CN109700913A - 一种提高不孕患者卵细胞质量的中药组合物 - Google Patents

Abstract

本公开属于中医药技术领域，具体涉及一种提高不孕患者卵细胞质量的中药组合物。本公开提供了一种具有提高不孕患者卵子质量的中药组合物，该中药组合物包括菟丝子、女贞子、当归、熟地、白芍、川芎、山萸肉、旱莲草、香附、鹿角胶和川椒。具有补益肝肾，调理冲任之功，使肾中阴平阳秘，精血俱旺，肾精充盛的效果。通过药物干预不孕患者，检测卵母颗粒细胞中基因表达的差异，本公开中提供的药物对于记忆的雌激素信号通路、细胞凋亡及补体系统具有显著影响，可以抑制MDM2‑p53‑p21信号通路及上调PI3K/AKT信号转导通路实现抑制卵母细胞凋亡，提高卵子质量的功效。

Description

一种提高不孕患者卵细胞质量的中药组合物

技术领域

本公开属于中医药技术领域，涉及一种提高不孕患者卵细胞质量的中药组合 物。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而 不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员 所公知的现有技术。

不孕是涉及全球各个国家和地区育龄夫妇的世界性问题，据世界卫生组织统 计，不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。 随着妊娠年龄的逐渐延后尤其是二孩政策的全面放开，不孕问题日益凸现，体外 受精-胚胎移植技术(IVF-ET，试管婴儿)为此类人群带来了希望，即便如此， 试管婴儿也无法扭转由于卵子质量的下降引起的生育力的降低。

传统中医认为，卵子质量下降是由于女性肾气亏虚，导致卵巢功能低下，卵 泡发育不良导致。发明人在“二至天癸方对IVF-ET患者颗粒细胞凋亡的影响” 的研究中考察了二至天癸方干预调节PI3K/Akt信号通路关键效应分子p-Akt、 PI3k及与通路相关的Bad水平对肾气虚体外受精－胚胎移植(IVF-ET)患者卵 细胞质量的影响。结果表明与健康对照组比较，安慰剂组PI3K、p-Akt蛋白表达 量降低，Bad蛋白表达量升高(P<0.05，P<0.01)；与安慰剂组比较，治疗组PI3K、 p-Akt蛋白表达量升高，Bad蛋白表达量降低(P<0.05，P<0.01)。与安慰剂组比 较，健康对照组及治疗组卵巢颗粒细胞凋亡率均降低，临床妊娠率增高(P<0.05， P<0.01)。结论二至天癸方可能是通过PI3K/Akt信号转导通路，下调Bad因子表达，抑制颗粒细胞凋亡，从而提高IVF-ET患者卵细胞质量，最终改善肾气虚 不孕症患者的IVF-ET结局。依据上述的研究结果，发明人认为，二至天癸方能 改善肾气虚型体外受精－胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF) 患者的肾气虚症状，提高患者的受精率、优质胚胎率以及临床妊娠率，并能干预 蛋白的表达。在此基础上进行信号转导通路的研究，为深入诠释“肾主生殖”的 科学内涵提供了可能性。

发明内容

针对上述研究情况，发明人针对提高卵子质量的中药组合进行了进一步的研 究，并获得一种新颖的，效果良好的中药组合物。本公开提供的中药组合物能够 改善不孕患者的肾虚状态，通过补肾益气、温养冲任，提高不孕患者的卵子质量， 提高受孕几率；通过进一步提取颗粒细胞进行研究，本公开发现该药物能够下调 人卵泡壁颗粒细胞MDM2-p53-p21通路关键效应分子MDM2、p53、p21的表达， 抑制人颗粒细胞凋亡相关PI3K/Akt通路的关键效应分子Bad，上调p-Akt的表达， 从而抑制颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞的成熟，为该药物提高卵子质量，应用于 治疗女性不孕提供了有力的依据。

本公开第一方面，提供一种具有提高卵细胞质量效果的中药组合物，该中药 组合物由以下原料组成：菟丝子、女贞子、当归、熟地、白芍、川芎、山萸肉、 旱莲草、香附、鹿角胶和川椒。

本公开以“补肾调冲任”的立法之本，能够提高不孕患者卵子质量，从而提高 不孕症患者的妊娠率，方中药物君臣佐使如下：

君药：菟丝子、女贞子

菟丝子补益肾精，养肝明目，止泻，兼能安胎，既可补阳，又可益阴；女贞 子滋补肝肾，乌须明目，气味俱阴，为入肾除热补精之品，肾得补，五脏亦安， 精神足，百病皆去也。两药相合，相得益彰，共为君药，并补肝肾。

臣药：枸杞子、旱莲草、熟地、山萸肉

枸杞子滋补肝肾、益精明目，与菟丝子合用，可以纠正阳虚状态，使肾中阴 平阳秘；旱莲草、山萸肉滋补肝肾，为清补肾阴之要品，与女贞子共同补益肝肾 之阴；熟地黄养阴补血，滋养精髓。四药合用，共为臣药。

