CN107177524A

CN107177524A - 一种人附红细胞体体外培养方法

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Publication number: CN107177524A
Application number: CN201710316888.3A
Authority: CN
Inventors: 陈瑶; 郝雷; 白静; 刘寰宇; 柴珂; 刘志跃; 邰秀珍; 杨殿相; 孙勤暖; 龚延萍; 孙计桃
Original assignee: Inner Mongolia Medical University
Current assignee: Inner Mongolia Medical University
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了一种人附红细胞体体外培养方法，该方法包括以下步骤：阳性红细胞泥的制备；红细胞泥的制备；人附红细胞体的体外培养。人附红细胞体能够在完全培养液中生长、繁殖和传代。在RPMI‑1640培养液中添加40％的胎牛血清配制的完全培养液作为其最适培养环境，连续传至15代仍可感染正常红细胞。本发明成功建立人附红细胞体的体外培养体系，为以后进一步研究人附红细胞体生物学特性、药物敏感性提供方法。并为附红细胞体的分类学、血清学诊断及疫苗研制等研究提供平台。

Description

一种人附红细胞体体外培养方法

技术领域

本发明属于化学技术领域，涉及一种人附红细胞体体外培养方法。

背景技术

附红细胞体病(Eperythrozoonsis)是由附红细胞体(Eperythrozoon，EH)寄生于人和动物的红细胞表面、血浆及骨髓中等多种部位，引起以发热、黄疸、贫血为主要临床症状的一种人兽共患传染性疾病。1928年Schilling和Dingen等最先在啮齿动物中查到类球血虫体，其后相继在羊、牛、猪、兔、犬、猫等多种动物和家禽中检测到附红细胞体。附红细胞体感染动物、畜、禽后可引起附红细胞体病。目前已有30多个国家和地区报告了此病，引起了人们的重视。

按照1984年出版的《伯杰氏细菌鉴定手册》可以将附红细胞体列为立克次氏体目无浆体科(Anaplasmataceae)附红细胞体属近年来，学者们通过对不同种属附红细胞体16S rRNA基因序列的分析认为应属于霉形体属。

关于人附红细胞体病，1986年Puntaric报道了世界首例人附红细胞体病后。于1991年邰秀珍等在国内首次报道了人附红细胞体病例，并叙述了其临床表现、相关实验室检查及附红细胞体形态特点等。此后国内学者在各省区相继报道了人附红细胞体病。据韩子强等对我国2001-2012年发表的有关附红细胞体流行病学文献进行的分析表明：附红细胞体感染在我国分布广泛，人群平均感染率为41.88％；并呈现出为高感染率，低发病率的特点。人感染后多呈潜伏状态。隐性感染者虽没有明显的临床症状和体征，但当受感染的红细胞比例达到一定水平时会表现出附红细胞体病。当机体抵抗力下降、处于其他疾病状态、某些应激状态均可引起发病，并有聚集性爆发的情况。但至今对它的发病机制还不甚清楚。

人附红细胞体病的诊断主要依靠显微镜下镜检结合患者临床表现，是否到过疫区，或者动物接触史。镜下患者的血片及骨髓片中均可查到附红细胞体。在瑞氏染色涂片中附红细胞体很容易就能辨认到，1000X油镜下，呈蓝紫色、棕红色等的折光小体，成簇或者孤立寄附在红细胞表面或者血浆。由于人附红细胞体的16S rRNA基因序列还未完全的检测出来，分子生物学诊断方法还未广泛应用于临床。

在防治方面，迄今为止还没有理想的免疫方法预防本病，所以药物治疗仍是控制本病的主要方法。目前，对人附红体病的药物治疗还处于实践摸索阶段。临床上大多病例选择多种抗生素和抗原虫药物青蒿素等进行实验性治疗。多数控制和消除临床症状，但多数患者仍会复发，不能从根本上治疗本病，也无法正确评价药物的作用效果。所以对首选治疗药物一直存在争议，结果导致抗生素滥用，造成附红细胞体菌株耐药性增加等问题。要解决上述问题，体外药物敏感性实验不失为有意义的方法之一。

