CN113951498B - 耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂及其制备方法 - Google Patents
耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白‑米糠多糖乳化剂及其制备方法，所述糖基化蛋白‑米糠多糖乳化剂由乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合而成。本发明提供一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白‑米糠多糖乳化剂及其制备方法，选择米糠多糖修饰WPI，发挥两者的协同作用，优化WPI的乳化性、耐热性、耐酸性等功能特性，不仅可得到高效稳定的新型乳化剂，还可开拓米糠多糖应用领域，对推动我国水稻产业绿色高效加工发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工领域。更具体地说，本发明涉及一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂及其制备方法。
背景技术
乳液是指一种液体以液滴的形式分散于与其互不相溶的另外一种液体中，主要包括水包油(O/W)与油包水(W/O)两种类型。乳液是一种热力学不稳定体系，在加工贮存过程中易产生相分离、絮凝、聚结等失稳现象。目前，在实际的乳液基食品加工中通常采用的是合成类乳化剂。然而，研究人员发现，合成类乳化剂会潜在增加结肠炎、代谢综合征以及其他慢性疾病的风险。基于目前合成类乳化剂仍存在着乳化稳定性、安全性欠佳等问题，寻求天然高分子乳化剂代替合成类乳化剂将是食品产业的一个重要趋势。蛋白质是常用的一种天然乳化剂，然而蛋白类乳化剂制备的乳液对温度、pH值、盐离子等敏感，环境因子的改变会导致乳液的失稳。近年来，通过美拉德反应方式将乳化稳定性较强的蛋白质与多糖结合构建新型乳化剂成为国内外研究者关注的热点。
乳清分离蛋白(WPI)是干酪生产过程中的副产品乳清经特殊工艺处理而得到的一类蛋白质，易消化吸收、营养价值高，含有多种必需氨基酸与生物活性成分。WPI具有优异的乳化性和凝胶性，是一种良好的乳液制备原料，其分子中含有两性基团，有极佳的表面活性，从而使其具备优良的乳化特性，当WPI溶解于水中时，其亲水性基团朝向外侧，而疏水基团聚集朝内，在均质过程中，WPI能快速地吸附在油脂表面，紧密地包裹住脂肪微滴，可形成较为稳定的油水界面,形成水包油型胶束，使油水体系保持平衡，从而有效的防止油脂在溶液表面聚集。但高温、高盐和酸性等因素是食品工业生产中经常面临的工艺条件，WPI在这些环境因素的诱导下会发生变性或聚集，导致产品的品质不稳定。近年来的研究表明，以美拉德反应为机理的蛋白质-糖接枝改性可以有效改善乳清蛋白的功能特性，且该反应不需要添加任何化学试剂作为催化剂，仅需加热就可激发该反应自发进行，采用美拉德反应途径改性后的WPI乳化性、热稳定性等均显著改善。
米糠是稻米加工的副产品，我国米糠资源丰富，每年米糠产量约1694万t，米糠中含有丰富的脂肪、蛋白质、纤维、矿物质以及一些生物活性化合物，但其综合利用率较低，利用率不到20％，米糠多糖(RBP)是米糠中最具开发价值的功能成分之一，研究表明米糠中含有丰富的营养成分以及多种活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂和降血糖等多种生理功能活性。多糖是生物体内重要组成成分，它是构成生物有机体内源性生物活性分子的重要成分，是当前生命科学研究的热点之一。因此探索米糠多糖在口服递送系统的应用开发将为米糠的高值利用提供技术理论支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂及其制备方法，选择米糠多糖修饰WPI，发挥两者的协同作用，优化WPI的乳化性、耐热性、耐酸性等功能特性，不仅可得到高效稳定的新型乳化剂，还可开拓米糠多糖应用领域，对推动我国水稻产业绿色高效加工发展具有重要意义。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂，所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂由乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合而成。
优选的是，所述的一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂中，所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂由乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液按1：1的质量比混合而成。