佐药：川芎、当归、白芍、制香附、川椒、鹿角胶

川芎活血行气，祛风止痛，活血调经，用治多种妇产科疾病；当归补血调经， 活血止痛，兼能润肠通便，为补血之圣药；白芍养血敛阴，平抑肝阳，柔肝止痛， 用治肝肾不足、肝血亏虚之月经不调及不孕症；香附疏肝解郁，理气调中，调经 止痛，为妇科调经之要药，《本草纲目》谓其女科之主帅也；鹿角胶、川椒温补 肾阳以助化肾气；诸药合用，疏肝养血，调理冲任，佐君药滋补肝肾之功。

使药：甘草

甘草补益脾气，祛痰止咳，清热解毒，缓急止痛，调和诸药，以之为使。并 与白芍同用具有缓急止痛之功，此处取其补益脾气，调和诸药之效。

全方共奏补益肝肾，调理冲任之功，使肾中阴平阳秘，精血俱旺，肾精充盛， 血海按期满盈，则胎孕可成。

优选的，上述药物组合物由以下重量份的原料组成：菟丝子20～28份、女贞 子9～15份、当归9～15份、熟地9～15份、白芍12～18份、川芎8～15份、山萸 肉8～15份、旱莲草8～15份、香附8～12份、鹿角胶10～14份和川椒4～8份。

进一步优选的，上述药物组合物由以下重量份的原料组成：菟丝子22～26 份、女贞子10～14份、当归10～14份、熟地10～14份、白芍12～16份、川芎10～14 份、山萸肉10～14份、旱莲草10～14份、香附9～11份、鹿角胶11～13份和川椒 5～7份。

更进一步优选的，上述药物组合物由以下重量份的原料组成：菟丝子24份、 女贞子12份、当归12份、熟地12份、白芍15份、川芎12份、山萸肉12份、 旱莲草12份、香附10份、鹿角胶12份和川椒6份。

本公开第二方面，提供一种药物，该药物的原料为上述中药组合物。

本公开第三方面，提供上述药物的一种制备方法，其特征在于，上述中药组 合物为原料，浸泡后煮制而成。

优选的，上述药物的制备方法如下：将一定重量配比的菟丝子、女贞子、当 归、熟地、白芍、川芎、山萸肉、旱莲草、香附、川椒加水浸泡一段时间，煎煮 若干次后合并煎煮液；将鹿角胶研沫兑入煎煮液既得。

进一步优选的，上述中药组合物加水浸泡，加水量没过原料药物，浸泡时间 为25～35min。

进一步优选的，上述煎煮次数为两次。

更进一步优选的，第一次煎煮时，先用武火煮沸，再用文火煎煮25～35分钟， 过滤，得第一次煎煮液。

更一步优选的，第一次煎煮后的药渣加水浸没，武火煮沸，再用文火煎煮 15～25分钟，过滤，得第二次煎煮液。

本公开第四方面，提供上述药物作为S100A6、EGFR、TGFβ-1、Bcl-2、 CCL3L1、CCL4L1、C1QA、C1QB、C1QC激动剂或Bax、Fas、FasL、RND3 抑制剂的应用。

本公开第五方面，提供上述药物在免疫反应和/或细胞增殖的调节和/或补体 的激活和/或补体激活的经典途径和/或细胞凋亡方面的应用。

本公开第六方面，提供上述药物在调节雌激素信号通路和/或细胞凋亡和/或 补体系统中的应用。

本公开第七方面，提供上述药物作为MDM2-p53-p21信号通路抑制剂的应 用。

优选的，上述药物作为MDM2和/或p53和/或p21抑制剂的应用。

本公开第八方面，提供上述药物作为PI3K/AKT信号转导通路激动剂的应 用。

优选的，上述药物作为PI3K、p-AKT激动剂及Bad蛋白抑制剂的应用。

本公开有益效果：

1.在IVF-ET治疗周期中，本公开中的药物可明显改善肾虚患者的肾虚状态， 提高优质卵率、优质胚胎率，进而改善临床妊娠率。

2.治疗组患者药物干预后卵巢颗粒细胞基因表达谱与对照组相比存在显著 性差异，表明本公开中的药物可以通过促进细胞增殖、抗凋亡、调节免疫功能等 环节提高卵巢功能、改善妊娠结局，这些差异表达的基因可能是本申请中药物治 疗不孕的作用靶点。

3.经Western检测，肾虚不孕患者卵泡壁颗粒细胞中与细胞凋亡相关的 MDM2-p53-p21信号通路中的信号分子表达发生了变化。该结果表明本公开的药 物联合IVF-ET与单纯IVF-ET相比，可降低MDM2-p53-p21信号通路中关键效 应分子的表达，明显改善患者肾虚症状，提高卵细胞质量及胚胎发育潜能，进而 提高临床妊娠率。

4.本公开药物通过抑制人颗粒细胞凋亡相关PI3K/Akt通路的关键效应分子 Bax，上调Akt的表达，从而抑制颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞的成熟，证明该 药物还可以通过抑制卵母细胞凋亡实现提高卵子质量的效果。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的 示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例4中的RNA样本质量检测图；