近年来，国内外学者在附红细胞体的体外培养方面做了大量工作。Nonaka等在REM培养液中加入肌苷成功对猪附红细胞体进行体外培养。国内张守发等对猪、牛附红细胞体体外培养也获得成功。房春林等用RPMI-1640做为基础培养液和犊牛血清按不同比例混合，成功对猪和兔附红细胞体进行体外培养。李晓云等则用霉形体培养基对猪、兔、犬附红细胞体进行培养也获得成功。但对人附红细胞体的体外培养尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人附红细胞体体外培养方法，通过对人附红细胞体的体外培养环境探索，建立人附红细胞体体外培养技术，为更详细地观察和研究人附红细胞体的菌体形态、生理生化及生长繁殖特性，揭示其生物学特性，为附红细胞体的分类学、血清学诊断及疫苗研制等提供依据。并在此基础上开展人附红细胞体的体外药物敏感性实验比较现有治疗药物并筛选出有效的治疗药物，为临床治疗提供科学的指导。

其具体技术方案为：

一种人附红细胞体体外培养方法，包括以下步骤：

步骤1、阳性红细胞泥的制备：将PCR确定为阳性、且镜检感染率＞80％的血样，部分用无菌pH 7.2PBS洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用，部分血样加入150ml/L甘油，-80℃超低温冻存备用；

步骤2、红细胞泥的制备：PCR检测为阴性血样，部分血样用无菌pH 7.2PBS洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入2倍体积的PBS液，50℃恒温水浴锅加热2min，1500r/min离心，弃去上清，沉淀用PBS液洗涤3次，1500r/min离心，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用，部分血样加入150ml/L甘油，-80℃超低温冻存备用；

步骤3、人附红细胞体的体外培养

96孔细胞培养板中，每个培养孔中加入感染人附红细胞体的阳性红细胞泥2μl和红细胞泥18μl共20μl，与180μl完全RPMI-1640培养液混合培养，每孔共200μl，红细胞终浓度为5％，轻轻混匀，每孔做三个重复，同时设立不添加阳性红细胞泥的对照组和空白对照，将培养板置于5％CO₂恒温培养箱37℃进行培养，每隔12h从培养孔底部的3个不同位置吸取约2μl红细胞及RPMI-1640培养液进行涂片瑞氏染色镜检，检查红细胞感染情况，每24h更换一次RPMI-1640培养液，小心的吸取每孔上清液140μl后，收集起来，然后添加完全培养液至每孔总体积达200μl；

当红细胞感染率达80％以上时，则将孔内红细胞收集，留下约2μl红细胞悬液，再加入红细胞泥18μl和RPMI-1640培养液，总体积至200μl后混匀，使其感染率保持在3％，按原代培养条件进行培养，如果红细胞感染率没有达到80％，则继续培养，补入RPMI-1640培养液至200μl，轻轻吹打混匀后继续培养观察，如感染率经几次观察后仍不达80％，观察培养孔的颜色，是否有溶血来决定是否传代。

进一步，步骤3中所述的RPMI-1640培养液中添加40％的胎牛血清。

进一步，步骤3中红细胞感染率的检测方法采用瑞氏染色镜检。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用瑞氏染色法操作简单、稳定性好且标本保存时间较长，是进行人附红细胞体病诊断、普查及体外培养效果观察时优先的方法。

人附红细胞体能够在完全培养液中生长、繁殖和传代。在RPMI-1640培养液中添加40％的胎牛血清配制的完全培养液作为其最适培养环境，连续传至15代仍可感染正常红细胞。

成功建立人附红细胞体的体外培养体系，为以后进一步研究人附红细胞体生物学特性、药物敏感性提供方法。并为附红细胞体的分类学、血清学诊断及疫苗研制等研究提供平台。

附图说明

图1是人附红细胞体悬滴镜检，其中，图1a为为人附红细胞体感染阳性视野(10×40)。，图中可见箭头所示红细胞，表面有点状、刺突状附红细胞体附着，失去双凹圆盘状形态，并伴随震颤、扭转等运动，右下角为放大图像；图1b为无附红细胞体感染正常视野(10×40)，图中可见成熟红细胞，双凹圆盘状立体形态，可见中心淡染区，红细胞膜表面光滑、完整；

图2是人附红细胞体瑞氏片(10×100)，其中图2a为人附红细胞体感染阳性视野。图中可见成熟红细胞，着色为淡红色，表面有附红细胞体附着的红细胞较正常红细胞略大，附红细胞体大小不一、形态各异，但以圆形，逗状为主，并显示其折光性，图2b为无人附红细胞体感染正常视野。图中可见成熟红细胞，着色为淡红色，细胞膜完整，表面光滑；

