CN105886668A - 一种鉴定辣椒上马铃薯y病毒属病毒的方法 - Google Patents

一种鉴定辣椒上马铃薯y病毒属病毒的方法 Download PDF

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章绍延
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Abstract

本发明属于病毒分离与鉴定技术领域，具体涉及一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属（Potyvirus）具体病毒种类的方法。该方法使用时包括：提取病毒、电镜观察、电泳并染色、质谱分析、DNA测序、结果判定等步骤。本申请可用于零背景材料鉴定，能够较为迅速和准确的鉴定出样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒；而且即使针对混合样病毒样品时，采用本发明，也可快速和准确的鉴定出样品中是否含有两种或两种以上的病毒，可以较好避免病毒株系强弱对于病毒鉴定的影响。同时就检测成本而言，本申请所提供的质谱‑DNA联用方法更加经济可行，因而具有一定的推广应用价值。

Description

一种鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属病毒的方法
技术领域
本发明属于病毒分离与鉴定技术领域，具体涉及一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属（Potyvirus）具体病毒种类的方法。
背景技术
辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum Linn.）的一种一年生或有限多年生植物。由于其营养价值高，维生素C含量在蔬菜中居首位，同时作为重要的调味品，辣椒已成为人民生活中不可或缺的一类蔬菜。随着社会经济的发展和辣椒育种技术的提高，产量高、性状优良的辣椒品种不断的被培育成功。目前，中国辣椒栽培面积全球最大，根据FAO统计数据显示，2014年我国鲜辣椒产量达到1620万吨，占同期全球总产量的51.9%。但是，随着辣椒种植面积日益扩大，病毒病的危害也越来越严重。病毒病已成为辣椒生产最严重的病害和限制因素之一。据调查，辣椒病毒病发病率一般在30%以上，严重时高达90%，甚至颗粒无收。更糟糕的是侵染辣椒的病毒种类多，罹病辣椒症状多样，畸形，花叶、落叶等并存，目前尚无防治方法。
自报道黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）侵染辣椒以来，至今已报道至少有45种的病毒能侵染辣椒。马铃薯Y病毒属病毒（Potyvirus）则是侵染辣椒作物的主要病毒，近年来已逐渐成为辣椒头号病害之一，严重危害辣椒产业发展。该属有近200个确定种或暂定种，已知能侵染辣椒的病毒主要有辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus，ChiRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)、辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus，PepMoV)和干辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus，PVMV)等6种。而现有的植物病毒检测方法主要有PCR/RT-PCR、ELISA、电镜观察、基因芯片等技术。但是，单一使用这些检测方法，要么很难诊断其确切的病毒病原，费时费力，要么就是成本太高，因而有必要加以继续改进。
发明内容
本发明主要目的是提供一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒的方法，从而为相关病症的预防和治疗奠定应用基础。
本发明所采取的详细技术方案如下所述。
一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒的方法，所述马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒具体包括：辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus，ChiRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,，PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)、辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus，PepMoV)和干辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus，PVMV)，鉴定时具体包括如下步骤：