其中，图1(a)为RNA样本1-1，图1(b)为RNA样本1-2，图1(c)为 RNA样本1-3，图1(d)为RNA样本2-1，图1(e)为RNA样本2-2，图1(f) 为RNA样本2-3。

图2为实施例4中mRNA表达水平和倍数变化的火山图；

其中，x轴为mRNA的平均表达水平，y轴为mRNA在治疗组及对照组中的表 达量的倍数变化；深色的点为不显著(p>0.05)的mRNA，浅色的点为统计显著 的mRNA(p<0.05)。

图3为实施例4中mRNA倍数变化和p值的火山图；

其中，x轴为mRNA的在治疗组和对照组的倍数变化，y轴为统计p值的对数 负值；深色的点为不显著(p>0.05)的mRNA，浅色的点为统计显著的mRNA (p<0.05)。

图4为实施例4中差异表达基因的表达量变化热图；

其中，x轴为分别划为不同组别的各个样本，y轴为差异表达基因。

图5为实施例4中药物对IVF患者卵泡壁颗粒细胞MDM2-p53-p21信号通路 蛋白表达的影响图；

其中，A、B、C分别指实施例4中药物治疗组、安慰剂组、非肾虚组。

图6为实施例4中药物对IVF患者卵泡壁颗粒细胞PI3K/AKT信号转导通路 蛋白表达的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出， 否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或 它们的组合。

正如背景技术所介绍的，发明人在既往研究过程中采用二至天癸方对IVF-ET患者进行干预，研究结果表明该中药组方能够显著改善患者肾气虚弱的 症状，为“肾主生殖”的科学观点提供了依据。在发明人的进一步研究中，提出 了一种新的中药组合物，该种药物应用于不孕患者，同样可以显著改善不孕患者 肾虚症状，并通过基因差异分析，该药物对雌激素信号通路图、细胞凋亡及补体 系统具有显著的影响，可通过调节MDM2-p53-p21信号通路及PI3K/AKT信号转 导通路减少卵母细胞凋亡，提高卵母细胞质量。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结 合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

本实施例中提供一种提高卵细胞质量的药物：称取菟丝子24克、女贞子12克、 当归12克、熟地12克、白芍15g、川芎12g、山萸肉12克、旱莲草12g、香附10g、 鹿角胶12g和川椒6g，将上述原料药物(鹿角胶除外)混合，加水浸没原料药物， 浸泡30分钟。浸泡完成后煎煮2次，第一次煎煮时，先用武火煮沸，再用文火煎 30分钟，过滤，得第一次煎煮液；药渣加水浸没，武火煮沸，再用文火煎20分钟， 过滤，得第二次煎煮液，合并两次煎煮液，将鹿角胶研沫兑入药汁中即得。

实施例2

本实施例中提供一种提高卵细胞质量的药物：称取菟丝子20克、女贞子9、 当归9克、熟地9克、白芍12g、川芎8g、山萸肉8克、旱莲草8g、香附8g、鹿角胶 10g和川椒4g，将上述原料药物(鹿角胶除外)混合，加水浸没原料药物，浸泡 25分钟。浸泡完成后煎煮2次，第一次煎煮时，先用武火煮沸，再用文火煎25分 钟，过滤，得第一次煎煮液；药渣加水浸没，武火煮沸，再用文火煎15分钟，过 滤，得第二次煎煮液，合并两次煎煮液，将鹿角胶研沫兑入药汁中即得。

实施例3

本实施例中提供一种提高卵细胞质量的药物：称取菟丝子28克、女贞子15克、 当归15克、熟地15克、白芍18、川芎15g、山萸肉15克、旱莲草15g、香附12g、 鹿角胶14g和川椒8g，将上述原料药物(鹿角胶除外)混合，加水浸没原料药物， 浸泡35分钟。浸泡完成后煎煮2次，第一次煎煮时，先用武火煮沸，再用文火煎 35分钟，过滤，得第一次煎煮液；药渣加水浸没，武火煮沸，再用文火煎25分钟， 过滤，得第二次煎煮液，合并两次煎煮液，将鹿角胶研沫兑入药汁中即得。

实施例4该药物对肾虚IVF患者妊娠结局及卵巢颗粒细胞基因表达谱的影响研 究一、研究对象

病例来源：受试病例全部来自于山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与 遗传中心IVF-ET治疗的不孕患者。

二、研究方法

(一)临床分组

用随机数字表法将临床选取符合纳入标准的66例患者分为治疗组33例(补 肾中药颗粒联合Gn)，对照组33例(安慰剂联合Gn)。

(二)临床药物、试剂、仪器

1.主要试剂、材料

淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)；PBS缓冲液(Sigma公司产品)；红细胞 裂解液(北京赛驰生物科技有限公司)；琼脂糖(西班牙Bioscience公司)；Trizol 试剂(Sigma公司产品，4℃保存)；乙醇(江苏花厅生物科技有限公司研钵)； 研钵；研杵；氯仿；塑料手套；EP管(0.2ml，1.5ml)；微量加样器(1～10μl， 2～20μl，20～200μl，200～1000μl)；Tip头(大，中，小)及吸头盒；三蒸水； 50ml离心管；液氮罐；培养皿。