图3是人附红细胞体特异性片段PCR扩增结果；

图4是RPMI-1640培养液培养接种后瑞氏染色10×100，其中图4a为光镜下折光前，图4b为光镜下折光后；

图5是RPMI-1640培养液培养24h瑞氏染色10×100，其中图5a为光镜下折光前，图5b为光镜下折光后；

图6是RPMI-1640培养液培养48h瑞氏染色10×100，其中图6a为光镜下折光前，图6b为光镜下折光后；

图7是RPMI-1640培养液培养72h瑞氏染色10×100，其中图7a为光镜下折光前，图7b为光镜下折光后；

图8是RPMI-1640培养液培养96h瑞氏染色10×100，其中图8a为光镜下折光前，图8b为光镜下折光后；

图9是RPMI-1640培养液培养120h瑞氏染色10×100，其中图9a为光镜下折光前，图9b为光镜下折光后。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1血样来源

本实验血样均采自内蒙古医科大学附属医院及第二附属医院。

1.1.2设备及试剂

生物安全柜：NU-437-600E，美国

CO2培养箱：150i，美国热电贺利氏

光学显微镜：BM2000南京

超纯水系统：NW30VFE，上海

电子天平：PL403，上海梅特勒-托利多

全自动高压蒸汽灭菌器：TOMYSX-500，日本

电热鼓风干燥箱：BGZ-76，上海

PCR仪：Verity 96well，美国ABI

凝胶成像仪：Gene Genius，英国Syngene

台式高速离心机：TGL-14G，上海医疗器械有限公司

电泳仪：DYY-8C，北京六一仪器厂

电泳槽：H6-1，上海精益有机玻璃制品仪器厂

数显恒温水浴锅：HS-800D，芜湖金瑞特计量检测仪器有限公司

血液基因组DNA快速抽提试剂盒：SK8223，生工生物工程(上海)股份有限公司

DNA marker：SM0331，加拿大BBI

PCR试剂盒：DRRO2AG，TAKARA

RPMI-1640、M-199、D-MEM培养基、胎牛血清：Gibco，美国

1.1.3主要溶液配制

1.1.3.1完全培养基

基础培养液补加不同比例灭活的胎牛血清和0.2％肌苷及1.0％双抗贮存液后，过滤除菌，置于4℃冰箱备用。

1.1.3.2瑞氏染液配制

1)瑞氏染液

瑞氏染粉1.2g，甘油80ml，甲醇600ml。将瑞氏染粉与甘油加入研钵，研细(一般5～10min)，再加入甲醇600ml(一般放置3个月)，放置常温下用。

2)缓冲液

1％磷酸二氢钾(KH₂PO₄)30ml，1％磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)20ml，蒸馏水加至1000ml。

1.1.3.3阿氏液(Alsiver’S液)：

葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g，蒸馏水加至100ml。用10％柠檬酸调节将pH调至6.1，过滤后分装，121℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。

1.1.3.4 0.01mol/L PBS(pH 7.0～7.2)缓冲液：

NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 2.1g，KH₂PO₄ 0.2g，蒸馏水加至1000ml。用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl调节pH为7.2，121℃高压灭菌15min后，4℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1人附红细胞体的阳性判定方法

1.2.1.1悬滴法

从血样中吸取一滴置于载玻片上，加2倍量生理盐水稀释，加盖盖玻片，在油镜(10×100)下观察，发现红细胞失去双凹圆盘的立体形状，边缘不整，呈齿轮状、星芒状、不规则多边形等。虫体大多聚集在红细胞上也可游离在血浆中，呈球状、点状、杆状等。在油镜下观察时，调节微螺旋时观察到虫体具有一定的折光性，就可将血样判断为附红细胞体感染(阳性)。如红细胞均形态正常、细胞膜光滑完整，上面无颗粒、点状等，调节微螺旋无反应，则可判定为阴性。

1.2.1.2瑞氏染色法

取少许血样置于载玻片上推成血膜，待血膜自然干燥后，在其上滴加瑞氏染液，使染液覆盖整个血膜后，以2倍于染色液的体积滴加瑞氏缓冲液，并用洗耳球将染液吹匀，染色 10min后用水冲洗，吸干或自然晾干。油镜(10×100)下观察，若能观察到有形态不一(如点状、逗号状、杆状等)的附红细胞体附着在红细胞上，并且每个红细胞上寄生附红细胞体数不一，多的可达10个左右；调节微螺旋具有折光性，就可将血样确定为附红细胞体感染。

1.2.1.3PCR法

参考赵文军对人附红细胞体设计的引物，由上海生工生物公司进行合成，引物序列为：

上游为5′-TGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATG(A)CCA-3′，

下游为5′-GTGGACTACTGGGGTATCTAA-3′。

按下列步骤做PCR检测，通过分子生物学方法检测血样是否属于附红细胞体阳性。

1)模板DNA提取

采用生工血液基因组DNA快速抽提试剂盒提取。

试剂盒组成：Buffer TBP，Buffer Digestion，Buffer PR，Proteinase K，TEBuffer(8.0)。

①取300μl抗凝全血加入600μl Buffer TBP，充分混匀，室温放置1min致红细胞完全裂解，此时液体为透明红色。8000rpm，离心1min，弃上清。

②用500μl TE Buffer重悬沉淀，8000rpm离心1min，小心弃掉上清，在干净的吸水纸上倒置几秒钟，吸弃残液。可再用TE Buffer洗涤一次至沉淀为白色。

③加Buffer Digestion180μl和Proteinase K溶液20μl，充分震荡。56℃水浴30min，目的是使细胞完全裂解。

④加Buffer PR60μl，颠倒混匀，放在-20℃的条件下，5min。

⑤室温旋转离心10000rpm 5min，将200μl的上清液转移到新的离心管1.5ml中。加入 200μl异丙醇，充分颠倒6次使之充分混匀，室温放置3min。然后再离心旋转5min10000rpm，去掉上清。

⑥加75％的乙醇1ml，颠倒漂洗3min，旋转离心10000rpm 2min，去掉上清，重复一次。

⑦打开盖，在室温的条件下，放置10min，使残留的乙醇完全挥发。得到的DNA放在-20℃备用。

2)PCR反应

①采用50μl体系的配制：模板DNA 1μl；上游引物下游引物各1μl；dNTP 10mM 1 μl；Taq Buffer 1μl；25mM MgCl₂ 5μl；Taq酶(μl)0.5μl；去离子水35.5μl。

②PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，56℃～60℃退火35s，72℃延伸40～ 50s，72℃延伸5～8min，进行35个循环。

3)琼脂多糖凝胶电泳

1％琼脂糖电泳，150V、100mA20min电泳观察。

1.2.2人附红细胞体的体外培养

1.2.2.1红细胞的收集与保存

阳性红细胞泥的制备：将PCR确定为阳性、且镜检感染率＞80％的血样，部分用无菌 PBS(pH 7.2)洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用。部分血样加入150ml/L甘油，-80℃超低温冻存备用。

红细胞泥的制备：PCR检测为阴性血样，部分血样用无菌PBS(pH 7.2)洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入2倍体积的PBS液，50℃恒温水浴锅加热2min，1500r/min离心，弃去上清，沉淀用PBS液洗涤3次，1500r/min离心，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用。部分血样加入150ml/L甘油，-80℃超低温冻存备用。

1.2.2.2人附红细胞体的体外培养

96孔细胞培养板中，每个培养孔中加入感染人附红细胞体的阳性红细胞泥2μl和红细胞泥18μl共20μl，与180μl完全培养液混合培养，每孔共200μl，红细胞终浓度为5％左右，轻轻混匀，每孔做三个重复。同时设立对照组(即不添加阳性红细胞泥)和空白对照。将培养板置于5％CO₂恒温培养箱37℃进行培养。每隔12h从培养孔底部的3个不同位置吸取约2μl红细胞及培养液进行涂片瑞氏染色镜检，检查红细胞感染情况。每24h更换一次培养液，小心的吸取每孔上清液约140μl后，收集起来，然后添加完全培养液至每孔总体积达200μl。

当红细胞感染率达80％以上时，则可将孔内红细胞收集，留下约2μl红细胞悬液，再加入红细胞泥18μl和完全培养液，总体积至200μl后混匀，使其感染率保持在3％左右，按原代培养条件进行培养。如果红细胞感染率没有达到80％，则继续培养。补入完全培养液至200μl，轻轻吹打混匀后继续培养观察。如感染率经几次观察后仍不达80％，观察培养孔的颜色，是否有溶血来决定是否传代。

