CN112725398A - 一种具有辅助降血糖功能的豌豆肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有辅助降血糖功能的豌豆肽及其制备方法和应用，豌豆肽组成中至少包括肽段pEE、pEK以及pER；基于所述豌豆肽的质量，所述肽段pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g。该豌豆肽在降低血糖方面有较为显著的功效。

Description

一种具有辅助降血糖功能的豌豆肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有辅助降血糖功能的豌豆肽及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
豌豆，又名麦豌豆、寒豆、麦豆、荷兰豆，其具有耐寒、耐旱、耐瘠等特点，适应性极强，因此在全世界广泛分布，并且种植面积和产量相对稳定，年平均产量在1000万吨左右。豌豆中的蛋白质含量较高，占干豌豆质量的23-25％，并且豌豆蛋白的氨基酸组成比较平衡，因此豌豆蛋白是一种优质的的植物性蛋白。
目前，淀粉及粉丝工业在生产工艺中会产生大量的豌豆蛋白副产品，这些豌豆蛋白副产品经简单纯化干燥后，即为豌豆蛋白。然而，由于豌豆蛋白的可消化性差，因此豌豆蛋白的营养价值不能充分发挥。
现阶段，为了能够进一步提高对豌豆蛋白的利用率，多以豌豆蛋白为原料进行酶解，制成多肽产物，也称豌豆肽，豌豆肽的各类功效来自蛋白质大分子被切断而形成的某些短肽，已有共识认为其中包括了对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的不同小肽。已经有的研究报道记载，豌豆肽中某些短肽具有一定的人体代谢和生理调节功能，可以在肠道内直接被吸收，导致豌豆肽相较豌豆蛋白能更容易，也更迅速被吸收，所以由豌豆蛋白经酶解得到的豌豆肽是豌豆深加工的新方向。
目前在豌豆肽的生产过程中，多以为人体提供更多的营养以提高免疫力、减轻炎症为方向对豌豆蛋白进行酶解，窄化了豌豆蛋白的应用范围，影响了豌豆深加工的进一步发展。
发明内容
本发明提供一种具有辅助降血糖功能的豌豆肽，通过调控其组成中的功能性肽段及其含量，在控制血糖升高或降糖方面表现出良好功效。
本发明还提供一种上述豌豆肽的制备方法，通过对豌豆蛋白原料的酶解以及分离纯化等工序的控制，使产物满足所预设的功能性肽段组成。
本发明还提供一种上述豌豆肽在降血糖产品中的应用。
本发明提供一种豌豆肽，该豌豆肽组成中至少包括焦谷氨酰焦谷氨酸肽段(pyroGlu-Glu，pEE)、焦谷氨酰赖氨酸肽段(pyroGlu-Lys，pEK)以及焦谷氨酰精氨酸肽段(pyroGlu-Arg，pER)；基于豌豆肽的质量(干基)，pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g。
除此之外，上述豌豆肽还具备平均分子量小易吸收的特点，具体地，豌豆肽中分子量小于1000u的肽的质量含量≥85％。
本发明的豌豆肽是以豌豆蛋白为原料，例如豌豆蛋白粉，依次进行超声处理、酶解处理、过滤处理、热处理和纯化处理而得到的；其中，所述酶解处理包括依次使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶进行三段酶解，热处理包括在80-100℃下加热1-3h。本发明的风味蛋白酶是指米曲霉为工程菌菌株制备的商业化复合风味蛋白酶。
由于豌豆蛋白原料中的部分蛋白会与皂苷等成分发生结合，因此在制备之初，需要对豌豆蛋白原料进行超声处理，从而将豌豆蛋白原料中更多的蛋白释放出来以提高酶解效率。
然后依次使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶对超声处理后的产物进行多次酶解，具体地，先利用碱性蛋白酶进行第一酶解，灭酶后，得到第一酶解液，再利用胰蛋白酶对第一酶解液进行第二酶解，灭酶后，得到第二酶解液，最后向第二酶解液中加入风味蛋白酶进行第三酶解，灭酶后，得到第三酶解液。其中，三次酶解的pH环境和温度以各自蛋白酶的最佳酶解条件确定，而三次酶解的时间分别控制在4h之内，并且第三酶解的时间需要低于第一酶解的时间和第二酶解的时间，例如可以控制第三酶解的时间为0.5-1h。上述三次灭酶操作可以利用本领域常用的高温灭酶技术。
酶解处理中，除了需要对酶解的温度、pH环境以及时间进行控制外，还需要对酶的用量进行控制以尽可能保证产物中的肽段pEE、pEK以及pER具有较高质量含量。以豌豆蛋白原料中豌豆蛋白的有效质量为基准，每克豌豆蛋白可以利用100-1000U碱性蛋白酶，10-100U胰蛋白酶，10-50U风味蛋白酶。
酶解结束后，对第三酶解液进行过滤以分离其中的大分子物质，例如可以在30-80℃以及0.2-0.4MPa的压差下，采用孔径为10-50nm的滤膜进行过滤处理，对滤液进行浓缩并在80-100℃下加热浓缩液1-3h，最后，利用阳离子交换树脂对加热后的浓缩液进行纯化处理，从而使酶解液中的肽段pEE、pEK以及pER得以保留并富集。具体地，可以利用预处理好的100-200目的AG50W-X8阳离子交换树脂进行吸附处理，且阳离子交换树脂的质量为加热后浓缩液质量的5％。