2.实验室仪器、设备

稳压稳流水平电泳仪(美国，Thermo EC250-90)

台式高速低温离心机(美国，Thermo IEC)

超速离心机(Heraeus，Germany)

光学显微镜(日本，OLYMPAS SZX36)

倒置相差显微镜(日本，OLYMPAS CK40－32ph)

深低温冰箱(日本，Sanyo)

恒温试管架(QBT1)

超净工作台(丹麦，RI)

GDS8000凝胶电泳的分析系统(上海，四星公司)

S2-93自动双重纯水蒸馏器(上海，亚荣生化仪器厂)

202－型不锈钢数显电热恒温干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，上 海浦东跃新科学仪器厂)

ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪(山海顾村电光仪器厂)

国华漩涡混匀器(中外合资的深圳天南海北有限公司)

CO2培养箱(型号：FORMA3111，Forma Scientific，USA)

B型超声诊断仪(日本，ALOCK SSD1700)

真空负压吸引器(KMAR－4800)

恒温水浴箱(GB11241－89)

取卵针(K－OPS－1035－RWH－ET，16G，COOK)

电子天平(Mettler Toledo公司)

体视镜(德国，LEICA GZ6)

凝胶图像分析仪(Alphal mager 2200)

(三)方法、步骤

1.IVF-ET前预处理

治疗组于IVF-ET前3个月经周期，每周期自月经的第3天开始给予实施例 1中的药物，日1剂，每周期口服共14天，治疗3个周期。同时对照组患者给 予安慰剂，日一剂，每周期口服共14天，治疗3个周期。

2.控制性超排卵方案(COH)

两组患者均采用COH长方案：入选患者于IVF-ET前一个月经周期黄体期 (月经第21天左右)肌注达菲林0.9-1.2mg。自月经周期第3天开始，根据患者 每天不同情况予皮下注射果纳芬和(或)肌注尿促性素，阴道B超示至少有3 个直径≥1.8厘米的卵泡时，肌注HCG8000-10000IU，肌注HCG后36h左右行 阴道超声引导下穿刺取卵术。

3.卵巢颗粒细胞的收集与保存

(1)HCG注射后36h左右取卵，收集符合纳入标准患者直径≥1.8cm卵泡的卵 泡液，配平后离心，2000转20分钟。

(2)弃去上清，各管内加入少量PBS液，吹打混匀后并入一管内。

(3)取等量淋巴细胞分离液(预先室温下放置)，将步骤(2)中制备的细胞悬液 小心滴加入淋巴细胞分离液上，保持二者间液面清晰。

(4)配平后垂直离心机离心2000转20分钟。

(5)离心后可见管内上下液面间淡红色云雾状细胞薄层，100ul移液枪小心吸 出管内云雾状细胞薄层移入1.5mlEP管内。

(6)加入PBS(约是细胞沉淀物体积的3-5倍)洗涤后离心2000转15分钟， 弃上清，重复洗涤一次。

(7)弃去上清，加入约3倍细胞沉淀体积的红细胞裂解液，轻轻颠倒EP管， 使充分混匀，室温下静止10分钟充分裂解红细胞。

(8)5000g离心1分钟，弃红色上清，如沉淀中仍有红色，可重复步骤(7)-(8)1-2次。

(9)弃去上清，加入适量PBS液，取一滴显微镜下观察颗粒细胞形态、数量 及红细胞数量以明确颗粒细胞提取效果。培养24小时后的颗粒细胞，附壁良好 细胞生长呈梭形或星状，细胞间有延长的伪足相互连接，细胞核大、圆、胞浆饱 满、透光好，颗粒丰富、均匀。

(10)将提取好的颗粒细胞按分组标注编号、日期，将其置于-80℃冰箱内进行 冻存。

4.RNA的制备

(1)总RNA的提取

应用trizol(Invitrogen)对样本进行总RNA的抽提。具体方法如下：

①将提取的颗粒细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。

②12,000rpm离心5min，弃沉淀。

③按200μL氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后置于室温15min。

④于4℃12,000g离心15min。

⑤吸取上层水相，放置于另一离心管中，同时保留下层酚相存于4℃冰箱。

⑥按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，放置于室温5-10min。

⑦4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

⑧按1ml75％乙醇/mlTrizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

⑨4℃8,000g离心5min，弃上清。室温晾干5-10min。

⑩可用50μLH2O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。 测O.D值定量RNA浓度。

(2)总RNA的纯化

在前期使用Trizol法抽提总RNA，此方法易造成总RNA的纯度降低；必须 进一步纯化RNA。釆用QIAGENKit对总RNA进一步纯化。

①使用微量移液枪取总RNA≤100μg溶解100μLRNase-free水中，再加入 350μLBuffer RLT充分混匀。

②加入250μL无水乙醇，Tip头充分吹打混匀。

③将共计约700μL溶液(含总RNA)转入套在2ml离心管内的RNeasy mini 柱子内，离心机调至≥8000g离心15-30sec,弃去滤过液。

④吸取500μLBuffer RPE到RNeasy mini柱子内，再次离心机≥8000g离心洗 涤15-30sec,弃去滤过液，再吸取500μLBuffer RPE离心洗涤2min；弃去滤过液 和2ml套管，将RNeasy mini柱子转入新的1.5mlEP管中。