具体实验设计：

1)不同培养液对人附红细胞体的影响：将各RPMI-1640、M-199、D-MEM培养液分与胎牛血清混合后作为培养人附红细胞体的完全培养液进行培养，根据感染率的变化，来选择最适培养液。

2)不同比例血清对人附红细胞体的影响：在上一步选定的基础培养液中分别添加10％、 20％、30％、40％的胎牛血清配制成完全培养液来培养人附红细胞体，根据红细胞溶血情况和附红细胞体生长状况，筛选出最佳的混合比例。

3)传代培养：每12h观察培养孔上清颜色，是否变红，出现溶血，如出现溶血，即更换培养液。观察人红细胞溶血的最早出现时间和最高感染率，从而确定出换液、传代的时间，进而确定传代的次数。

1.2.2.3培养物的鉴定

1)实验室常用方法鉴定：用悬滴法、瑞氏染色法在显微镜下观察其大小、形态、染色特点等是否与附红细胞体相同。

2)PCR方法鉴定：收集培养孔中培养物，12000rpm离心15min，弃去上清，沉淀作为DNA模版，进行PCR扩增，凝胶电泳查看PCR结果。实验后，将DNA回收测序与GenBank 上序列进行同源性分析比较(上海生工公司)。

1.2.2.4感染率计算：每12h从培养孔底部3个不同点吸取红细胞及培养液1μl，进行涂片，瑞氏染色后用油镜检查，在涂片的头、中、尾部各随机选择3个视野，计数红细胞及被感染的红细胞个数，游离的虫体及破裂的红细胞不计，同时观察二者的形态。

1.2.2.5数据处理：各组实验重复3次，取均数，采用SPSS20.0进行单因素方差分析。

2结果

2.1人附红细胞体的阳性诊断

2.1.1悬滴法结果

光学显微镜高倍或油镜下可观察到附红细胞体附着于红细胞表面，如刺突状，调节微螺旋可显示其折光性。红细胞形状可出现不规则变化，呈翻滚或扭转运动。感染严重的红细胞表面可附着5～10个不等附红细胞体，失去原来的两面双凹圆盘状形态。(见图1)。

2.1.2瑞氏染色法结果

在油镜下观察，发现附红细胞体附着于红细胞表面，同一视野可见附红体大小不一，形态各异，着色多色形。调节微螺旋可见其折光性。(见图2)。

2.1.3 PCR检测结果

人血样及体外培养产物，提取DNA进行PCR检测，可见培养物1及人血样2、3在400～500bp之间处出现扩增条带，人血样4则为阴性。(见图3).

2.2体外培养结果

通过在基础培养液中添加胎牛血清作为完全培养液，在红细胞泥上接种阳性红细胞泥进行人附红细胞体培养，培养各阶段红细胞的大致形态及其感染情况见图4-图9。图4为在1640 培养液中将阳性红细胞泥接种到正常红细胞泥后。红细胞形状不同，偶有红细胞表面见附红体附着，调节微螺旋可见其折光。本视野感染率＜10％。图5中可见成熟红细胞呈粉红色，散在分布，形态大多恢复正常，其表面附着蓝紫色点状、大小不一的附红体，调解微螺旋后可见其折光性。此视野红细胞感染率＞90％，每个红细胞上附着附红体数1～10个不等。图6中可见成熟红细胞，其大小不一，有的连接在一起，其上可见大小不一、个数不等的附红细胞体，调节微螺旋后具有折光性。此视野红细胞感染率＞90％。图7中可见成熟红细胞，中央淡然区扩大或消失，可见不规则形红细胞；红细胞表面上附着多个附红体，呈点状、杆状等，大小不一，调节微螺旋可见其折光性。本视野感染率＞90％。图8中可见红细胞，大多粘连在一起，红细胞膜可有破损，见红细胞碎片。红细胞中心染色深，周围可见苍白区域，细胞边缘又深染，可能为血红蛋白(HB)脱落或分布不均。图9中可见红细胞胞体几乎呈透明状，表面可见如丝状、网状深染，调节微螺旋后，部分可见其折光，但折光性较弱。