本发明还提供一种上述耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合，搅拌均匀后，并将其pH调节至8.0，置于2-6℃的条件下静置10-16小时，得到混合溶液；
S2、将S1中得到所述混合溶液置于-80℃的条件下冷冻干燥2-3天，然后将得到的冻干粉过80-120目筛后置于温度为50-70℃、相对湿度为75-85％的条件下反应6-18小时后，迅速转移至-20℃的条件下终止美拉德反应的进行，得到糖基化乳清分离蛋白；
S3、将S2中得到的所述糖基化乳清分离蛋白与pH为7.0的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1％的蛋白溶液；
S4、在S3中得到的所述蛋白溶液中加入大豆油，并于10000r/min的条件下高速分散5min，得到粗乳液；
S5、将S4中得到的所述乳液均值处理，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
优选的是，所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法中，S1中将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合后置于磁力搅拌器中搅拌10-16小时后，再调节pH。
优选的是，所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法中，S2中将得到的冻干粉过筛后置于温度为60℃、相对湿度为79％的条件下反应。
优选的是，所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法中，S3中所有的磷酸盐缓冲液为20mM PBS。
优选的是，所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法中，S5中将S4中得到的所述乳液于均质压力为4000-16000psi的条件下均质处理2-10次，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的制备方法，通过对乳清蛋白进行糖基化改性，在保留了蛋白原有营养价值的基础上改善了其功能特性；
(2)本发明所得的米糠多糖-乳清蛋白接枝物与原WPI相比，接枝物的乳化活性EAI和乳化稳定性ESI分别增加了2.8倍和4倍，乳化性能明显改善。
(3)本发明提供的制备方法，使用干热法将米糠多糖与乳清蛋白共价结合，操作简单、绿色健康。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例1制备的WPI及WPI-RBP接枝物A294 nm及A420 nm变化示意图；
图2为实施例1制备的WPI及WPI-RBP接枝物反应的乳化活性和乳化稳定性示意图；
图3为实施例2制备的纳米乳液粒径和PDI受均质次数的影响示意图；
图4为实施例3制备的纳米乳液粒径和PDI受均质压强的影响示意图；
图5pH对实施例4制备的纳米乳液粒径的影响示意图；
图6盐离子浓度对实施例4制备的纳米乳液粒径的影响示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
一种耐酸、耐盐糖基化米糠多糖-乳清蛋白乳化剂的的制备方法，包括以下步骤：
(1)将WPI与RBP按照1:1(w:w)比例溶于0.1M的PBS缓冲液(pH＝8.0)中，保证固形物含量为6％，调节溶液pH至8.0，在恒温磁力搅拌器中连续搅拌12h
(2)将步骤(1)所述溶液充分混合后冷冻干燥，冻干后的粉状物过100目筛后放置于干燥器中(容器底部放置饱和KBr溶液)，将干燥器置于鼓风干燥箱中并调节温度60℃从而保持干燥器内相对湿度为79％，反应6，12，18h后即得乳清分离蛋白-米糠多糖接枝物，所得产物置于-20℃冰箱中储存。
本实施例考察了米糠多糖与乳清蛋白在干热条件下反应不同时间(分别为6h,12h,18h)下获得的乳清蛋白-米糠多糖复合物。用超纯水稀释蛋白样品至2.5mg/mL，以超纯水作空白样，采用紫外-可见分光光度计测定A420 nm，即产物的褐变程度；而美拉德反应的中间产物常用294nm下的吸光值表示，将待测样品稀释到1mg/mL，测定A294nm如图1所示，通过测定蛋白样品的294nm的吸光度及褐变程度可以看出随着美拉德反应时间的增长，WPI-RBP接枝物在294nm和420nm的吸光度均显著上升(P＜0.05)，说明体系发生了美拉德反应，在干热处理过程中，WPI的结构部分展开，蛋白质的ε-氨基与米糠多糖的羰基受热结合在一起，生成了中间产物；同时，部分中间产物发生凝聚聚合生成类黑素，使体系的褐变程度上升。
本发明对实施例1制备的糖基化米糠多糖-乳清蛋白的乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)进行测试
该测试包括：
取实施1制备的糖基化米糠多糖-乳清蛋白0.1g溶于10mL 0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中，加入4mL的大豆油，在10000r/min高速分散3min后，分别于0min和10min时从溶液底部吸取50μL乳浊液，加到5mL、0.1％SDS溶液中，于500nm处测定吸光值，以0.1％SDS溶液为空白。
如图2所示，随干热时间的延长，WPI-RBP共聚物的乳化性显著增强(P<0.05)，糖基化反应显著改善了乳清蛋白的乳化活性和乳化稳定性(P＜0.05)，一方面米糠多糖接枝到蛋白上后，带来的空间位阻效应能使得接枝物更加紧密地吸附在油-水界面上，形成致密的界面膜，从而提高了乳清分离蛋白的乳化活性，另一反面加热会让WPI的疏水基团暴露，提高了其乳化性。
<实施例2>
一种耐酸、耐盐糖基化米糠多糖-乳清蛋白乳化剂的的制备方法，包括以下步骤：
(1)将WPI与RBP按照1:1(w:w)比例溶于0.1M的PBS缓冲液(pH＝8.0)中，保证固形物含量为6％，调节溶液pH至8.0，在恒温磁力搅拌器中连续搅拌12h
(2)将步骤(1)所述溶液充分混合后冷冻干燥，冻干后的粉状物过100目筛后放置于干燥器中(容器底部放置饱和KBr溶液)，将干燥器置于鼓风干燥箱中并调节温度60℃从而保持干燥器内相对湿度为79％，反应12h后即得乳清分离蛋白-米糠多糖接枝物，所得产物置于-20℃冰箱中储存。
(3)将糖基化乳清分离蛋白溶解于PH为7.0的磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1％的蛋白溶液；
(4)将4g大豆油加入步骤(3)所述的蛋白溶液中，10000r/min高速分散5min得到粗乳液；将粗乳液均质处理，得到纳米乳液，均质压力为10000psi,均质次数为2-8次。
本实施例考察了糖基化米糠多糖-乳清蛋白在均质次数为2-8次(2,4,6,8,10)得到的大豆油纳米乳液。图3反应了随均质次数的增加，粒径和PDI呈先减小后增大的趋势，均质循环6次测得的粒径和PDI较小，这是因为在均质过程中随着均质次数的增加，乳液的粒径会更小，粒径分布更均匀，乳液分散的更稳定，但随着均质次数的继续增加，粒径又会有增加的趋势，乳液变得不稳定，可能是因为均质次数增加，导致乳液温度升高，打破了已形成的乳液体系，乳液失稳。
<实施例3>
一种耐酸、耐盐糖基化米糠多糖-乳清蛋白乳化剂的的制备方法，包括以下步骤：
(1)将WPI与RBP按照1:1(w:w)比例溶于0.1M的PBS缓冲液(pH＝8.0)中，保证固形物含量为6％，调节溶液pH至8.0，在恒温磁力搅拌器中连续搅拌12h。
(2)将步骤(1)所述溶液充分混合后冷冻干燥，冻干后的粉状物过100目筛后放置于干燥器中(容器底部放置饱和KBr溶液)，将干燥器置于鼓风干燥箱中并调节温度60℃从而保持干燥器内相对湿度为79％，反应12h后即得乳清分离蛋白-米糠多糖接枝物，所得产物置于-20℃冰箱中储存。
(3)将糖基化乳清分离蛋白溶解于PH为7.0的磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1％的蛋白溶液；
(4)将4g大豆油加入步骤(3)所述的蛋白溶液中，10000r/min高速分散5min得到粗乳液；将粗乳液均质处理，得到纳米乳液，均质压力为4000-16000psi,均质次数为6次。
本实施例考察了糖基化米糠多糖-乳清蛋白在均质压力为4000-16000psi
(4000psi,7000psi,10000psi,13000psi,16000psi)得到的大豆油纳米乳液。图4反应了随压强的增加，粒径和PDI呈下降的趋势，在压强为16000psi时，粒径和PDI最小，考虑到均质机在压力过大处于自我保护会制停，且压力过大时，温度会随之升高，会造成油脂的氧化，因此选择均质压强为16000psi。
<实施例4>
一种耐酸、耐盐糖基化米糠多糖-乳清蛋白乳化剂的的制备方法，包括以下步骤：
(1)将WPI与RBP按照1:1(w:w)比例溶于0.1M的PBS缓冲液(pH＝8.0)中，保证固形物含量为6％，调节溶液pH至8.0，在恒温磁力搅拌器中连续搅拌12h
(2)将步骤(1)所述溶液充分混合后冷冻干燥，冻干后的粉状物过100目筛后放置于干燥器中(容器底部放置饱和KBr溶液)，将干燥器置于鼓风干燥箱中并调节温度60℃从而保持干燥器内相对湿度为79％，反应12h后即得乳清分离蛋白-米糠多糖接枝物，所得产物置于-20℃冰箱中储存。
(3)将糖基化乳清分离蛋白溶解于PH为7.0的磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1％的蛋白溶液；
(4)将4g大豆油加入步骤(3)所述的蛋白溶液中，10000r/min高速分散5min得到粗乳液；将粗乳液均质处理，得到纳米乳液，均质压力为16000psi,均质次数为6次。
本实施例考察了WPI-RBP包载脂溶性营养素的纳米乳液在pH影响下粒径的变化情况，如图5所示，糖基化WPI-RBP(12h)稳定的乳液随pH变化乳液稳定性显著高于WPI制备的纳米乳液，WPI在pH为5时的粒径为704.47，PDI达到0.367，乳液失衡，而WPI-RBP粒径仅为224.03，这是因为WPI的等电点在5左右，蛋白质在等电点附近，由于此时净电荷为0，因失去静电斥力作用，分子间作用力减弱，蛋白质发生絮凝，沉淀。美拉德改性后等电点偏移到4，但其粒径为335.07，PDI为0.251仍小于原WPI的粒径和PDI，改性后的WPI共价接入米糠多糖糖链后，亲水性提高，WPI在等电点处的溶解性增大，阻止了蛋白的聚集。
本实施例考察了WPI-RBP包载脂溶性营养素的纳米乳液在盐离子影响下粒径的变化情况，如图6所示，改性后乳液较为稳定，且分散均匀，PDI在0.2左右。WPI在NaCl浓度为0.5mol/L时，粒径相比WPI-RBP接枝物增加了19％，PDI接近0.3，在盐离子存在下WPI由于盐析作用会发生沉淀，糖基化改性后蛋白质在一定程度上能够抵抗盐离子对体系的影响，提高乳液的稳定性。
因而综合看来，WPI和RBP干法条件下反应12h制备的糖基化改性WPI极大地改善了蛋白的性质，可作为一种新型乳化剂包埋脂溶性物质。
<实施例5>
一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂中，所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂由乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液按1：1的质量比混合而成。
上述耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合，搅拌均匀后，并将其pH调节至8.0，置于2℃的条件下静置10小时，得到混合溶液；
S2、将S1中得到所述混合溶液置于-80℃的条件下冷冻干燥2天，然后将得到的冻干粉过80目筛后置于温度为50℃、相对湿度为75％的条件下反应6小时后，迅速转移至-20℃的条件下终止美拉德反应的进行，得到糖基化乳清分离蛋白；
S3、将S2中得到的所述糖基化乳清分离蛋白与pH为7.0的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1％的蛋白溶液；
S4、在S3中得到的所述蛋白溶液中加入大豆油，并于10000r/min的条件下高速分散5min，得到粗乳液；
S5、将S4中得到的所述乳液均值处理，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
其中，S1中将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合后置于磁力搅拌器中搅拌10小时后，再调节pH。
其中，S3中所有的磷酸盐缓冲液为20mM PBS。
其中，S5中将S4中得到的所述乳液于均质压力为4000psi的条件下均质处理2次，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
<实施例6>
一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂中，所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂由乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液按1：1的质量比混合而成。
上述耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合，搅拌均匀后，并将其pH调节至8.0，置于4℃的条件下静置12小时，得到混合溶液；
S2、将S1中得到所述混合溶液置于-80℃的条件下冷冻干燥3天，然后将得到的冻干粉过100目筛后置于温度为60℃、相对湿度为79％的条件下反应12小时后，迅速转移至-20℃的条件下终止美拉德反应的进行，得到糖基化乳清分离蛋白；
S3、将S2中得到的所述糖基化乳清分离蛋白与pH为7.0的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1％的蛋白溶液；
