CN113603799B - 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种高抗氧化性的米糠多糖‑肽复合物及其制备方法，属于米糠复合物制备技术领域，所述方法包括如下步骤：1)以脱脂米糠为原料，将脱脂米糠与水混合，加入酒石酸调节pH后，倒入高压均质机中均质，得米糠多糖提取液；然后对米糠多糖提取液离心，冷冻干燥，得相对分子质量为10k～50kDa的米糠多糖；2)将上述米糠多糖与米糠肽混合，采用干法进行美拉德反应，得多糖‑肽复合物。本发明所述方法可以得抗氧化性高的多糖‑肽复合物。

Description

一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于米糠复合物制备技术领域，尤其涉及一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法。
背景技术
米糠是水稻主要的副产物，但米糠综合利用率低。国际相关组织把米糠列为未充分利用的天然原材料之一。米糠中约有65％的营养物质。在动物生产中，米糠通常被用作饲料原料，其总利用率不足20％，造成资源浪费。米糠多糖(rice bran polysacchaside，RBP)主要由木糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯木聚糖及葡萄糖等组成。RBP在促进机体免疫力、抗炎、抗氧化等方面具有显著功效。
美拉德反应是广泛存在于食品工业的一种羟基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应，又称羟氨反应，经历复杂的过程最终生成棕色甚至黑色的大分子物质。美拉德产物是食品储藏和加工过程中自身产生的一类物质，是无毒副作用的天然食品抗氧化剂，可以与一些人工合成的具有潜在毒副和致癌作用的抗氧化剂相媲美。
发明内容
本发明旨在提取米糠多糖的同时，利用均质机来改变其相对分子质量，从而一步得分子量为10k～50kDa之间的抗氧化性较高的米糠多糖，同时让米糠多糖与米糠肽通过美拉德反应得到抗氧化性更强的多糖-肽复合物。
本发明提出一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)以脱脂米糠为原料，将脱脂米糠与水混合，加入酒石酸调节pH后，倒入高压均质机中均质，得米糠多糖提取液；然后对米糠多糖提取液离心，冷冻干燥，得相对分子质量为10k～50kDa的米糠多糖；
2)将上述米糠多糖与米糠肽混合，采用干法进行美拉德反应，得多糖-肽复合物。
进一步地，步骤1)中，脱脂米糠与水的料液比为1：15～1：20g/ml。
进一步地，步骤1)中，加入酒石酸调节pH为3.5～4.0。
进一步地，步骤1)中，均质的压力为80～95Mpa；均质的时间为20～30min；均质的次数为4～6次。
进一步地，步骤2)中，米糠多糖与米糠肽的摩尔比为4～6：1。
进一步地，步骤2)中，所述干法具体包括：将混合所得物置于干燥器内，然后将干燥器置于60～80℃恒温环境中放置1天。
进一步地，所述干燥器内的相对湿度为60％-80％。所述干燥器的底部搁置KBr溶液主要为了提高复合物的稳定性。
需要指出：米糠肽可以为市面出售的米糠肽。也可以为采用常规方法制备得到的，具体制备方法包括：将脱脂米糠粕加入15倍(体积比)的蒸馏水中，用20％的氢氧化钠调pH值为9.0左右，置于35℃水浴锅中水浴4h，然后以2800r/min的速度离心分离20min去下层渣，留上层清液。用1mol/L的盐酸将上层清液pH值调为4.5左右，室温静置50min，4000r/min离心15min，弃上清液得乳白色蛋白沉淀，将蛋白沉淀用去离子水清洗，将下层蛋白质沉淀溶于19倍水中，加入一定量的亚硫酸钠，调pH值为7.0左右，100℃条件下加热30min。
将上述溶液降温至40℃，然后放入酶水解设备中，加入蛋白质质量分数为2％的中性蛋白酶，酶活为50000u/g，且不停地搅拌，酶水解3h，停止酶解。水解液中加入盐酸，调节pH值为3.0左右，使酶失活冷却。将水解液放入离心机中，以2000r/min的速度离心10min，去下层沉淀，留上层请液。
将一定体积的蛋白质水解液以每小时10倍柱体积的流速通过H+型阳离子交换树脂脱Na+，直至流出液pH≈4左右为止。以同样速度将脱钠后的水解液通过OH—型阴离子交换树脂直至流出液呈弱酸性12。将上述清液放入真空浓缩干燥器中进行真空浓缩干燥，得米糠肽。