随后，对经过吸附处理收集的液体产物进行灭菌、干燥，得到所需要的豌豆肽，其中至少含有了肽段pEE、pEK以及pER，且肽段pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g
研究表明：上述含有特定质量含量的肽段pEE、pEK以及pER的豌豆肽在控制血糖升高或降糖方面表现出良好功效；此外，豌豆肽中分子量小于1000u的成分所占比例高于85％，从而利于被人体肠道完整吸收，更易在人体内发挥作用。
本发明还提供上述豌豆肽的制备方法，包括以下步骤：
1)对豌豆蛋白原料与水的混合物进行超声处理后实施固液分离，收集沉淀，向所述沉淀加水制成浆液；
2)调节所述浆液的pH值后加入碱性蛋白酶进行第一酶解，搅拌2-4h后灭酶，得到第一酶解液；
3)将所述第一酶解液离心，向离心上清液加入胰蛋白酶进行第二酶解，搅拌2-3h后灭酶，得到第二酶解液；
4)向所述第二酶解液中加入风味蛋白酶，搅拌0.5-1h后灭酶，得到第三酶解液；
5)对所述第三酶解液进行过滤并浓缩滤液，在80-100℃加热浓缩液1-3h后进行树脂吸附处理，得到所述豌豆肽。
本发明制备豌豆肽的原料为能提供豌豆蛋白的任何原料，例如豌豆蛋白粉，为了保证酶解处理的效率，本发明可以选用蛋白质量含量大于60％，例如60％-80％的豌豆蛋白粉作为原料。
在进行酶解之前，需要对豌豆蛋白原料进行预处理，本发明的预处理是指利用超声设备对豌豆蛋白原料与水的混合物进行超声处理。由于豌豆蛋白粉中常含有质量含量为0.2-3％的皂苷，该皂苷不仅影响口感，更会与蛋白结合而阻碍对蛋白的酶解，因此该超声处理能够将豌豆蛋白原料中与皂苷等进行结合的蛋白释放出来，从而能够提高酶解效率，更加有利于获得具有目标质量含量的目标肽段的豌豆肽。
具体地，豌豆蛋白原料与水的混合物中，豌豆蛋白原料与水的质量比不低于1：5，例如1：(5-15)，即每1kg豌豆蛋白原料与至少5L水混合制备混合物，可以采用温度为60-80℃的水与豌豆蛋白原料混合。并且为了保证更多与皂苷结合的蛋白能够被释放处理，可以在70-90℃下，每1kg豌豆蛋白原料以100-800W进行超声处理30-90min，优选400-500W。超声处理结束后，皂苷会溶于水中，而蛋白质仍保留在固相中，因此可以对超声结束后的体系进行固液分离，例如离心，并收集固相沉淀。
随后，向沉淀中加水制成浆液，沉淀与水的质量比为1：(5-15)，即每1kg沉淀加5-15L水搅拌成浆液。制浆处理能够将已富集的蛋白制成具有一定流动性的浆液，利于后续的酶解。加水过少时浆液流动性差，不利于酶制剂的作用，易导致酶解效率降低；而加水过多时反应体积过大，后续处理(例如浓缩等)的负荷增加，也可能导致产物组成和结构的改变，此外处理成本也会相应增加。
本发明人对于如何使豌豆蛋白的酶解产物中能含有预期质量含量的肽段pEE、pEK以及pER进行了大量研究摸索，证明酶制剂的选择、酶处理的工艺以及相应的富集分离工艺对结果具有关键影响。发明人在研究过程中意外地发现，只有分别利用碱性蛋白酶、胰蛋白酶以及风味蛋白酶进行逐次酶解，并且对酶解产物在80-100℃进行1-3h的热处理，并经阳离子交换树脂进行纯化，才能够有助于得到包含pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g的豌豆肽。
制浆完毕后，可以调节浆液的pH值至碱性蛋白酶的最佳酶解pH环境，例如8-10，得到利于碱性蛋白酶进行第一酶解的酶解原液。具体可以利用氢氧化钠水溶液调节。
具体地，在碱性蛋白酶的适宜酶解温度下，例如30-50℃，向酶解原液中加入碱性蛋白酶后，搅拌2-4h，使碱性蛋白酶作用于酶解原液中的蛋白，充分打开蛋白高级结构以暴露更多的酶切位点，灭酶后，得到第一酶解液。发明人对第一酶解液进行检测发现，第一酶解液中也含有肽段pEE、pEK以及pER，但是各自质量含量极低，推断可能是豌豆蛋白自身中含有的少量短肽在碱性蛋白酶的作用下切割而成。
随后，将第一酶解液离心，收集离心上清液以进行第二酶解。为了最大化发挥胰蛋白酶的酶解效率，在向离心上清液加入胰蛋白酶之前可以控制离心上清液的pH值为7.5-8.5。在胰蛋白酶的适宜酶解温度下，例如30-50℃，向离心上清液中加入胰蛋白酶，搅拌2-3h，使胰蛋白酶充分作用于离心上清液中的蛋白，灭酶后，得到第二酶解液。
最后，在风味蛋白酶的适宜酶解温度下，例如30-50℃，直接向第二酶解液加入风味蛋白酶，搅拌0.5-1h，使风味蛋白酶充分作用于第二酶解液中的肽链，灭酶后，得到第三酶解液。
上述三次灭酶均可以采用本领域常规灭酶手段进行灭酶，例如生产中升温至115-125℃并维持20s左右，实验室可以将体系煮沸30min。
发明人在研究上述酶解过程中发现，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，当碱性蛋白酶的用量为100-1000U/g，胰蛋白酶的用量为10-100U/g，风味蛋白酶的用量为10-50U/g时，有利于提高目标肽段在第三酶解液中的质量含量。
酶解处理结束后，为了进一步提高短肽的质量含量，可以在30-80℃以及0.2-0.4MPa的压差下，利用孔径为10-50nm的滤膜(例如陶瓷膜)对第三酶解液进行过滤，进一步截留分子量较大的成分，收集滤液。