（1）处理样品，获得病毒分离物；提取步骤可参考《辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备》（章绍延等，热带作物学报，2013，34（3）：534~537）中操作，具体为：
收集疑似感染马铃薯Y病毒属病毒的辣椒病样叶片样品200 g， 然后加入1LExtraction Buffer（0.2 mol/L NaAc 缓冲液，pH5.0，加入β-巯基乙醇至终浓度0.4%）于搅拌机中打碎，用四层纱布过滤，滤液分装于离心瓶中，并冰浴30 min；
4℃、8000 r/min离心10 min，取上清并加入PEG6000、NaCl、Triton X-100分别至终浓度8%、0.2mol/L、0.5%，然后4℃搅拌45 min；
4℃、8500 r/min离心15 min，弃上清，用滤纸小心吸去残留液体，用0.1 倍于Extraction Buffer体积的Tris -Citrate Buffer（0.1 mol/L Tris pH6.5，0.032 mol/L柠檬酸钠，加入Triton X-100 至终浓度0.5%）重悬，4℃搅拌45 min；
4℃、10000 r/min离心10 min，取上清，将上清转移到HITACHI 40 Pa Tube 中， 用配有平针头的注射器伸入液面以下将30%蔗糖垫层溶液从离心管底部缓慢注入；
4℃、27000 r/min条件离心2 h，弃上清，沉淀用300 μL Tris-citrate buffer 重悬，即为病毒粗提液，然后进行氯化铯密度梯度离心，以便对病毒进行进一步纯化和提取，具体过程为：
将8.7 g 氯化铯加入到20 mL Tris-citrate buffer中，充分溶解，然后平均分装到2个离心管中，在离心管顶部小心加入1 mL上述所制备的病毒粗提液，继续加Tris-citratebuffer 溶液至液面距离心管管口约2~3 mm；
配平离心管（精确到千分之一）并以36000 r/min（转子型号：HITACHI P40ST）在4℃下离心16 h；离心结束后小心取出离心管，尽量不使溶液震荡，并拍照记录；
根据离心管内病毒带颜色（蓝白色），识别出目的病毒带，用带长针头的注射器将目的带小心吸出；
用等体积的灭菌ddH2O 稀释所吸出的目的病毒带，4℃、10000 r/min离心10 min，取上清加入1/2 体积的24% PEG 溶液，混合均匀后于冰上沉淀10 min；再4℃、10000 r/min离心10 min ，弃上清，再瞬时离心用微量移液枪吸除残留液体，用1 mL Tris-citrate buffer重悬后，-20 ℃保存备用，此即为待鉴定的、提纯后的目的病毒带样品（病毒提纯液）；
（2）病毒电镜观察：取步骤（1）中的提纯后病毒提纯液5 μL置于2%磷钨酸溶液（pH6.8）中负染约30 min 后，透射电镜进行观察拍照；
（3）电泳并染色：对步骤（1）中所获得的病毒分离物（即，提纯后病毒提纯液）进行SDS-PAGE电泳并染色分析，具体为：
取7 μL病毒提纯液，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀；
沸水浴5 min，然后置冰上2 min，再4℃、12000 rpm离心1 min；
取上清液10µL上样到预先制备的SDS-PAGE不连续胶（浓缩胶浓度为5%、分离胶浓度为12%）胶孔中，以25 mA稳流进行电泳；
电泳结束后，将胶块置于考马斯亮蓝染液中浸泡，摇床上（80 rpm，室温)染色30 min；
自来水将凝胶冲洗干净后浸泡于脱色液中，室温平缓摇动4~8h，其间更换脱色液3~4次；
脱色完成后进行UVP凝胶成像系统扫描分析；
（4）质谱分析鉴定，对步骤（3）中电泳后胶条初步分析，将含有马铃薯Y病毒属病毒的胶条进行切割，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-TOF)；
依据质谱结果，选择NCBInr全库中的NCBInr_virus（683995 sequences）对质谱结果进行检索比对；
（5）DNA测序以对病毒核酸进行鉴定，具体为：