本发明还提出上述任一制备方法制备得到的高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物。
本发明具有以下优势：
本发明实施例通过有机酸及高压均质的共同作用，提取得相对分子质量较低(10k～50kDa)且抗氧化性高的米糠多糖提取液，然后再与米糠肽进行美拉德反应，控制干法加热温度，使活性肽中的ε-氨基与多糖还原性末端上的羰基之间自发进行美拉德反应，从而将多糖与活性肽偶联成一体，得抗氧化性高的多糖-肽复合物。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1所得米糠多糖-肽复合物抗氧化性分析结果图；
图2为本发明实施例2所得米糠多糖-肽复合物抗氧化性分析结果图；
图3为本发明实施例3所得米糠多糖-肽复合物抗氧化性分析结果图；
图4为本发明实施例1、对比例1、对比例2所得米糠多糖-肽复合物抗氧化性分析结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物的制备方法
1、米糠多糖的提取
将脱脂米糠粉碎后过60目筛，加入15倍脱脂米糠量的蒸馏水，再用酒石酸水溶液调节pH至3.5，浸泡十分钟软化。调节低温循环泵上下限温度为10℃～-4℃，保证均质机内部温度为常温。将混合物料倒入高压均质机，调节至80MPa，均质4次，每次20min；所得均质液4000r/min条件下离心15min去除沉淀，调节pH至中性，进行冷冻干燥，得分子量在10k～50kDa之间的米糠多糖。
2、多糖与肽进行美拉德反应
取干燥器，底部搁置一定量的饱和KBr溶液，使干燥器内相对湿度达到79％，将米糠多糖冻干粉与米糠活性肽冻干粉以摩尔比4：1混合，置于干燥器内，最后将此干燥器于60℃恒温放置一天后，即可得到多糖-肽复合物。
试验例1多糖-肽复合物抗氧化性分析
取米糠多糖、米糠活性肽以及实施例1制备所得多糖-肽复合物，分别配成浓度梯度为0.05、0.1、0.25、0.5和l.0mg/mL的待检测溶液，取1mL待检测溶液、1mL浓度为6mM的FeSO4溶液和1mL浓度为6mM的H2O2溶液混匀静置10分钟，然后加入1mL浓度为6mM的水杨酸溶液，摇匀静置30分钟后，于510nm处测定吸光值，计算·OH自由基清除率和EC50。
计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸光值/空白吸光值)]×100％；
EC50＝清除率为50％时的多糖或维生素C溶液的浓度，EC50值反映抗氧化能力的大小，EC50值越低，抗氧化能力越强。
结果参阅图1，从图1可得，利用美拉德反应对米糠多糖和肽进行反应，在实验浓度范围内，多糖-肽复合物对·OH自由基的清除率都高于米糠多糖和活性肽，说明美拉德反应后的米糠多糖-肽复合物的抗氧化性有很大提高，且高于常使用的抗氧化剂Vc。
实施例2一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物的制备方法
1、米糠多糖的提取
将脱脂米糠粉碎后过60目筛，加入20倍脱脂米糠量的蒸馏水，再用酒石酸水溶液调节pH至3.8，浸泡十分钟软化。调节低温循环泵上下限温度为10℃～-4℃，保证均质机内部温度为常温。将混合物料倒入高压均质机，调节至90MPa，均质5次，每次20min；所得均质液4000r/min条件下离心20min去除沉淀，在调节pH至中性，进行冷冻干燥得到分子量在10k～50kDa之间的米糠多糖。
2、多糖与肽进行美拉德反应
取干燥器，底部搁置一定量的饱和KBr溶液，使干燥器内相对湿度达到79％，将米糠多糖冻干粉与米糠活性肽冻干粉以摩尔比5：1混合后，置于干燥器内，最后将此干燥器于70℃恒温放置一天后，得多糖-肽复合物。
试验例2多糖-肽复合物抗氧化性分析
取米糠多糖、米糠活性肽以及实施例2制备的多糖-肽复合物，分别配成浓度梯度为0.05、0.1、0.25、0.5和l.0mg/mL的待检测溶液，取1mL待检测溶液、1mL浓度为6mM的FeSO4，溶液和1mL浓度为6mM的H2O2溶液混匀静置10分钟，然后加入1mL浓度为6mM的水杨酸溶液，摇匀静置30分钟后于510nm处测定吸光值，计算·OH自由基清除率和EC50。
计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸光值/空白吸光值)]×100％；