2.2.1不同培养液对人附红细胞体体外培养的影响

表1不同培养液中红细胞平均感染率的变化(％)

注：同列肩注中不同字母表示有差异(p＜0.05)。

人附红细胞体在三种基础培养液上均能生长，但能力有较大差异：RPMI-1640中红细胞感染率上升最快且最高约80％，(与M-199、D-MEM差异显著，p＜0.05)。M-199前期感染率上升较D-MEM快，在48h达到峰值约50％，随后即呈下降趋势。D-MEM组感染率前 24h上升不明显，随后持续上升至72h达到峰值约60％，随后下降。根据感染率的变化，选择RPMI-1640作为培养人附红细胞体的最适培养液。

2.2.2不同比例血清对人附红细胞体体外培养的影响

表2不同血清比例对感染率的变化(％)

注：同列肩注中不同字母表示有差异(p＜0.05)。

在RPMI-1640基础培养液中添加40％的胎牛血清配制的完全培养液对人附红细胞体体外培养效果相对最好。均在培养到48h时感染率达最高，48h至72h间有一相对平台期，感染率下降相对不是特别明显，随后感染率呈迅速下降的状态。因此选择在基础培养液中添加 40％的胎牛血清配制成完全培养液作为人附红细胞体体外培养的最适培养液。

2.2.3人附红细胞体体外传代培养实验结果

RPMI-1640培养液中添加40％胎牛血清及肌苷，在5％CO₂气体、37℃的条件下进行人附红细胞体的体外传代培养，人红细胞的初始感染率为8.4％，经24h体外培养感染率可超过85％，部分孔甚至高达90％以上，培养孔上清颜色尚清。体外培养36h后观察时，培养孔上清颜色明显变红，红细胞出现裂解；48h观察时，可见培养孔颜色如咖啡色，底部红细胞变黑。综合考量，选择每24h更换一次完全培养液并进行传代，及时补充健康人红细胞，连续培养15代后附红体仍可感染红细胞。但是随着传代次数的增加和培养时间的延长，人附红细胞体的活力和对红细胞的感染率逐渐下降。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种人附红细胞体体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、阳性红细胞泥的制备：将PCR确定为阳性、且镜检感染率＞80％的血样，部分用无菌pH 7.2 PBS洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用，部分血样加入150ml/L甘油，-80℃超低温冻存备用；

步骤2、红细胞泥的制备：PCR检测为阴性血样，部分血样用无菌pH 7.2 PBS洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入2倍体积的PBS液，50℃恒温水浴锅加热2min，1500r/min离心，弃去上清，沉淀用PBS液洗涤3次，1500r/min离心，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用，部分血样加入150ml/L甘油，-80℃超低温冻存备用；

步骤3、人附红细胞体的体外培养

96孔细胞培养板中，每个培养孔中加入感染人附红细胞体的阳性红细胞泥2μl和红细胞泥18μl共20μl，与180μl完全RPMI-1640培养液混合培养，每孔共200μl，红细胞终浓度为5％，轻轻混匀，每孔做三个重复，同时设立不添加阳性红细胞泥的对照组和空白对照，将培养板置于5％CO₂恒温培养箱37℃进行培养，每隔12h从培养孔底部的3个不同位置吸取2μl红细胞及RPMI-1640培养液进行涂片瑞氏染色镜检，检查红细胞感染情况，每24h更换一次RPMI-1640培养液，小心的吸取每孔上清液140μl后，收集起来，然后添加完全培养液至每孔总体积达200μl；

当红细胞感染率达80％以上时，则将孔内红细胞收集，留下2μl红细胞悬液，再加入红细胞泥18μl和RPMI-1640培养液，总体积至200μl后混匀，使其感染率保持在3％，按原代培养条件进行培养，如果红细胞感染率没有达到80％，则继续培养，补入RPMI-1640培养液至200μl，轻轻吹打混匀后继续培养观察，如感染率经几次观察后仍不达80％，观察培养孔的颜色，是否有溶血来决定是否传代。

2.根据权利要求1所述的人附红细胞体体外培养方法，其特征在于，步骤3中所述的RPMI-1640培养液中添加40％的胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的人附红细胞体体外培养方法，其特征在于，步骤3中红细胞感染率的检测方法采用瑞氏染色镜检。