⑤吸取40μLRNase-free水,离心机调至≥8000g离心洗脱1min，再重复一次洗 脱。

⑥测定A260和A280的0D值(通常0D值介于1.8-2.1之间)，做进一步的 RNA质量检测。

(3)RNA的质检

根据纳入及排除标准确定所选样本，治疗组平均分成3个样本池，对照组平 均分成3个样本池，共6个RNA样本池。用分光光度计检测A260和A280的吸 收值(即0D值)，此过程用以确定RNA样本的质量。本研究中，6个RNA样 本均符合OD值检验标准。合格后采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。 Agilent nanochip分析仪完成质量检测的过程。样本质检合格标准：RIN>7.0且 28S/18S为1.5-2.5/1。

5.测序文库的构建及Illumina测序

将质量合格的RNA样本进行高通量测序，所采用的是Illumina公司第二代 RNA-seq高通量测序技术Hiseq 2000，具体步骤由上海锐金生物医药科技有限公 司实施。

文库的制备：将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段，并在其 两个末端加上接头(adapter)。

桥式PCR产生DNA簇：在Illumina高通量测序的芯片表面上连接有一层单链 引物，两端连接测序接头的单链DNA片段通过与芯片表面的引物碱基互补结合， 引物扩增成为双链后，使双链变性成为单链，该单链DNA的一端就被“固定”在芯 片上，而单链DNA的另一端随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形 成“桥(bridge)”。经过反复30轮扩增后，每个单分子得到了约1000倍扩增，成 为单克隆“DNA簇”。

利用可逆化学阻断技术测序：利用边合成边测序(Sequencing by synthesis) 的原理，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可 逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的部分，每个循环只容许掺入单个碱 基。去除其他多余的dNTP后，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一 轮反应所聚合上去的核苷酸种类。随后将这些基团化学切割，恢复3’端OH，继 续聚合第二个核苷酸。如此循环，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。统计 每轮收集到的荧光信号，就可得知每个模板DNA片段的序列。

文库的制备后进行数据分析，自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进 行二次分析。产出的原始数据可做初步分析和后期的生物信息分析处理。

6.数据分析的质量控制

通过控制假阳性率(Fasle Discorery Rate，简称FDR)进行差异表达基因筛选，上调基因筛选，标准为统计学上95％显著性水准为显著差异，通常设定p<0.05， 同时差异倍数大于2倍(Fold Change值>2)。筛选下调基因，标准P值同上，且 差异倍数小于2倍(FoldChange值<0.05)。

(四)观察指标

1.肾虚证候评分：分别于治疗前和HCG日逐项询问肾虚证候，按证候积分 标准(见附录)评分并作记录。

2.优质卵率、优质胚胎率、临床妊娠率

(1)取卵时，根据卵-冠-丘复合物(oocyte-cumulus-corano-complex，OCCC) 的形态来判断卵细胞成熟度。根据显微镜下cumulus细胞和放射冠的排列，将卵 子分为四级：Ⅰ级：卵细胞颜色深，放射冠没有散开，cumulus细胞紧密排列在 一起，颜色较深，或细胞团较小。这种卵子通常为不成熟卵或蜕化的卵。Ⅱ级： 卵细胞颜色变浅，放射冠呈不同程度的分散，cumulus细胞颜色变浅，排列变疏 松。这种卵子通常为接近成熟的卵。Ⅲ级：卵细胞为规则的圆形，颜色变淡，放 射冠完全散开，cumulus细胞团颜色很淡，较大且排列稀松。这种卵子通常为成 熟卵。Ⅳ级：卵细胞颜色变深，放射冠分散，但cumulus细胞团很小或消失。这种卵子通常为过成熟卵。

一般将Ⅲ级成熟卵定为优质卵。优质卵率(％)＝优质卵个数/取卵总数 ×100％。

(2)卵裂期胚胎评分，以细胞数结合碎片程度及卵裂球对称性按WIH评分 系统将胚胎分为五级(见表1，表2)。胚胎分数＝细胞数得分+碎片程度评分+ 卵裂球对称性评分。

表1 D2天胚胎评分标准

表2 D3天胚胎评分标准

本公开中若胚胎分数≥7分，则该胚胎为优质胚胎。

优质胚胎率(％)＝优质胚胎个数/受精卵总数×100％。

(3)ET后5周行阴道B超，见胎囊、胎芽及胎心者确诊为临床妊娠。临床妊 娠率(％)＝临床妊娠个数/患者数×100％。

3.RNA样本质量检测结果

哺乳动物(人)的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA 组成，28S和18SrRNA处为明显的亮带(相当于4.5kb和1.9kb)，28S/18S应为 1.5-2.5/1；RNA完整性指数(RIN)值应大于7，RIN值通过Agilent nanochip分析 仪完成。