EC50＝清除率为50％时的多糖或维生素C溶液的浓度，EC50值反映抗氧化能力的大小，EC50值越低，抗氧化能力越强。
结果参阅图2，从图2可得，利用美拉德反应对米糠多糖跟肽进行反应，在实验浓度范围内，多糖-肽复合物对·OH自由基的清除率都高于米糠多糖和活性肽以及Vc，说明美拉德反应后的米糠多糖-肽复合物的抗氧化性有很大提高，且高于常使用的抗氧化剂Vc。
实施例3一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物的制备方法
1、米糠多糖的提取
将脱脂米糠粉碎后过60目筛，加入25倍脱脂米糠量的蒸馏水，再用酒石酸水溶液调节pH至4.0，浸泡十分钟软化。调节低温循环泵上下限温度为10℃～-4℃，保证均质机内部温度为常温。将混合物料倒入高压均质机，然后调节至95MPa，待压强稳定后，均质6次，每次20min；所得均质液4000r/min条件下离心20min去除沉淀，调节pH至中性，进行冷冻干燥得到分子量在10k～50kDa之间的米糠多糖。
2、多糖与肽进行美拉德反应
取干燥器，其底部搁置一定量KBr溶液，使干燥器内相对湿度达到79％，将米糠多糖冻干粉与米糠活性肽冻干粉以摩尔比6：1混合后，置于干燥器内，最后将此干燥器于80℃恒温放置一天后，得多糖-肽复合物。
试验例3多糖-肽复合物抗氧化性分析
取米糠多糖、米糠活性肽以及实施例3制备的多糖-肽复合物，分别配成浓度梯度为0.05、0.1、0.25、0.5和l.0mg/mL的待检测溶液，取1mL待检测溶液、1mL浓度为6mM的FeS04，溶液和1mL浓度为6mM的H202溶液混匀静置10分钟，然后加入1mL浓度为6mM的水杨酸溶液，摇匀静置30分钟后于510nm处测定吸光值，计算·OH自由基清除率和EC50。
计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸光值/空白吸光值)]×100％；
EC50＝清除率为50％时的多糖或维生素C溶液的浓度，EC50值反映抗氧化能力的大小，EC50值越低，抗氧化能力越强。
结果参阅图3，从图3可得，利用美拉德反应对米糠多糖跟肽进行反应，在实验浓度范围内，多糖-肽复合物对·OH自由基的清除率都高于米糠多糖和活性肽，说明美拉德反应后的米糠多糖-肽复合物的抗氧化性有很大提高，且高于常使用的抗氧化剂Vc。
对比例1
同实施例1，不同之处在于，酒石酸水溶液调节pH至4.5。
对比例2
同实施例1，不同之处在于，均质的压力为60MPa，均质的次数为2次。
试验例3
对实施例1、对比例1、对比例2进行抗氧化性测试，步骤参照试验例1。结果参阅图4，从图4可得，对比例1中，调节酒石酸水溶液pH至4.5，所得多糖-肽复合物的抗氧化性有所降低，可见，此酸度范围不利于相对分子质量为10k～50kDa的米糠多糖的形成，不利于高抗氧化性的多糖-肽复合物的形成。对比例2中改变均质压力与次数得到的多糖-肽复合物对·OH自由基的清除率低于实施例1中多糖-肽复合物。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以脱脂米糠为原料，将脱脂米糠与水混合，加入酒石酸调节pH为3.5～4.0后，倒入高压均质机中均质，得米糠多糖提取液；然后对米糠多糖提取液离心，冷冻干燥，得相对分子质量为10k～50kDa的米糠多糖；其中，均质的压力为80～95Mpa；均质的时间为20～30min；均质的次数为4～6次；
2）将上述米糠多糖与米糠肽混合，采用干法进行美拉德反应，得多糖-肽复合物；其中，米糠多糖与米糠肽的摩尔比为4～6：1；所述干法具体包括：将混合所得物置于干燥器内，然后将干燥器置于60～80℃恒温环境中放置1天。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤1）中，脱脂米糠与水的料液比为1：15～1：20 g/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述干燥器内的相对湿度为60%-80%。
4.权利要求1~3任一项所述的制备方法制备得到的高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物。
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