进一步地，需要对滤液进行浓缩处理以缩小体系体积便于后处理。具体地，在40-60℃以及0.04±0.02MPa下，对滤液进行浓缩，直至浓缩液的固含量为20-50％或体系体积为原体积的1/4-1/5后停止浓缩。该固含量既有助于降低干燥能耗，也避免了固含量过高超过肽最大溶解度而出现沉淀的现象。
本发明还对浓缩液进行了热处理。在具体实施过程中，将浓缩液在80-100℃搅拌加热1-3h，优选地，在95-100℃搅拌加热2-3h，热处理结束后，发明人对体系进行检测，意外发现其中的目标肽段(pEE、pEK以及pER)的质量含量在第三酶解液的基础上得到显著的提升，具体地pEE的含量升高30％左右，pEK的含量升高35％左右、pER的含量升高45％左右。
为了进一步提高目标肽段的质量含量，本发明对热处理后的体系进行了树脂吸附处理。具体向热处理后的体系加入预处理好的100-200目的AG50W-X8阳离子交换树脂，搅拌处理1-2h，其中，阳离子交换树脂的质量为热处理后的浓缩液质量的5％。之后，过滤除去阳离子交换树脂，滤液灭菌，干燥，得到本发明的豌豆肽。其中，可在110-140℃下维持20-30s进行灭菌处理；干燥可具体为在140℃下喷雾干燥。
通过上述工艺，不仅能够得到肽段pEE、pEK以及pER，更能够使肽段pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g。此外，经过检测，该豌豆肽中分子量小于1000u的肽的质量含量≥85％，豌豆肽的质量含量≥75％。
本发明还提供上述豌豆肽在在降血糖产品中的应用，产品包括但不限于食品、保健品以及药品。
通过大量研究数据证明，本发明的肽段pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g的豌豆肽具有显著的降低血糖或控制血糖升高的能力，除常规意义上的保健应用外，更可用于降低血糖产品等，从而拓宽了豌豆的应用范围，为豌豆的深加工提供了新的方向。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明提供的豌豆肽，明确含有pEE、pEK以及pER功能肽段，且pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g，具有显著的降低血糖或控制血糖升高的功效，用于相关功能产品的原料，为豌豆肽产品提供了更为广泛的应用前景。
2、本发明提供的豌豆肽的制备方法，通过采用特殊的预处理、酶解以及后处理工艺，得到具有pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g的豌豆肽。
附图说明
图1为本发明实施例1中豌豆肽的分子量分布凝胶色谱图；
图2为本发明实施例及对比例中鉴定pEE、pEK以及pER所用的1μg/mL标样质谱图；
图3为本发明100μg/mL实施例1中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图；
图4为本发明实施例2中豌豆肽的分子量分布凝胶色谱图；
图5为本发明100μg/mL实施例2中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图；
图6为本发明实施例3中豌豆肽的分子量分布凝胶色谱图；
图7为本发明100μg/mL实施例3中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图；
图8为本发明100μg/mL对比例1中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图；
图9为本发明100μg/mL对比例2中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图；
图10为本发明100μg/mL对比例3中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图；
图11为本发明各试验组的空腹血糖水平示意图；
图12为本发明各试验组的空腹血糖水平又一示意图；
图13为本发明各试验组的糖耐受能力示意图；
图14为本发明各试验组的糖耐受能力又一示意图；
图15为本发明各试验组的胰岛素水平示意图；
图16为本发明各试验组的胰岛素水平又一示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和对比例中，碱性蛋白酶：杜邦丹尼斯克生产，酶活力为20万U/g；胰蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司生产，酶活力为5000U/g；风味蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司生产，酶活力为10000U/g。
实施例1
本实施例的豌豆肽按照以下方法制备得到：
1、将1000g蛋白质量含量为80％的豌豆蛋白粉溶于8L的70℃水中搅拌均匀，得到混合物；