利用蛋白酶K 对步骤（1）中所制备的病毒提纯液中的病毒颗粒进行消化，然后利用酚仿抽提、乙醇沉淀的方法获得纯化的病毒RNA；
将提纯的病毒RNA用反转录酶合成cDNA第一链；
根据步骤（4）中的蛋白质搜索鉴定结果，选择适当的引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增时所用引物序列为，
针对辣椒环斑病毒，引物序列设计为：
ChiRSV-F：5’-GGT TTG ATG GTT TGG TGC ATT GTG-3’，
ChiRSV-R：5’-CAC TTA CAA CAA TGG CAG ATC GTA G-3’；
针对辣椒脉斑驳病毒，引物序列设计为：
ChiVMV-F：5’-CAG GAG AGA GTG TTG ATG CTG G-3’，
ChiVMV-R：5’-GCG CTA ATG ACA TAT CGG TAA GG-3’；
针对马铃薯Y病毒，引物序列设计为：
PVY-F：5’-CAA CTG TGA TGA ATG GGC TTA TGG-3’，
PVY-R：5’-AGC CCT CAC TGG TGT TCG TG-3’；
针对烟草蚀纹病毒，引物序列设计为：
TEV-F：5’- GCT GGA ACT TCA GGA ACA TTC TCA G-3’，
TEV-R：5’- CTT GCT CCT CAC CAT CCA TCA TG-3’；
针对辣椒斑驳病毒，引物序列设计为：
PepMoV-F：5’-CAG ACA CAT TGG ATG CTG GAG AGG-3’，
PepMoV-R：5’-ATC GTG GCA TGT ATG GTT CTT GC-3’；
针对干辣椒脉斑驳病毒，引物序列设计为：
PVMV-F：5’- ATG TGG GTG ATG GTT GAT GGT G-3’，
PVMV-R：5’- CCT CCT CCT GTG TGC CTA CC-3’；
将扩增得到的产物回收后连于pMD18T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定；
将初步鉴定为阳性的克隆菌进行测序分析；
（6）结果判定：
电镜观察中，如果观察到680~900 nm长、11~13 nm宽的弯曲线状病毒颗粒，则可初步判定辣椒病样为马铃薯Y病毒属病毒感染样品；
依据电泳结果的初步质谱分析，及后续的检索比对结果，可进一步缩小待鉴定的病毒范围，并初步确定感染辣椒病样的病毒是哪一种或哪几种；
进一步根据质谱分析的结果，设计特异引物进行RT-PCR扩增和测序，最终确定感染辣椒病样的病毒类型。
随着分子生物学技术和深度测序（Deep sequencing）的不断发展，以基因芯片技术、小RNA测序（Small RNA sequencing）、转录组测序（RNAseq）等为核心的新技术在病毒鉴定方面具有较好的优越性。但是这些方法普遍需要较高的检测费用，并且后期的生物信息学分析需要高性能的硬件支持，因而在推广及应用普及上存在一定的缺陷。而就利用PCR技术鉴定病毒种类而言，J. Chen等曾报道过一种用马铃薯Y病毒科通用引物对该科病毒进行检测的方法（A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae andits use to examine the taxonomic status of several members of the family，ArchVirol.，2001，146(4)：757-766）。但使用该方法时，如果是单一病毒形成的单独侵染时，可以较为准确地检测出侵染的病毒；而如果是复杂的复合侵染过程，一些弱毒株系劣势种可能被优势种掩盖，从而造成检测结果的不够完整和全面，因而也存在较大的应用局限性。
本申请所提供的针对辣椒上马铃薯Y病毒属的病毒鉴定方法，可用于零背景材料鉴定，能够较为迅速和准确的鉴定出样品中是否含有辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus，ChiRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)、辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus，PepMoV)和干辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus，PVMV)等马铃薯Y病毒属病毒；而且即使针对混合样病毒样品时，采用本发明，也可快速和准确的鉴定出样品中是否含有两种或两种以上的马铃薯Y病毒属病毒，可以较好避免病毒株系强弱对于病毒鉴定的影响；除此之外，利用本发明，还可以鉴定辣椒上其他的马铃薯Y病毒属新病毒（不包括已知6种病毒）。同时就检测成本而言，本申请所提供的质谱-DNA联用方法显然更加经济可行，因而具有一定的推广应用价值。
附图说明
图1为所采集样品的生理病症表现及所提取样品的电镜图，其中A为所采集样品的生理病症，B为所提取的病毒样品的电镜扫描图；
图2为纯化病毒后的SDS-PAGE 电泳图；
图3为纯化病毒RNA后的电泳图及相关扩增片段电泳图，其中a为纯化病毒RNA的电泳图，b为典型引物扩增片段电泳图；
图4为病毒蛋白的一级PMF谱图；
图5为病毒蛋白的相应肽段的二级谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中部分实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下。
样品来源：下述实施例中疑似辣椒环斑病毒（ChiRSV）感染样品采自海南文昌某地的黄灯笼辣椒叶片，具有典型的花叶斑驳症状，因而可初步认为受到辣椒环斑病毒（ChiRSV）感染，但对于是否确定受到辣椒环斑病毒（ChiRSV）侵染则需对病毒进一步进行分离鉴定。
主要试剂：
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，劢瑞生物科技（上海）有限公司；
pMD18-T载体，宝生物工程(大连)有限公司；
DH5a大肠杆菌感受态细胞，北京全式金生物有限公司；
EasyTaq PCR Mix，北京全式金生物有限公司；
质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；
其他未说明试剂均以本领域常用制备方法制备而成或从市场常规购得，不再重复介绍。
主要设备：
超速离心机（HITACHI himac CP 80MX），日立（中国）有限公司；
透射电镜（JEM-1010 型），日本（中国）电子公司；
UVP凝胶成像系统，天美(中国)科学仪器有限公司。
实施例1
本发明所提供的质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒的方法，具体包括如下操作步骤。
（1）处理样品，获得病毒分离物
如图1A所示，本实施例中所采集的样品具有典型的花叶斑驳症状，因而可作为疑似受辣椒环斑病毒（ChiRSV）感染样品。
收集疑似感染辣椒环斑病毒的辣椒病样叶片200 g，进行提取，获得病毒，具体操作步骤为：用1 L的Extraction Buffer（0.2 mol/L NaAc 缓冲液，pH5.0，加入β-巯基乙醇至终浓度0.4%）于搅拌机中将样品粉碎，四层纱布过滤，滤液分装于离心瓶中，冰浴30 min；
4℃、8000 r/min离心10 min，取上清并加入PEG6 000、NaCl、Triton X-100分别至终浓度8%、0.2mol/L、0.5%，4℃搅拌45min；
4℃、8500 r/min离心15 min，弃上清，用滤纸小心吸去残留液体，用0.1 倍于Extraction Buffer体积的Tris -Citrate Buffer（0.1 mol/L Tris pH6.5，0.032 mol/L柠檬酸钠，加入Triton X-100 至终浓度0.5%）重悬，4℃搅拌45 min；
4℃、10000 r/min离心10 min，取上清，将上清转移到HITACHI 40 Pa Tube中，用配有平针头的注射器伸入液面以下将30%蔗糖垫层溶液从离心管底部缓慢注入；
4℃、27000 r/min离心2 h，弃上清，沉淀用300 μL Tris-citrate buffer 重悬，即为病毒粗提液；然后进行氯化铯密度梯度离心，以便对病毒进行进一步纯化和提取，具体过程为：
将8.7 g 氯化铯加入到20 mL Tris-citrate buffer中，充分溶解，平均分装到2 个离心管中，在离心管顶部小心加入1 mL 病毒粗提液，继续加Tris-citrate buffer 溶液至液面距离心管管口约2~3 mm；
配平离心管（精确到千分之一）以36000 r/min（转子型号：HITACHI P40ST）在4℃下离心16 h；小心取出离心管，尽量不使溶液震荡，拍照记录；
根据离心管内病毒带颜色（蓝白色），识别出目的病毒带，用带长针头的注射器将目的带小心吸出；
用等体积的灭菌ddH2O 稀释，4℃、10000 r/min离心10min；取上清加入1/2 体积的24%PEG 溶液，混合均匀后于冰上沉淀10 min；
4℃、10000 r/min离心10 min ，弃上清，再瞬时离心用微量移液枪吸除残留液体，用1mL Tris-citrate buffer 重悬，-20℃保存，此即为待鉴定的病毒提纯液。
（2）病毒电镜观察：将步骤（1）中的病毒提纯液5 μL置于2%磷钨酸溶液（pH6.8）中负染约30 min 后，用JEM-1010 型透射电镜进行观察拍照。
结果如图1B所示，可看到大量头发丝状、大小约700×12nm的病毒颗粒，具有典型的Potyvirus属特征，依据此特征，可初步判定该辣椒样品为马铃薯Y病毒属病毒。
（3）电泳并染色
对步骤（1）中所获得的病毒分离物（病毒提纯液）进行SDS-PAGE电泳并染色分析，具体为：
取7μL病毒提纯液，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀；
沸水浴5 min，然后置冰上2 min，再4℃、12000 rpm离心1 min；
取上清液10 µL上样到预先制备的SDS-PAGE不连续胶（浓缩胶浓度为5%、分离胶浓度为12%）胶孔中，以25 mA稳流进行电泳；
电泳结束后，将胶块置于考马斯亮蓝染液中浸泡，摇床上（80 rpm，室温)染色30 min；
自来水将凝胶冲洗干净后浸泡于脱色液中，室温平缓摇动4~8h，其间更换脱色液3~4次；
脱色完成后进行UVP凝胶成像系统扫描。
电泳结果如图2所示。从图中可以看出，凝胶上有两条大小相近的主要条带，大小与大多数Potyvirus属病毒的外壳蛋白（Coat protein，CP）大小接近，在30~45 kDa之间。将两条目的胶条分别切下，并编号为29D、30D，以进行下一步的质谱分析。
（4）质谱分析鉴定
将步骤（3）中所切下的编号为29D、30D的胶条，双蒸水中保存，送往华大基因研究院进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-TOF)。
质谱分析结果表明（图4和图5），两个胶条分别获得1个一级质谱以及5个由一级谱中的若干最强峰产生的二级谱。
利用蛋白质搜索鉴定软件Mascot（版本2.3.02），选择NCBInr全库中的NCBInr_virrus（683995 sequences）对质谱结果进行检索比对。
比对结果表明（如下表所示），与29D和30D匹配度排名前5的蛋白均来自ChiRSV（如下表的病毒蛋白序列比对结果所示）；两者匹配度得分最高的都是蛋白ID为YP_006423994.1的ChiRSV的衣壳蛋白，其得分分别为433和463均远高于阈值53分，且覆盖率分别达到48.71%和46.13%。因此，可初步确认从海南黄灯笼辣椒上分离得到的Potyvirus为ChiRSV。
病毒蛋白序列比对结果：
。
但需要说明的是，如果仅依据质谱比对结果，显然难以准确判定是否仅为ChiRSV，例如从上表比对结果可以看出，除匹配到ChiRSV外，还有其他匹配的病毒，如得分206排名第6的Leek yellow stripe virus(LYSV)。其主要原因是，在不排除复合侵染的情况下，同属不同种病毒的CP蛋白氨基酸序列有一定的同源性。因而必须进一步进行其他途径的鉴定，才能鉴定是否仅为ChiRSV或是含有ChiRSV的混合物。
（5）DNA测序以对病毒核酸进行鉴定
利用蛋白酶K (TAKARA)对步骤（1）的病毒提纯液中的病毒颗粒进行消化，然后利用酚仿抽提、乙醇沉淀的方法获得纯化的病毒RNA。对所提取的病毒RNA进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3a所示。从图中可以看出，在2500bp左右有一条明亮的条带，这与Potyvirus属的RNA经普通电泳获得的条带大小基本一致。
将病毒RNA用PrimeScript反转录酶 (TAKARA)合成cDNA第一链。
根据步骤（4）中的蛋白质搜索鉴定结果，选择适当的引物，以合成的cDNA为模板进行扩增；具体引物序列设计如下：
ChiRSV-F：5’-GGT TTG ATG GTT TGG TGC ATT GTG-3’，
ChiRSV-R：5’-CAC TTA CAA CAA TGG CAG ATC GTA G-3’。
以合成的cDNA为模板进行PCR扩增；扩增产物电泳图如图3b所示，从图中可以看出，扩增片段大小约600bp，与实际大小相符。
需要说明的是，基于步骤（4）中的比对结果，在无法排除LYSV的情况下，发明人还采用了LYSV的特异引物进行了扩增，但未扩增到目的片段。因此，可以排除样品中存在LYSV。
将扩增得到的产物回收后连于pMD18T (TAKARA)载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定；
将初步鉴定为阳性的克隆菌进行测序分析。