4.RNA-seq高通量测序数据分析

高通量测序测定两组基因表达的差异，并使用检索互联网生物学公共数据库 提供的检索程序对差异表达基因进行分析，对差异表达基因进行GO注释，并利 用KEGG作pathway分析。

(五)统计学方法

本公开统计分析采用SPSS17.0统计软件；计量资料采用均数±标准差进行统 计描述，两组资料组间比较用t检验；计数资料用构成百分比描述，分类资料用 卡方检验，当T＜5时，用Fisher精确检验；文中统计检验都采用的双侧检验，P 值≤0.05被认为差别有统计意义。

三、研究结果

(一)两组患者肾阴虚证候积分变化(见表3)

表3两组患者治疗前后肾虚证候积分(分)变化比较

注：*与对照组比较，P＜0.05。

(二)两组患者优质卵率、优质胚胎率、临床妊娠率比较(见表4)

表4两组患者优质卵率、优质胚胎率、临床妊娠率比较

注：*与对照组比较，P＜0.05。

(三)RNA样本质量检测结果(见表5，图1)

表5 RNA样本的质检结果

(四)两组患者差异基因表达量的分析

以比对之后的BAM文件为基础，统计那些定位在注释的基因(Ensembl Geneannotation)位置上的序列，定量每一个基因的表达量(Read Counts)，之后使 用RPKM(Reads per kilo Base per million)方法对表达数据进行标准化。散点图 及热图可以直观地反映两组患者差异基因表达情况，如图2、图3、图4所示：

如图4所示，图中颜色越浅代表表达量越低，颜色越深代表表达量越高，此 结果与受试人员的治疗组和对照组分组相符，说明实施例4中中药干预后两组基 因表达谱有差异。

(五)两组患者差异表达基因的筛选

Flodchange值大于2或小于0.5，差异表达有显著统计性的基因，认为是在 两种样本间表达有差异。两组样本比较，以P值<0.05为筛选标准，上调基因156 条(Foldchange>2)，下调基因124条(Foldchange<0.5)。其中已知功能的有： S100A6、EGFR、TGFβ1、Bcl-2、CCL3L1、CCL4L1、C1QA、C1QB、C1QC等 表达上调，Bax、Fas、FasL、RND3等表达下调。

(六)两组患者差异表达基因的GO和KEGG分析

对于所得出的差异表达基因，使用DAVID Functional Annotation Tool(DAVIDBioinformatics Resources6.7,NIAID/NIH)工具分析这些差异表达基 因富集的KEGG通路和GeneOntology，利用超几何分布的检测方法进行统计检 测。检测的差异表达基因共涉及98种生物学功能(有些基因可涉及多种生物学功 能)，其中P＜0.05，有显著差异的生物学功能有8种。检测的差异表达基因涉及 17条通路。其中P＜0.05，有显著差异的通路共3条。具体GO列表和KEGG通路见 表6、表7。

表6差异表达基因的GO分析

表7差异表达基因涉及的KEGG通路

表8治疗前后肾气虚证候积分(分)变化比较

注：与治疗前相比，^*P＜0.05；^▲与安慰剂组相比，P＜0.05。

表9三组患者Gn用量及天数比较

注：*与安慰剂组比较，P＜0.05。

表9三组患者HCG注射日激素水平比较

由表9可知，三组患者HCG注射日血清E₂、LH、P浓度组间比较无显著 性差异(P>0.05)。

表10三组患者获卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率比较

注：*与安慰剂组比较，P＜0.05。

表11三组患者生化妊娠率和临床妊娠率比较(％)

注：*与安慰剂组比较，P＜0.05。

实施例5该药物对不孕患者卵泡壁颗粒细胞相关信号通路的影响

一.研究对象 同实施例4

二.研究方法

(一)分组 同实施例4

(二)药物、试剂、仪器

1.药物 同实施例4

2.试剂

3.仪器

三、观察指标及方法

(一)颗粒细胞的提取

注射HCG36h后在阴道B超指引下行穿刺取卵术，留取优势卵泡(5-10个) 的卵泡液。离心(500rpm,10min),取留取沉淀。将沉淀物中加入PBS至5ml。取 15ml离心管，加入人淋巴细胞分离液5ml，将混悬液缓慢加入淋巴细胞分离液 的液面上，离心(1200rpm,20min),吸取在两液面之间的颗粒细胞层PBS离心 (3000rpm,5min)，下层即为壁颗粒细胞，吸尽PBS。部分加入2mlTrizol液 (Invitrogen)完全裂解后置于-80℃冻存，用于实时荧光定量PCR(Real-Time Reverse Transcription PCR,RT-PCR)实验；部分-80℃直接冻存，用于Western blot 实验。

(二)Real-Time PCR法检测卵泡壁颗粒细胞增殖、凋亡、氧化应激相关通路关 键效应分子mRNA表达

1.荧光定量PCR引物的设计由上海生物工程公司合成。序列如下：

2.RNA提取和RNA纯度鉴定

RNA提取：加入Trizol液颗粒细胞样品,4℃，12000转每分钟，离心10min。 离心结束取上层水相转移至1.5ml离心管,加入等体积异丙醇，颠倒混匀数次， -20℃静置2h沉淀RNA。然后4℃，12000转离心20min，弃上清液，加入1ml70％ 乙醇(去核酶水配制)，混匀数次。离心10min,(4℃,12000转每分钟)，吸净上 清液，于室温下晾干。加入20ul的DEPC处理水溶解沉淀，-80℃冰箱保存备 用。

RNA纯度鉴定：取适量RNA标本，稀释后在紫外分光光度计上测定A260 和A280的光密度(0D)值，计算总RNA浓度和A260/A280的比值。各标本比值 范围1.8-2.0认为RNA标本纯度高，可用于逆转录。

3.反转录反应

按下列组成配制反转录体系：

将上述反应液混匀，稍离心，按以下条件进行反转录反应：37℃15min，85℃ 5s。反转录产物可于-20℃保存或直接进入下一步。

4.PCR反应 按下列组成配制PCR反应体系：

同时扩增多个反应时，为了减少实验误差，应首先配制共有成分的预混合液， 分装后，再添加引物等不同成分。上述反应液混匀，稍离心，按以下条件进行PCR 反应：95℃30s预变性；95℃5s，60℃34s，共40个循环。首次实验PCR反 应结束后，取10μl PCR反应液与2μl 6×DNA上样缓冲液混合后进行2％琼 脂糖凝胶电泳(100V,50min)，紫外透射仪下确认PCR反应产物的特异性并照 相。

5.计算：采用2^-△△Ct方法计算目的基因mRNA的相对表达量

1)对所有的测试样和校准样本，用内参基因的G_T值归一目的基因的G_T值： △G_T(test)＝G_{T(target，test)}-G_{T(ref，test)}△G_{T(calibrator)}＝G_{T(target，calibrator)}-G_{T(ref，calibrator)}；

2)用校准样本的△G_T值归一试验样本的△G_T值：△△G_T＝△G_T(test)。 △G_{T(calibrator)}；

3)计算表达水平比率:2^-△△Ct＝表达量的比值。

(三)Western blot法检测卵泡壁颗粒细胞增殖、凋亡、氧化应激相关通路关键 效应分子蛋白表达

裂解蛋白和测定浓度：

将提取的人颗粒细胞加入蛋白裂解液，冰浴30min，使细胞充分裂解。4℃， 8000r/min离心10min，收集上清，进行蛋白定量。BCA法测定蛋白浓度：50体 积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀； 测定562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

蛋白质电泳所用溶液的配置：

10％分离胶的配制(5ml)：双蒸水1.1m1，10％SDS 0.05m1，30％丙烯酰胺 2.5m1，10％APS 0.05m1，1.5M Tris-Cl(pH8.8)1.3ml，TEMED 2μl。

5％浓缩胶的配制(2m1)：双蒸水1.4m1,l.0M Tris-Cl(pH6.8)0.25m1,30％的丙烯酰胺0.33m1,10％APS 0.05m1,10％SDS 0.05m1,TEMED57 2μl。

上样buffer缓冲液：0.5mol/L Tris-Cl(pH6.8)5ml,0.05％溴酚蓝(BpB)1ml，SDS1g，50％甘油8ml，β-巯基乙醇0.6ml，蒸馏水4.4ml。

染色液：考马斯亮蓝R-250 0.1g,冰乙酸(冰醋酸)10ml，甲醇40ml，蒸 馏水定容至100ml。

脱色液：甲醇10ml,冰乙酸10ml,加蒸馏水定容至100ml。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸94g,Tris 15.15g，加水溶解后定容至1000ml,加5g SDS溶解其中，用时稀释5倍。

Western-blot所用溶液配制：

1×半干转移缓冲液：甘氨酸2.93g,Tris 5.82g,SDS 0.375g加蒸馏水溶解后定容至800ml,再加入200ml甲醇。

10×PBST：KCl 1g,NaCl 40.01g,KH₂PO₄ 1g,Na₂HPO₄ 14.50g。加水稀释定容 至500ml即为10×缓冲液,用时取上述溶液50ml加水稀释定容至500ml,加入 0.25mlTween20。

10×TBST：Tris 24.2g用蒸馏水溶解后用浓盐酸调pH值到7.5。用时取20ml 加入0.1ml Tween20和1.17g NaCl，用蒸馏水定容至200ml。

封闭液：5克脱脂奶粉溶于100ml TBST。

SDS-PAGE电泳：

配胶：配分离胶，颠倒混匀，避免产生气泡。沿边倒入分离胶至距梳子下缘 0.8-1cm处。30min分离胶聚合完全后，倒掉水，用滤纸条吸干。配浓缩胶加至 顶部。

样品变性：用裂解液及上样buffer调整蛋白浓度至4μg/μl,混匀。煮沸5min, 急冷。10000r/min离心5min。

上样：沿加样孔底部上样,上样量20-30μl,记录上样顺序。两侧的加样孔加 入等体积的上样buffer。电压50V,0.5h后，电压100V,电泳1h,至溴酚蓝带迁 移至底端。