将混合物放置到具有恒温功能的超声槽中，在70℃下，将超声槽开启并调至功率为400W，处理30min；
利用台式离心机在3000rpm下对超声处理过的混合物进行10min离心操作，收集固相沉淀；
向固相沉淀中加入纯水定容至5L，得到浆液；
2、用30％的NaOH溶液调节浆液pH至8.5后，在50℃保温条件下，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以500U/g加入碱性蛋白酶，酶解3小时，高温煮沸灭酶，得到第一酶解液；
3、对第一酶解液离心，收集离心上清液，待冷却至室温后，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，在40℃保温条件下，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以20U/g加入胰蛋白酶，酶解2小时，煮沸灭酶，得到第二酶解液；
4、待第二酶解液冷却至40℃后，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以10U/g加入风味蛋白酶，酶解0.5小时，煮沸灭酶，得到第三酶解液；
5、在60℃且膜进出口压力差为0.25MPa下，利用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对第三酶解液进行过滤，收集滤液约4.5L；
在50℃且0.02MPa下，对滤液进行浓缩至剩余约1.5L停止浓缩，此时测定浓缩液中可溶性干物质含量为25.8％；
对浓缩液进行加热，至90℃后开始保温2小时，之后，待体系冷却后，加入75g预处理好的100-200目粒径的AG50W-X8阳离子交换树脂，处理1小时，离心去除树脂，冷冻干燥(冷阱温度-60℃，真空度为0.09-0.098Mpa，24小时)，得到豌豆肽。
产物测定
1、采用国标方法对本实施例中的豌豆肽中各组分含量及分子量分布进行检测，其中：蛋白含量的检测方法为GB/T 5009.5，水分检测方法为GB/T5009.3，灰分的检测方法GB/T 5009.4，低聚肽含量及分子量的检测方法为GB/T 22492-2008大豆肽粉中附录规定的实验方法。
经检测，本实施例制得的豌豆肽的蛋白含量为90.3％(干基)，水分2.57％，灰分7.60％，豌豆肽的低聚肽的质量含量为85.8％，收率36.50％。
图1为本发明实施例1中豌豆肽的分子量分布凝胶色谱图，其中λ＝220nm。表1为实施例1中豌豆肽的分子量分布数据，其中分子量小于1000u的肽的质量含量为87.89％。
表1
Figure BDA0002252435360000091
2、豌豆肽中功能肽段pEE、pEK以及pER的含量检测
利用超高效液相色谱仪Nexera X2与三重四极杆质谱仪联用系统(岛津，日本)对本实施例中的豌豆肽中的肽组分进行鉴定。
液相色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3(5μm,2.1*250mm)；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-15min,B0-50％；15-20min,B 50-100％；20-25min,B 100％；25.1-35min,B 0％；流速：0.2mL/min；进样体积：1μL；柱温：40℃。
质谱条件：离子化模式：ESI,正离子模式；离子喷雾电压：+4.5kV；雾化气流速：氮气3.0L/min；加热气流速：氮气10L/min；干燥气流速：氮气10L/min；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；离子源温度：300℃；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：100ms；延迟时间：3ms；MRM参数：见表2。
表2
Figure BDA0002252435360000101
*表示定量离子
肽段标准品配制：分别准确称取pEE、pEK以及pER标准品粉末20.0mg，加水溶解，涡旋混匀，定容至100mL，即为200μg/mL的标准储备液。分别取500μL上述标准储备液，定容至10mL，即得混合标准母液10μg/mL。将上述混合标准母液用纯水逐级稀释至0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2.5、5和10μg/mL的系列标准工作溶液。
图2为本发明实施例及对比例中鉴定pEE、pEK以及pER所用的1μg/mL标样质谱图，图3为本发明100μg/mL实施例1中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图。
通过图3和图2的比对可知，本实施例1中的豌豆肽中同时存在肽段pEE、pEK以及pER。通过对实验谱图进行峰面积分，对比标准曲线可知：本实施例制备的豌豆肽中pEE含量为103.05mg/100g，pEK含量为82.18mg/100g，pER含量为93.77mg/100g。
实施例2
本实施例的豌豆肽按照以下方法制备得到：
1、将300kg蛋白质含量为80％的豌豆蛋白粉溶解于装有2m3温度为60℃水的发酵罐中，搅拌并定容至3m3，得到混合物；