S4、在S3中得到的所述蛋白溶液中加入大豆油，并于10000r/min的条件下高速分散5min，得到粗乳液；
S5、将S4中得到的所述乳液均值处理，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
其中，S1中将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合后置于磁力搅拌器中搅拌13小时后，再调节pH。
其中，S3中所有的磷酸盐缓冲液为20mM PBS。
其中，S5中将S4中得到的所述乳液于均质压力为10000psi的条件下均质处理6次，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
<实施例7>
一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂中，所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂由乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液按1：1的质量比混合而成。
上述耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合，搅拌均匀后，并将其pH调节至8.0，置于6℃的条件下静置16小时，得到混合溶液；
S2、将S1中得到所述混合溶液置于-80℃的条件下冷冻干燥3天，然后将得到的冻干粉过120目筛后置于温度为70℃、相对湿度为85％的条件下反应18小时后，迅速转移至-20℃的条件下终止美拉德反应的进行，得到糖基化乳清分离蛋白；
S3、将S2中得到的所述糖基化乳清分离蛋白与pH为7.0的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1％的蛋白溶液；
S4、在S3中得到的所述蛋白溶液中加入大豆油，并于10000r/min的条件下高速分散5min，得到粗乳液；
S5、将S4中得到的所述乳液均值处理，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
其中，S1中将配方份的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合后置于磁力搅拌器中搅拌16小时后，再调节pH。
其中，S3中所有的磷酸盐缓冲液为20mM PBS。
其中，S5中将S4中得到的所述乳液于均质压力为16000psi的条件下均质处理10次，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (4)
1.一种耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将质量比为1:1的乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合，搅拌均匀后，并将其pH调节至8.0，置于2-6℃的条件下静置10-16小时，得到混合溶液；
S2、将S1中得到所述混合溶液置于-80℃的条件下冷冻干燥2-3天，然后将得到的冻干粉过80-120目筛后置于温度为50-70℃、相对湿度为75-85%的条件下反应6-18小时后，迅速转移至-20℃的条件下终止美拉德反应的进行，得到糖基化乳清分离蛋白；
S3、将S2中得到的所述糖基化乳清分离蛋白与pH为7.0的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1%的蛋白溶液；
S4、在S3中得到的所述蛋白溶液中加入大豆油，并于10000r/min的条件下高速分散5min，得到粗乳液；
S5、将S4中得到的所述粗乳液于均质压力为4000-16000psi的条件下均质处理2-10次，即制得所述糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂。
2.如权利要求1所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，其特征在于， S1中将乳清分离蛋白溶液和米糠多糖溶液混合后置于磁力搅拌器中搅拌10-16小时后，再调节pH。
3.如权利要求1所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，其特征在于，S2中将得到的冻干粉过筛后置于温度为60℃、相对湿度为79%的条件下反应。
4.如权利要求1所述的耐酸、耐盐的糖基化蛋白-米糠多糖乳化剂的制备方法，其特征在于，S3中所述的磷酸盐缓冲液为20 mM PBS。
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