转膜：将目的胶(未染色)切下浸入转膜液中，膜对正极，胶对负极。17V 转膜0.5h。

封闭：膜首先浸入TBS中漂洗片刻。10ml封闭液中封闭1h(室温)。

一抗孵育：稀释MDM2、p53、p21抗体：用封闭液将一抗稀释(抗BMP-15： 1:500；抗56β-actin：1:1000)，在杂交袋中杂交过夜(4℃)。

二抗孵育：膜用TBST液洗三次,每次5min。稀释二抗：用封闭液将抗兔 IgGAntibody IRDye800和抗鼠IgG Antibody IRDye700二抗稀释20000倍。包被 二抗：在杂交袋中杂交2-4h(室温)。膜用TBST液洗四次，每次5min。

ECL化学发光显影：二抗孵育后的PVDF膜移入玻璃平皿中，用1xTBST 漂洗3次；取适量ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表 面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。

数据处理：用Image J软件分析，以相应蛋白条带的灰度值与β-actin蛋白条 带的灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

四.结果

(一)实施例4中药物对IVF患者卵泡壁颗粒细胞MDM2-p53-p21信号通路 MDM2、p53、p21mRNA表达的影响(见表12)

表12三组患者卵泡壁颗粒细胞MDM2、p53、p21mRNA表达比较

注:与安慰剂组比较：^▲P<0.05,^▲▲P<0.01；与非肾气虚组比较：^★P<0.05,^★★P<0.01。

(二)实施例4中药物对IVF患者卵泡壁颗粒细胞MDM2-p53-p21信号通路 MDM2、p53、p21蛋白表达的影响(见表13)

表13三组患者卵巢颗粒细胞MDM2、p53、p21蛋白表达的比较

注:与安慰剂组比较：^▲P<0.05,^▲▲P<0.01；与非肾气虚组比较：^★P<0.05,^★★P<0.01。

(三)实施例4中药物对IVF患者卵泡壁颗粒细胞PI3K/AKT信号转导通路PI3K、 p-AKT、Bad蛋白表达的影响(见表14)

表14三组患者PI3K、p-AKT、Bad蛋白的相对表达量的比较

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域 的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有提高卵细胞质量效果的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下原料组成：菟丝子、女贞子、当归、熟地、白芍、川芎、山萸肉、旱莲草、香附、鹿角胶和川椒。

2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述药物组合物由以下重量份的原料组成：菟丝子20～28份、女贞子9～15份、当归9～15份、熟地9～15份、白芍12～18份、川芎8～15份、山萸肉8～15份、旱莲草8～15份、香附8～12份、鹿角胶10～14份和川椒4～8份；优选的，所述药物组合物由以下重量份的原料组成：菟丝子22～26份、女贞子10～14份、当归10～14份、熟地10～14份、白芍12～16份、川芎10～14份、山萸肉10～14份、旱莲草10～14份、香附9～11份、鹿角胶11～13份和川椒5～7份。

3.一种药物，其特征在于，所述药物的原料为权利要求1或2所述的中药组合物。

4.一种权利要求3中所述药物的制备方法，其特征在于，将所述中药物组合物浸泡后煮制而成；优选的，将一定重量配比的菟丝子、女贞子、当归、熟地、白芍、川芎、山萸肉、旱莲草、香附、川椒加水浸泡一段时间，煎煮若干次后合并煎煮液；将鹿角胶研沫兑入煎煮液既得。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述中药组合物加水浸泡，加水量没过原料药物，浸泡时间为25～35min；所述煎煮次数为两次；优选的，第一次煎煮时，先用武火煮沸，再用文火煎煮25～35分钟，过滤，得第一次煎煮液；优选的，第一次煎煮后的药渣加水浸没，武火煮沸，再用文火煎煮15～25分钟，过滤，得第二次煎煮液。

6.权利要求3中所述药物作为S100A6、EGFR、TGFβ-1、Bcl-2、CCL3L1、CCL4L1、C1QA、C1QB或C1QC激动剂或Bax、Fas、FasL、RND3抑制剂的应用。

7.权利要求3中所述药物在免疫反应和/或细胞增殖的调节和/或补体的激活和/或补体激活的经典途径和/或细胞凋亡方面的应用。

8.权利要求3中所述药物在调节雌激素信号通路和/或细胞凋亡和/或补体系统中的应用。

9.权利要求3中所述药物作为MDM2-p53-p21信号通路抑制剂的应用；优选的，所述药物作为MDM2和/或p53和/或p21抑制剂的应用。

10.权利要求3中所述药物作为PI3K/AKT信号转导通路激动剂的应用；优选的，所述药物作为PI3K、p-AKT激动剂及Bad蛋白抑制剂的应用。