（6）结果判定：
依据测序结果进行Blast比对，以确定具体的病毒类型。就该实施例而言，比对结果显示，测序结果所得序列与质谱鉴定得到的蛋白序列对应的核苷酸序列同源性为99.2%，氨基酸同源性为99.0%，与质谱鉴定结果吻合。因此，可以断定侵染海南黄灯笼辣椒的Potyvirus为辣椒环斑病毒(ChiRSV)。
需要说明的是，该实施例仅是针对辣椒上较为典型的辣椒环斑病毒（ChiRSV）感染样品进行的检测判定，属于较好实施例，对于其他单一病毒或混合病毒的鉴定过程与此类似，故此不再重复描述。

Claims (2)

1.一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，所述马铃薯Y病毒属病毒具体包括：辣椒脉斑驳病毒、辣椒环斑病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、辣椒斑驳病毒和干辣椒脉斑驳病毒，鉴定时具体包括如下步骤：
（1）处理样品，获得病毒分离物；提取步骤按照《辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备》中操作，获得病毒提纯液；
（2）病毒电镜观察：取步骤（1）中的提纯后病毒提纯液置于2%磷钨酸溶液中负染，透射电镜进行观察拍照；
（3）电泳并染色：对步骤（1）中所获得的病毒提纯液进行SDS-PAGE不连续胶电泳，并进行染色，脱色后进行UVP凝胶成像系统扫描分析；
（4）质谱分析鉴定，对步骤（3）中电泳后胶条初步分析，将含有马铃薯Y病毒属病毒的胶条进行切割，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析；
依据质谱结果，选择NCBInr全库中的NCBInr_virus对质谱结果进行检索比对；
（5）DNA测序以对病毒核酸进行鉴定，具体为：
利用蛋白酶K对步骤（1）中所制备的病毒提纯液中的病毒颗粒进行消化，然后利用酚仿抽提、乙醇沉淀的方法获得纯化的病毒RNA；
将提纯的病毒RNA用反转录酶合成cDNA第一链；
根据步骤（4）中的蛋白质搜索鉴定结果，选择适当的引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
将扩增得到的产物回收后连于pMD18T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定；
将初步鉴定为阳性的克隆菌进行测序分析；
（6）结果判定：
电镜观察中，如果观察到680~900 nm长、11~13 nm宽的弯曲线状病毒颗粒，则可初步判定辣椒病样为马铃薯Y病毒属病毒感染样品；
依据电泳结果的初步质谱分析，及后续的检索比对结果，进一步缩小待鉴定的病毒范围，并初步确定感染辣椒病样的病毒是哪一种或哪几种；
进一步根据质谱分析的结果，设计特异引物进行RT-PCR扩增和测序，最终确定感染辣椒病样的病毒类型。
2.如权利要求1所述质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，步骤（5）中，判定具体马铃薯Y病毒属病毒时，PCR扩增时所用引物序列为，
针对辣椒环斑病毒，引物序列设计为：
ChiRSV-F：5’-GGTTTGATGGTTTGGTGCATTGTG-3’，
ChiRSV-R：5’-CACTTACAACAATGGCAGATCGTAG-3’；
针对辣椒脉斑驳病毒，引物序列设计为：
ChiVMV-F：5’-CAGGAGAGAGTGTTGATGCTGG-3’，
ChiVMV-R：5’-GCGCTAATGACATATCGGTAAGG-3’；
针对马铃薯Y病毒，引物序列设计为：
PVY-F：5’-CAACTGTGATGAATGGGCTTATGG-3’，
PVY-R：5’-AGCCCTCACTGGTGTTCGTG-3’；
针对烟草蚀纹病毒，引物序列设计为：
TEV-F：5’- GCTGGAACTTCAGGAACATTCTCAG-3’，
TEV-R：5’- CTTGCTCCTCACCATCCATCATG-3’；
针对辣椒斑驳病毒，引物序列设计为：
PepMoV-F：5’-CAG ACACATTGGATGCTGGAGAGG-3’，
PepMoV-R：5’-ATCGTGGCATGTATGGTTCTTGC-3’；
针对干辣椒脉斑驳病毒，引物序列设计为：
PVMV-F：5’- ATGTGGGTGATGGTTGATGGTG-3’，
PVMV-R：5’- CCTCCTCCTGTGTGCCTACC-3’。
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