发酵罐夹套不连续通蒸汽，维持罐内温度60-70℃，用泵将混合物在发酵罐与加装有超声震板的管道之间循环90min，其中，超声震板面积为3m2，超声功率45kW(2块0.5m*3m超声震板对放，震板效率1.5w/cm2)；
利用卧式螺旋沉降离心机在主电机转速3480rpm，副电机转速2860rpm下对超声处理过的混合物进行离心，收集固相沉淀；
将固相沉淀重新投入发酵罐并加水定容至1.5m3，搅拌，得到浆液；
2、用30％的NaOH溶液调节浆液pH至8.5后，夹套通蒸汽升温至罐内温度50℃，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以500U/g加入碱性蛋白酶，酶解3小时，利用板式换热器对酶解液进行灭酶，灭酶温度为125℃，得到第一酶解液；
3、对第一酶解液离心(离心条件与前述步骤条件相同)，收集离心上清液并输送至发酵罐中，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，向发酵罐夹套通热水至罐内温度40℃，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以20U/g加入胰蛋白酶，酶解2小时，利用板式换热器进行灭酶，灭酶温度为125℃，得到第二酶解液；
4、待第二酶解液冷却至40℃后，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以10U/g加入风味蛋白酶，酶解1小时，最后利用板式换热器对酶解液进行灭酶，灭酶温度为125℃，得到第三酶解液；
5、在60℃且膜进出口压力差为0.4MPa下，利用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对第三酶解液进行过滤，收集滤液；
在60℃且0.06MPa下，对滤液进行浓缩至剩余约500L停止浓缩，此时浓缩液中可溶性固形物含量为24.6％；
将浓缩液输送至发酵罐，对发酵罐夹套通蒸汽以对浓缩液进行加热，至90℃后开始搅拌并保温2小时，待体系冷却后，向发酵罐中加入25kg处理好的100-200目粒径的AG50W-X8阳离子交换树脂，处理1小时。离心去除树脂，滤液经灭菌(125℃，20秒，蒸汽板式换热)、喷雾干燥(进风温度140℃，出风温度95℃)后，制得豌豆肽。
产物测定
1、利用与实施例1相同的方法对本实施例的豌豆肽进行检测，本实施例制得的豌豆肽的蛋白含量为90.4％(干基)，水分5.25％，灰分6.88％，豌豆肽的低聚肽的质量含量为84.1％，收率37.84％。
图4为本发明实施例2中豌豆肽的分子量分布凝胶色谱图，其中λ＝220nm。表3为实施例2中豌豆肽的分子量分布数据，其中分子量小于1000u的肽的质量含量为88.93％。
表3
Figure BDA0002252435360000121
2、利用与实施例1相同的方法对本实施例的豌豆肽中的肽组分进行鉴定。
图5为本发明100μg/mL实施例2中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图。
通过图5和图2的比对可知，本实施例2中的豌豆肽中同时存在肽段pEE、pEK以及pER。通过对实验谱图进行峰面积分，对比标准曲线可知：本实施例2制备的豌豆肽中，pEE含量为104.59mg/100g，pEK含量为83.63mg/100g，pER含量为95.04mg/100g。
实施例3
1、将500g蛋白质量含量为60％的豌豆蛋白粉溶于2.5L的70℃水中，放置到具有恒温功能的超声槽中，搅拌均匀，升温至70℃并保温，超声处理，功率为100W，处理时间为30min；
利用台式离心机，以3000rpm转速，处理10min，收集固相沉淀；
向固相沉淀中加入纯水定容至2.5L，得到浆液；
2、用30％的NaOH溶液调节浆液pH至10.0，升温至50℃，保持恒温，搅拌，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，800U/g加入碱性蛋白酶，酶解3小时，高温煮沸灭酶，得到第一酶解液；
3、对第一酶解液离心，收集离心上清液，待冷却至室温后，用30％的NaOH溶液调节pH至7.5，升温至40℃，保持恒温，搅拌，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以80U/g加入胰蛋白酶进行酶解，酶解2小时，煮沸灭酶，得到第二酶解液；
4、待第二酶解液冷却至40℃后，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以40U/g加入风味蛋白酶，并保温，维持0.5小时后煮沸灭酶，得到第三酶解液。
5、利用孔径为40nm的无机陶瓷滤膜对冷却至约60℃的第三酶解液进行过滤，膜进出口压力差为0.25MPa，收集滤液约2.2L。在浓缩温度为60℃及浓缩压力0.02MPa条件下，对滤液进行浓缩至约600mL，此时测定可溶性干物质含量约为27.5％；
对浓缩液进行加热，至95℃后开始保温并计时，维持2.5小时。待冷却后，加入30g处理好的100-200目粒径的AG50W-X8，处理1小时。离心去除树脂，冷冻干燥，得到豌豆肽。
产物测定
1、利用与实施例1相同的方法对本实施例的豌豆肽进行检测，本实施例制得的豌豆肽的蛋白含量为88.4％(干基)，水分4.05％，灰分6.03％，豌豆肽的低聚肽的质量含量为80.6％，收率28.95％。
图6为本发明实施例3中豌豆肽的分子量分布凝胶色谱图，其中λ＝220nm。表4为实施例3中豌豆肽的分子量分布数据，其中分子量小于1000u的肽的质量含量为90.69％。
表4
Figure BDA0002252435360000131
Figure BDA0002252435360000141
2、利用与实施例1相同的方法对本实施例的豌豆肽中的肽组分进行鉴定。
图7为本发明100μg/mL实施例3中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图。
通过图7和图2的比对可知，本实施例3中的豌豆肽中同时存在肽段pEE、pEK以及pER。通过对实验谱图进行峰面积分，对比标准曲线可知：本实施例3制备的豌豆肽中，pEE含量为101.17mg/100g，pEK含量为82.22mg/100g，pER含量为91.01mg/100g。
对比例1
本对比例的豌豆肽按照以下方法制备得到：
1、将500g蛋白质量含量为80％的豌豆蛋白粉溶于5L水中，得到混合物；
将混合物放置到具有恒温功能的超声槽中，搅拌均匀，升温至70℃并保温，将超声槽开启，并调至功率为400W，处理30min；
利用台式离心机，以3000rpm转速，处理10min，收集固相沉淀；
向固相沉淀中加入纯水定容至2.5L，得到浆液；
2、用30％的NaOH溶液调节浆液pH至8.5后放置到恒温水浴中，升温至50℃，保持恒温，搅拌。基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以500U/g加入碱性蛋白酶，酶解3小时，高温煮沸灭酶，得到第一酶解液；
3、对第一酶解液离心，收集离心上清液，待冷却至室温后，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，在40℃保温条件下，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以20U/g加入胰蛋白酶，酶解2小时，煮沸灭酶，得到第二酶解液；
4、待第二酶解液冷却至40℃后，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以10U/g加入风味蛋白酶，酶解0.5小时，煮沸灭酶，得到第三酶解液；
5、在60℃且膜进出口压力差为0.2MPa下，利用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对第三酶解液进行过滤，收集滤液；
在60℃且0.02MPa下，对滤液进行浓缩至剩余约1L停止浓缩，此时测定浓缩液中可溶性干物质含量为26.5％；
将浓缩液利用抽滤透过预涂的薄层活性炭进行滤清，滤液冷冻干燥(冷阱温度-60℃，相对真空度为-0.09～-0.098Mpa)24小时，得到豌豆肽。
产物检测：
1、利用与实施例1相同的方法对本对比例的豌豆肽进行检测，本对比例制得的豌豆肽的蛋白含量为88.9％(干基)，水分4.22％，灰分8.55％，豌豆肽的低聚肽的质量含量为84.76％，收率34.00％。
2、利用与实施例1相同的方法对本对比例的豌豆肽中的肽组分进行鉴定。
图8为本发明100μg/mL对比例1中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图。
通过图8和图2的比对可知，本对比例1中的豌豆肽中同时存在肽段pEE、pEK以及pER。经检测，对比例1中制备的的豌豆肽中，pEE含量为77.60mg/100g，pEK含量为59.03mg/100g，pER含量为68.11mg/100g。
对比例2
本对比例的豌豆肽按照以下方法制备得到：
1、将500g蛋白质量含量为80％的豌豆蛋白粉溶于4L温水中搅拌均匀，得到混合物；
将混合物放置到具有恒温功能的超声槽中，在70℃下，将超声槽开启并调至功率为200W，处理30min；
利用台式离心机在3000rpm下对超声处理过的混合物进行10min离心操作，收集固相沉淀；
向固相沉淀中加入纯水定容至3L，得到浆液；
2、用30％的NaOH溶液调节浆液pH至8.5后，在50℃保温条件下，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，分别以500U/g、100U/g、50U/g一同混合加入碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶，酶解4小时。高温煮沸灭酶，离心，得到豌豆肽提粗溶液。
3、在60℃且膜进出口压力差为0.2MPa下，利用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对豌豆肽粗提取液进行过滤，收集滤液；
在55℃且0.02MPa下，对滤液进行浓缩至剩余约0.8L停止浓缩，此时测定浓缩液中可溶性干物质含量为24.0％；
