 50％蔗糖、溴酚蓝溶液，2％Agarose TAE电泳缓冲液电泳。五、结果及讨论：
经扩增后有257bpDNA片段为HCV阳性标本，无257 bpDNA片段者为HCV阴性标本。
本实验结果说明利用“快速核酸抽提液”获得的核酸溶液。可以有效地应用于RT-PCR检测RNA样品。实施例2：一、核酸制备：
配制70％乙醇、5％DEPC溶液，取5μl加入临床标本的50μl血清或血浆中，混合均匀，置30℃水浴1分钟，然后转入100℃沸水浴5分钟，打开离心管盖后置60℃水浴10分钟后13000转/分离心5分钟，上清液即为核酸溶液。二、反应配方：10×逆转录缓冲液：Tris.cl 250mM pH8.20
(NH4)2SO4 200mM
明胶 1mg/ml10×逆转录底物：HCV逆转录引物质：5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
DTT 10mM
Mncl2 20mM耐热逆转录酶为复旦大学遗传所自己研制的FD TRT。5×PCR缓冲液：Tris.cl 125mM pH8.20
Kcl 250mM
明胶0.5mg/ml
Mgcl2 10mM
Formamide 25％10×PCR底物：HCV扩增引物P3、P4各5μM
HBV扩增引物P5、P6各5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
EGTA 6mM耐热DNA聚合酶为复旦大学遗传所自己研制的Taq DNAPolymerase。引物P5 P6由Applied Biosgstems公司的381A型DNA合成仪合成PAGE纯化，其核苷酸顺序如下：P5 5′ -d(CTCGGATCCTTGTGACTTCTTTCCTT)-3′P6 5′ -d(CGGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCT)-3′三、反应过程：
1、按下述顺序配制反应系统：加入灭菌的DEPC处理重蒸水14μl至离心管，再加入2μl 10×逆转录缓冲液，2μl 10×逆转录底物，耐热逆转录酶4u，2μl制备的核酸溶液，混合均匀后离心片刻，加入液体石蜡30μl。
2、置65℃～68℃水浴3～20分钟后100℃沸水浴5分钟备用。
3、按下述顺序配制反应系统：加入灭菌重蒸水12μl至离心管，再加入4μl 5×PCR缓冲液，2μl 10×PCR底物，耐热DNA聚合酶1u，2μl上述沸水浴后的下层水相中的逆转录产物，混合均匀后离心片刻，加入液体石蜡30μl。
4、置91℃～94℃ 30秒
5、按下述条件进行30～40次循环：
91℃～94℃ 20～30秒
55℃ 20～30秒
70℃～75℃ 20～30秒
6、循环后置70℃～75℃ 0～5分钟四、产物检测
样品取下层水相10μl加2μl 50％蔗糖溴酚蓝溶液2％Agarose TAE电泳缓冲液电泳五、结果及讨论
经扩增后有257bp 441bp两条DNA片段者为HBV HCV皆阳性标本，仅有257bp DNA片段者为HBV阴性，HCV阳性标本，仅有441bp DNA片段者为HBV阳性HCV阴性标本，无257bp 441bpDNA片段者为HBV、HCV皆阴性标本。
本实验说明利用“快速核酸抽提液”获得的核酸溶液，可以有效地应用于RT-PCR或PCR同时检测DNA及RNA样品。
Claims (2)
1、一种核酸快速抽提方法，其特性在于用乙醇和焦碳酸二乙酯混合溶液以一定比例与血清或血浆均匀混合，经水浴反应，浓缩样品，离心后，抽提完毕，上述过程具体条件如下：
(1)混合溶液中乙醇浓度是50-90％(V/V)，焦碳酸二乙酯浓度是1-10％(V/V)；
(2)上述混合液以(0.8-1.2)：(8-12)比例与血清或血浆均匀混合；
(3)与血清或血浆混合后的溶液在25-40℃水浴下反应1-12分钟，再在沸水浴中置5-20分钟；
(4)在55-70℃水浴中挥发乙醇、焦碳酸二乙酯和水份，用以浓缩样品；
(5)高速离心，得上清液。
2、根据权利要求1所述的核酸快速抽提方法，其特性在于混合液中乙醇和焦碳酸二乙酯的浓度分别是70-85％(V/V)，5-9％(V/V)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN98110654A CN1057530C (zh) | 1998-02-12 | 1998-02-12 | 核酸快速抽提方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN98110654A CN1057530C (zh) | 1998-02-12 | 1998-02-12 | 核酸快速抽提方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1189501A CN1189501A (zh) | 1998-08-05 |
| CN1057530C true CN1057530C (zh) | 2000-10-18 |
Family
ID=5220681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN98110654A Expired - Fee Related CN1057530C (zh) | 1998-02-12 | 1998-02-12 | 核酸快速抽提方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1057530C (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3562576B1 (en) * | 2016-12-29 | 2023-09-06 | Intus Biosciences, LLC | Combined lysis protocol for comprehensive cell lysis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1093711A (zh) * | 1993-04-09 | 1994-10-19 | 大连医学院 | 人体胎盘核酸的制备方法及其应用 |
| CN1117972A (zh) * | 1994-08-29 | 1996-03-06 | 唐迎滨 | 从天然植物细胞中提取核酸的生产工艺 |
-
1998
- 1998-02-12 CN CN98110654A patent/CN1057530C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1093711A (zh) * | 1993-04-09 | 1994-10-19 | 大连医学院 | 人体胎盘核酸的制备方法及其应用 |
| CN1117972A (zh) * | 1994-08-29 | 1996-03-06 | 唐迎滨 | 从天然植物细胞中提取核酸的生产工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1189501A (zh) | 1998-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3636769B1 (en) | Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof | |
| CN109722431B (zh) | 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒 | |
| CN110982876B (zh) | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 | |
| CN102533724A (zh) | 一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂 | |
| US20110117628A1 (en) | Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses | |
| EP0770689A2 (en) | Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions | |
| CN104962553A (zh) | 微量核酸释放剂提取病毒dna的使用方法 | |
| CN109762874B (zh) | 核酸助沉剂、孕妇血浆游离dna提取试剂盒及方法 | |
| JPWO2012023569A1 (ja) | Ｒｎａ抽出用溶液 | |
| CN112899266A (zh) | 一种核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用 | |
| CN103710338A (zh) | 一种人类全血白细胞中dna提取试剂盒 | |
| CN112626067A (zh) | 一种病毒rna快速提取的方法和试剂盒 | |
| CN101376912A (zh) | 甲3型流感病毒的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104560959A (zh) | 一种饱和氯化钠法快速批量提取血液dna的试剂盒和方法 | |
| CN101586162A (zh) | 一种提取靶核酸并进行pcr扩增检测的方法 | |
| CN102676498A (zh) | 人类全血中病毒基因组dna提取试剂盒及方法 | |
| CN103184214A (zh) | 一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂 | |
| CN1057530C (zh) | 核酸快速抽提方法 | |
| DK2171098T3 (en) | PROCEDURES FOR EXTRACTION AND CLEANING COMPONENTS IN BIOLOGICAL SAMPLES | |
| CN102433322A (zh) | 蜂蜜基因的提取方法 | |
| CN113373141A (zh) | 一种游离dna的提取方法 | |
| US20210207125A1 (en) | Method of isolating nucleic acids for long sequencing reads | |
| CN113493783A (zh) | 一种共提取不同样本的dna和rna的方法 | |
| EP0238593A1 (fr) | Recuperation et dosage d'adn dans un liquide biologique acellulaire | |
| CN108823201B (zh) | 一种rna核酸释放剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |