CN102676498A

CN102676498A - 人类全血中病毒基因组dna提取试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102676498A
Application number: CN2011100642033A
Authority: CN
Inventors: 缪林; 张琼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及一种人类全血中病毒基因组DNA提取试剂盒及其方法。该发明的特征在于试剂盒包括红细胞裂解液、白细胞裂解液、消化液、纯化液及DNA保存液。本发明采用两种裂解液分别处理含有病毒细胞的血液样品，在裂解血液细胞的同时，可以高效彻底地裂解其中的各种病毒细胞，使病毒DNA释放出来，与血液基因组DNA相互缠绕在一起而被提取出来.用该试剂盒提取病毒DNA时，不用事先对血液进行血浆和血清分离，只需取新鲜或冰冻的0.1至1ml抗凝全血即可提取高纯度微量病毒的DNA，并可以完全解链和高效地被扩增.本发明适用于所有科研单位和从事分子遗传学研究的实验室及开展临床基因诊断技术的医疗单位、血站以及疾病控制中心使用。

Description

人类全血中病毒基因组DNA提取试剂盒及方法

技术领域

该发明涉及一种从人类全血中提取病毒基因组DNA的试剂盒及利用该试剂盒从人类全血中提取病毒基因组DNA的方法。

技术背景

病毒是一类个体微小，结构简单，只含单一核酸，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型微生物。病毒在自然界分布广泛，可感染人体细胞，在细胞内解体释放出核酸分子，借细胞内环境的条件以独特的生命活动体系进行复制，常引起人体发病。

目前知道的DNA病毒有乙肝病毒，T2噬菌体，天花病毒，花椰菜花叶病毒等，本发明适用于所有的感染人类的血液中的病毒基因组DNA的提取，在已知的DNA病毒中，因为乙肝病毒对人类的影响和危害最大，传染性最强，因此本发明尤其适用于乙肝病毒基因组DNA的提取。

目前临床对于病毒的检测方法主要有两种：

1.血清学检查(ELISA检测)：主要检查患者血清特异性抗原抗体物质。如乙肝病毒检测，主要检测血液中HbsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbeAb，这就是人们常说的“乙肝两对半”检查，反映机体HBV感染的免疫状态。ELISA检测，无法判定病毒感染的数量和复制状态，检测灵敏度相对较低，时有有漏检发生。

2.DNA检查：DNA检测则是采用聚合酶链反应(PCR)技术，采用特异性引物，特异性扩增已知病毒基因组结构上的特异性片段的一种高效灵敏的方法。因该方法具有ELISA检测所无法达到的高通量、快速和高灵敏性，因此具有广阔的发展前景。

以乙肝病毒DNA检测为例，利用乙肝病毒基因组保守的C基因区上270bp基因片段，用PCR技术，可在数小时内可将极微量的HBV-DNA特定的分子片断扩增至1x107～1x108倍，大大提高了HBV的检出率，聚合酶链反应(PCR)可直接检测病毒核酸，是目前检测HBV最敏感的技术。

目前DNA检查已有逐步取代血清学检查(ELISA检测)的趋势，尤其是乙肝病毒的检测，乙肝病毒DNA检测已经成为临床乙肝病毒诊断的主要方法之一。

要进行病毒DNA检查，首先第一步也是最关键的一步便是要提取人体血液中病毒基因组DNA。目前，提取乙肝病毒DNA的方法很多，有煮沸法、沉淀法、吸附法等，但这些方法有一个共同缺点：首先必须对血液进行血浆和血清分离，用分离后的血清作为提取病毒DNA的标本，这将造成以下几个问题：1)步骤繁琐，增加工作量；2)操作过程中易二次污染，造成假阳性结果；3)在分离时易造成病毒DNA的损失，对于微量病毒DNA检测有影响，甚至检测不到，形成假阴性结果。因此，不用进行血清和血浆分离，研发一种直接从人体全血中提取病毒DNA的试剂盒和方法意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种从人类全血中快速、高效地提取病毒基因组DNA的试剂盒及其从人类全血中提取病毒基因组DNA的方法，用以解决在从血清中提取病毒DNA时引起的二次污染、DNA损失和步骤过多等缺陷。

1.本发明所提供的人类全血中病毒基因组DNA提取试剂盒，包括以下试剂：

1)红细胞裂解液：含有碳酸氢钾10mmol/L-12mmol/L，氯化铵135mmol/L-160mmol/L，PH值为8.0的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)0.1mmol/L-1mmol/L；

2)白细胞裂解液：含有PH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl)5-20mmol/L，PH值为8.0的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)50-150mmol/L，十二烷基硫酸(SDS)0.5-2％；

3)消化液：含十二烷基硫酸(SDS)1-5％；

4)纯化液：含饱和氯化钠溶液6mol/L；或含饱和醋酸钠溶液5.0-6.0mol/L；

5)DNA保存液：为经过灭菌处理的PH值为8.0-8.5的Tris-HCl溶液，或PH值在7.0-8.5范围内灭菌ddH2O。[0016]本发明优选的试剂盒配方如下：

1)红细胞裂解液：含有碳酸氢钾12mmol/L，氯化铵155mmol/L，PH值为8.0乙二胺四乙酸(EDTA)0.15mmol/L；

2)白细胞裂解液：含有PH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tri s-HCl)15mmol/L，PH值为8.0乙二胺四乙酸(EDTA)100mmol/L，十二烷基硫酸(SDS)1.0％；

3)消化液：含十二烷基硫酸(SDS)1.5％；

4)纯化液：含饱和氯化钠溶液6mol/L；或含饱和醋酸钠溶液6mol/L；

5)DNA保存液：为经过灭菌处理的PH值为8.5的Tris-HCl溶液，或PH值为8.0的灭菌ddH2O.

2.本发明所提供的从人类全血中提取病毒基因组DNA的方法包括以下步骤：

1)取0.1-1ml全血放入到2ml的离心管中，加入0.1-1ml红细胞裂解液，上下翻转，使沉淀物分散，8000-12000rpm离心1-2min。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。

2)离心管中加入0.1-1ml白细胞裂解液，上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转，8000-12000rpm离心1-2min.尽量倒尽掉上清液，使离心管底部的沉淀不再残留有白细胞裂解液。

3)吸取蛋白酶K(10mg/ml)5-10ul加入到上面的离心管中，用枪头反复吹打，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入60-300ul消化液，上下翻转离心管，务必使沉淀物分散于消化液中。55-65℃水浴10-30分钟。其间，取出离心管数次用力晃动几下帮助内溶物溶解，消化液变澄清。

4)取出离心管，加入20-100ul纯化液，上下翻转离心管使溶液混匀，12000-14000rpm离心2-5min，把上清液吸出放入到装有200-900ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10-20次，可见絮状DNA析出。(如果血液量少小，DNA析出量微量，可能看不见絮状DNA析出属于正常现象)。

1)把含DNA的无水乙醇溶液倒入纯化柱中，8000-12000rpm离心1-3min，弃去滤液，把纯化柱放回收集管上。

2)吸取40-100ul 70％乙醇于纯化柱内，8000-12000rpm离心1-3min，弃去滤液，把纯化柱放回收集管上，再离心2min.使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。

3)将纯化柱放入到一个干净的1.5ml离心管中。吸取30-50ul已温热到58-65℃的保存液，轻轻放入到滤膜的表面，纯化柱在水浴58-65℃保温10分钟，12000-14000rpm离心2min，即可得到高纯度病毒基因组DNA。将所述提取液置于-20℃环境中保存备用。

本发明思路为：病毒入侵人体后，在细胞中进行复制并释放到血液中，进入血液中的病毒，有的吸附在红细胞的表面，有的侵入白细胞，大部分则存在于血浆中。传统方法中，提取血液中的病毒DNA要先分离出血浆，再从血浆中分离出血清，从分离出来的血清中再用各种方法提取其中的病毒DNA。本发明设计的方法则利用人体血液基因组DNA含量高片段大网状结构的特点，可以与病毒DNA互相缠绕在一起而被提取出来，而无需添加任何吸附增强剂(如糖原等)，尤其适用于及微量的病毒DNA提取。分离出病毒DNA可以直接进行PCR扩增检测。

本试剂盒原理为：红细胞裂解液可以起到快速裂解红细胞的作用，使红细胞膨胀破裂，释放吸附在其表面的病毒，同时影响清除DNA提取的血红蛋白。白细胞裂解液可以破坏白细胞和病毒结构，使血液DNA和病毒DNA同时释放，并相互缠绕在一起而被沉淀下来。消化液中含十二烷基硫酸(SDS)，和蛋白酶K联合作用，可以分解与DNA结合在一起的核蛋白，使DNA被游离释放在消化液中。纯化液的主要作用是利用盐析原理清除溶液中的蛋白质，无水乙醇可以使分散游离的DNA结合在一起，并有效增强DNA和吸附柱的吸附作用，70％乙醇冲洗则可以很好的清除吸附柱中多余的盐分。DNA保存液提供了一种弱碱性环境，可以高效快速的将吸附膜上的DNA洗脱下来。需要特别说明的是通过该方法得到的不是单一的病毒DNA，而是病毒DNA和血液DNA相互缠绕着被一起提取出来，而这正是该方法的优势所在。技术优势