3、对浓缩液进行加热，至90℃后开始保温并计时，维持2小时。待浓缩液冷却后，将浓缩液液利用抽滤透过预涂的薄层活性炭进行滤清；
向滤液中加入40g处理好的100-200目粒径的AG50W-X8，匀速搅拌，处理1小时。离心去除树脂，过滤后得到目标豌豆肽溶液。冷冻干燥(冷阱温度-60℃，相对真空度为-0.09～-0.098Mpa，24小时)，制得豌豆肽。
产物检测：
1、利用与实施例1相同的方法对本对比例的豌豆肽进行检测，本对比例制得的豌豆肽的蛋白含量为88.9％(干基)，水分4.22％，灰分8.55％，豌豆肽的低聚肽的质量含量为80.76％，收率34.00％。
2、利用与实施例1相同的方法对本对比例的豌豆肽中的肽组分进行鉴定。
图9为本发明100μg/mL对比例2中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图。
通过图9和图2的比对可知，本对比例2中的豌豆肽中同时存在肽段pEE、pEK以及pER，且所制备的豌豆肽中pEE含量为48.52mg/100g，pEK含量为43.85mg/100g，pER含量为43.59mg/100g。
对比例3
本对比例的豌豆肽按照以下方法制备得到
1、将500g蛋白质量含量为80％的豌豆蛋白粉溶于4L温水中，放置到具有恒温功能的超声槽中，搅拌均匀；
升温至70℃并保温，将超声槽开启，并调至功率为200W，处理30min；利用台式离心机，以3000rpm转速，处理10min，去除液相保留固相；
向固相蛋白中加入纯水定容至3L，得到浆液；
2、用30％的NaOH溶液调节浆液pH至8.5并升温至50℃。基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以500U/g加入碱性蛋白酶，酶解3小时。煮沸30分钟灭酶，离心，收集液相，得到一道酶解液；
待上步一道酶解液冷却至室温后，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，升温至40℃，保持恒温，搅拌。基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以20U/g加入胰蛋白酶，酶解2小时。煮沸30分钟灭酶，得到二道酶解液。
待二道酶解液冷却至40℃后，基于豌豆蛋白原料的蛋白含量，以10U/g加入风味蛋白酶，并保温，维持0.5小时。之后煮沸灭酶，得到豌豆肽提粗溶液。
3、在60℃且膜进出口压力差为0.2MPa下，利用孔径为20nm的无机陶瓷滤膜对豌豆肽粗提取液进行过滤，收集滤液；
在50℃且0.02MPa下，对滤液进行浓缩至剩余约0.8L停止浓缩，此时测定浓缩液中可溶性干物质含量为25.5％；
4、对浓缩液进行加热，至90℃后开始保温并计时，维持2小时。待浓缩液冷却后，将浓缩液液利用抽滤透过预涂的薄层活性炭进行滤清，得到豌豆肽溶液；
冷冻干燥(冷阱温度-60℃，相对真空度为-0.09～-0.098Mpa，24小时)制得豌豆肽。
产物检测：
1、利用与实施例1相同的而放大对本对比例的豌豆肽进行检测，本对比例中工艺条件制得的豌豆肽的蛋白含量为90.0％(干基)，水分5.11％，灰分5.95％，豌豆肽的低聚肽的质量含量为85.02％，收率35.08％；
2、利用与实施例1相同的方法对本对比例的豌豆肽中的肽组分进行鉴定。
图10为本发明100μg/mL对比例3中豌豆肽中pEE、pEK以及pER质谱图。
通过图10和图2的比对可知，本对比例3中的豌豆肽中同时存在肽段pEE、pEK以及pER，且所制备的豌豆肽中pEE含量为52.48mg/100g，pEK含量为41.53mg/100g，pER含量为43.59mg/100g。
利用下述方法对豌豆肽样品的降血糖功能进行评价。
将110只昆明小鼠称重后随机分为空白组、模型组、阳性组(二甲双胍185mg/kgBW)、实施例1-低剂量(800mg/kg BW)、实施例1-中剂量(1600mg/kg BW)、实施例1-高剂量(3200mg/kg BW)、实施例2(1600mg/kg BW)、实施例3(1600mg/kg BW)、对比例1(1600mg/kgBW)、对比例2(1600mg/kg BW)、对比例3(1600mg/kg BW)共11组，每组10只。空白组不做任何处理、其余10组高脂饲料喂养30天后，且用链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病，进行造模；除空白组和模型组，阳性组灌胃二甲双胍，实验组灌胃相应的豌豆肽，连续灌胃28天，测量以下指标：
a.空腹血糖水平测定
造模后，分别在1、7、14、21、28天，从11组小鼠尾巴尖端收集血样、测定空腹血糖浓度，每组根据10个数据的平均值计算曲下面积AUC。
b.糖耐受水平测定
在实验的最后一天，用豌豆肽处理后60分钟给11组小鼠灌胃葡萄糖(2g/kg)，在口服葡萄糖后0分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟时从尾尖采集血样，测定血糖浓度，每组根据10个数据的平均值计算曲下面积AUC。
c.胰岛素水平测定
在实验的最后一天，处死所有小鼠，收集样品血液并离心以获得血清，测定血清胰岛素浓度(μg/L)，每组根据10个数据的平均值计算血清胰岛素浓度。
试验例1
空腹血糖是糖尿病患者的主要指标，它决定了糖尿病的控制程度。空腹血糖水平由于各种组织对葡萄糖的利用减少而显著增加，这是胰岛素缺乏的典型症状。
图11为本发明各试验组的空腹血糖水平示意图，图12为本发明各试验组的空腹血糖水平又一示意图。如图11所示，模型组极显著提高了空腹血糖的水平，是空白组的4.32倍。阳性组和实施例组1-3能显著降低空腹血糖的水平，而对比例1-3组降低空腹血糖水平的效果并不明显。图12所示，中剂量组降低空腹血糖的能力最高。
试验例2
葡萄糖耐受是指机体对血糖浓度的调节能力，是糖尿病的一种检查方法。糖耐量检测值高，即糖耐受能力降低，使其血糖浓度不能恢复至正常水平，可能归因为胰岛素分泌减少、葡萄糖组织利用率降低或肝葡萄糖生成增加等。
图13为本发明各试验组的糖耐受能力示意图，图14为本发明各试验组的糖耐受能力又一示意图。如图13所示，模型组极显著提高了血糖浓度，是空白组的2.60倍，从而降低了糖耐受能力。阳性组和实施例组1-3能显著降低血糖浓度，提高耐受能力，其中实施例1效果最为明显。而对比例1-3组降低血糖浓度效果并不明显，不能提高糖耐受能力。图14所示，实施例1的三个剂量的豌豆肽均可降低血糖浓度，中剂量组降低血糖浓度的能力最高，提高糖耐受能力效果最好。
试验例3
胰岛素是胰岛素原酶解的产物，它控制蛋白质、糖、脂肪的代谢和储存。胰岛素进入肝脏后，与肝细胞膜上的胰岛素受体结合并沿着PI3K/Akt/GLUT4信号通路级联，从而调节糖原合成和血糖稳定，是机体内唯一降低血糖的激素，胰岛素水平的测定对糖尿病控制有着重要作用。
图15为本发明各试验组的胰岛素水平示意图，图16为本发明各试验组的胰岛素水平又一示意图。如图15所示，模型组极显著降低了胰岛素浓度，是空白组的0.63倍。阳性组和实施例组1-3能显著提高胰岛素的浓度，而对比例1-3组提高胰岛素浓度的效果并不明显。图16所示，实施例1的三个剂量的豌豆肽均可提高胰岛素水平，中剂量组提高胰岛素浓度的能力最高，降血糖效果最好。
图11-图16中，“**”代表与空白组比较，P<0.01；“#”代表与模型组比较，P<0.05；“##”代表与模型组比较，P<0.01。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种具有辅助降血糖功能的豌豆肽，其特征在于，所述豌豆肽组成中至少包括肽段pEE、pEK以及pER；
基于所述豌豆肽的质量，所述肽段pEE的含量为≥100.00mg/100g、肽段pEK的含量为≥80.00mg/100g以及肽段pER的含量为≥90.00mg/100g。
2.根据权利要求1所述的豌豆肽，其特征在于，所述豌豆肽中分子量小于1000u的肽的质量含量≥85％。
3.根据权利要求1所述的豌豆肽，其特征在于，所述豌豆肽是通过对豌豆蛋白原料依次进行超声处理、酶解处理、过滤处理、热处理和纯化处理而得到的；
其中，所述酶解处理包括依次使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶进行三段酶解；
所述热处理包括在80-100℃下加热1-3h。
4.一种权利要求1-3任一项所述的豌豆肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对豌豆蛋白原料与水的混合物进行超声处理后实施固液分离，收集沉淀，向所述沉淀加水制成浆液；
2)调节所述浆液的pH值后加入碱性蛋白酶进行第一酶解，搅拌2-4h后灭酶，得到第一酶解液；
3)将所述第一酶解液离心，向离心上清液加入胰蛋白酶进行第二酶解，搅拌2-3h后灭酶，得到第二酶解液；
4)向所述第二酶解液中加入风味蛋白酶，搅拌0.5-1h后灭酶，得到第三酶解液；
5)对所述第三酶解液进行过滤并浓缩滤液，在80-100℃加热浓缩液1-3h后进行树脂吸附处理，得到所述豌豆肽。
5.根据权利要求4所述的豌豆肽的制备方法，其特征在于，所述超声处理的温度为70-90℃，且基于所述豌豆蛋白原料，超声功率为100-800W/kg，时间为30-90min/kg。
6.根据权利要求4所述的豌豆肽的制备方法，其特征在于，基于所述豌豆蛋白原料的蛋白含量，所述碱性蛋白酶的用量为100-1000U/g，所述胰蛋白酶的用量为10-100U/g，所述风味蛋白酶的用量为10-50U/g。
7.根据权利要求4所述的豌豆肽的制备方法，其特征在于，所述过滤包括：在30-80℃以及0.2-0.4MPa的压差下，利用孔径为10-50nm的滤膜对所述第三酶解液进行过滤，收集滤液。
8.根据权利要求4所述的豌豆肽的制备方法，其特征在于，所述浓缩包括：在40-60℃以及0.04±0.02MPa下，对所述滤液进行浓缩，得到固含量为20-50％的浓缩液。
9.根据权利要求4所述的豌豆肽的制备方法，其特征在于，所述树脂吸附处理包括：向加热后的浓缩液中加入阳离子交换树脂，搅拌1-2h后实施固液分离，收集滤液。
10.权利要求1-3任一项所述的豌豆肽在降血糖产品中的应用。
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