与其它方法相比，本发明的技术优势主要表现在：

1.简化了操作步骤，提高了工作效率，所有提取工作在45分钟左右即可完成，而其他方法则需要2小时以上。

2.不用对血液进行预处理，直接使用患者全血进行病毒DNA提取，因此减少二次污染机会，在临床检测中提高了检测的准确度，使结果更加真实可信。

3.如果血液中病毒含量很低时，传统方法则采用培养和浓缩的方法，或添加吸附增强剂(如糖原等)，本发明利用了血液基因组DNA和病毒基因组DNA相互缠绕的特性，极微量的病毒DNA也可被吸附缠绕而被提取出来，大大提高了检测的灵敏度，尤其适用于极微量的病毒DNA检测。

4.本发明使用的试剂中不含苯、氯仿等有毒物质，对人体无危害。

5.本发明所提取出来的DNA纯度高片段大，可以直接进行PCR扩增检测。

具体实施方式

下列实施例是进一步对本发明的说明，不应当当做对本发明的限制。

以血液中乙肝病毒DNA的提取为例说明如下：

按以下配方制作人类全血病毒DNA提取试剂盒：

1.红细胞裂解液：含有碳酸氢钾10mmol/L，氯化铵150mmol/L，PH值为8.0乙二胺四乙酸(EDTA)0.1mmol/L；

2.白细胞裂解液：含有PH值为8.0的三羟甲基氨基甲(Tris-HCl)20mmol/L，PH值为8.0乙二胺四乙酸(EDTA)50mmol/L，十二烷基硫酸(SDS)1.0％；

3.消化液：含十二烷基硫酸(SDS)2.0％；

4.纯化液：含饱和氯化钠溶液6mol/L；

5.DNA保存液：为经过灭菌处理的PH值为8.5的Tris-HCl溶液；

6.吸附柱：玻璃纤维膜吸附柱；

7.预配液：无水乙醇、70％乙醇和蛋白酶K(10mg/ml)。

按以下程序进行操作提取血液中的乙肝病毒DNA：

1.取1ml全血放入到2ml的离心管中，加入1ml红细胞裂解液，上下翻转，使沉淀物分散，8000rpm离心2min。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。

2.在离心管中加入1ml白细胞裂解液。上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转，8000rpm离心2min.尽量倒尽掉上清液，使离心管底部的沉淀不再残留有白细胞裂解液。

3.吸取蛋白酶K 10ul加入到上面的离心管中，用枪头反复吹打，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入300ul消化液，上下翻转离心管，务必使沉淀物分散于消化液中。58℃水浴10分钟。其间，取出离心管数次用力晃动几下帮助内溶物溶解，消化液变澄清。

4.取出离心管，加入100ul纯化液，上下翻转离心管使溶液混匀，13000rpm离心3min，把上清液吸出放入到装有900ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转20次，可见絮状DNA析出。(如果血液量少小，DNA析出量微量，可能看不见絮状DNA析出属于正常现象)。

5.把上面有絮状DNA的无水乙醇溶液倒入纯化柱中，8000rpm离心2min.DNA便附着在滤漠上，弃滤液，把纯化柱放回收集管上。

6.吸取100ul 70％乙醇于纯化柱内，8000rpm离心2min，弃去滤液。把纯化柱放回收集管上，13000rpm再离心2min.使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。

7.把纯化柱放入到一个干净的1.5ml离心管中。吸取50ul已温热到58℃的保存液，轻轻放入到滤膜的表面，纯化柱在水浴58℃保温10分钟，13000rpm离心2min，保存液中即含有所提取的乙肝病毒DNA。-20℃低温保存。

Claims

1.一种人类全血中病毒基因组DNA提取试剂盒，其特征在于包括以下试剂：

红细胞裂解液、白细胞裂解液、消化液、纯化液、DNA保存液。

2.根据权利要求1所述一种人类全血中病毒基因组DNA提取试剂盒，其特征在于各试剂分别为：

2)白细胞裂解液：含有PH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)15mmol/L，PH值为8.0乙二胺四乙酸(EDTA)100mmol/L，十二烷基硫酸(SDS)1.0％；

3)消化液：含十二烷基硫酸(SDS)1.5％；

5)DNA保存液：为经过灭菌处理的PH值为8.5的Tri s-HCl溶液，或PH值为8.0的灭菌ddH2O。

3.根据权利要求1和2所述的试剂盒提取人类外周血液中病毒基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

5)把含DNA的无水乙醇溶液倒入纯化柱中，8000-12000rpm离心1-3min，弃去滤液，把纯化柱放回收集管上。

6)吸取40-100ul 70％乙醇于纯化柱内，8000-12000rpm离心1-3min，弃去滤液，把纯化柱放回收集管上，再离心2min.使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。

7)将纯化柱放入到一个干净的1.5ml离心管中。吸取30-50ul已温热到58-65℃的保存液，轻轻放入到滤膜的表面，纯化柱在水浴58-65℃保温10分钟，12000-14000rpm离心2min，即可得到高纯度病毒基因组DNA。于-20℃保存备用。