CN113693239A - 一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖基化蛋白‑茶油纳米乳液及其制备方法，属于食品科学与工程技术领域。本发明以糖基化蛋白溶液为水相，向水相中加入茶油，均质、超声处理得到糖基化蛋白‑茶油纳米乳液。本发明将超声处理应用在糖基化蛋白‑茶油纳米乳液的制备过程中，在提高生产率，缩短处理时间，简化操作和节省成本的同时，进一步减小了乳液的粒径，提升了乳液的分散性。本发明在糖基化蛋白溶液的制备过程中添加叠氮化钠，一方面能够抑制微生物的生长，使糖基化蛋白溶液可以长时间放置，另一方面能够增强糖基化蛋白溶液的稳定性，利于后续试验乳液的制备。
Description
技术领域
本发明涉及食品科学与工程技术领域，特别是涉及一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液及其制备方法。
背景技术
油茶是我国特有的木本植物油料，油茶成熟种子中提取的油料称为油茶籽油，简称茶油。茶油中不饱和脂肪酸高达90％以上，其中，油酸达到80-83％，亚油酸达到7-13％，油酸及亚油酸含量均高于橄榄油，更加高于不饱和脂肪酸含量80％以上花生油；不饱和脂肪酸的高含量使得茶油具有降血压、降血脂预防心血管硬化、抗肝炎、防癌症等功效的同时，具有比花生油等常用食用油更加不稳定的性质。这也是目前茶油开发利用受限的主要原因。
发明内容
本发明的目的是提供一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，提升茶油的稳定性，进而提升其开发利用度。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明技术方案之一，一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以糖基化蛋白溶液为水相，向水相中加入茶油，均质、超声处理得到糖基化蛋白-茶油纳米乳液。
进一步地，所述糖基化蛋白溶液通过将糖基化蛋白加入到水中得到；所述糖基化蛋白溶液中糖基化蛋白的浓度为10mg/mL。
进一步地，所述糖基化蛋白的制备方法包括以下步骤：将乳清分离蛋白(WPI)和D-(+)乳糖按质量比1:1溶解于超纯水中得到混合溶液，溶液pH用0.5M NaOH调节为pH7，这样可以使蛋白溶液远离等电点进一步增加溶解度，WPI和D-(+)乳糖占混合溶液质量的10％，将混合溶液在恒温搅拌台上25℃搅拌12h，然后存放于温度为-20℃的冰箱冰冻48小时，充分冷冻后取出于冷冻干燥机中于真空条件下冻干三天得到粉末，之后将粉末置于相对湿度为79％，温度为70℃的恒温恒湿培养箱中24h，得到糖基化蛋白粉末。
本发明在冻干前增加了在-20℃冰冻的步骤，能够起到预处理作用。
进一步地，所述糖基化蛋白溶液中还添加了叠氮化钠。
进一步地，所述叠氮化钠的添加量为所述糖基化蛋白溶液质量的万分之一至万分之五。
进一步地，将糖基化蛋白加入到水中后还包括于25℃，500r/min的条件下恒温搅拌2h的步骤。
进一步地，所述糖基化蛋白-茶油纳米乳液中茶油的质量分数为10％。
进一步地，所述均质具体为12000r/min条件下均质2min。
进一步地，所述超声处理具体为45℃、450W条件下超声10min。
本发明技术方案之二，上述制备方法制备得到的糖基化蛋白-茶油纳米乳液。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明将蛋白质进行糖基化改性，利用多羟基的糖分子与蛋白质分子上的ε-氨基酸通过共价键结合形成糖基化蛋白，通过糖基基团的空间位阻阻止蛋白质的聚集，从而赋予蛋白溶液、乳液更强的稳定性。
(2)本发明将超声处理应用在糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备过程中，在提高生产率，缩短处理时间，简化操作和节省成本的同时，进一步减小了乳液的粒径，提升了乳液的分散性。
(3)本发明在糖基化蛋白溶液的制备过程中添加叠氮化钠，一方面能够抑制微生物的生长，使糖基化蛋白溶液可以长时间放置，另一方面能够增强糖基化蛋白溶液的稳定性，利于后续试验乳液的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的超声条件优化图；其中，图(A)为超声功率优化图，图(B)为超声时间优化图；
图2为实施例1制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的pH稳定性图；
图3为实施例1制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的热稳定性图；
图4为实施例1制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的贮藏稳定性图；
图5为实施例1制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的氧化稳定性图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述室温，如无特殊说明均是指20-25℃。
实施例1
步骤1，糖基化蛋白的制备：将乳清分离蛋白(WPI)和D-(+)乳糖按质量比1:1溶解于超纯水中得到混合溶液，WPI和D-(+)乳糖占混合溶液质量的10％，溶液pH用0.5M NaOH调节为pH7，将混合溶液在恒温搅拌台上25℃搅拌12h，然后存放于温度为-20℃的冰箱冰冻，48h后取出于冷冻干燥机中冻干三天得到粉末，之后将粉末置于相对湿度为79％，温度为70℃的恒温恒湿培养箱中24h，得到糖基化蛋白粉末；
步骤2，糖基化蛋白溶液的制备：将糖基化蛋白粉末充分溶解于超纯水中，于25℃，500r/min的条件下恒温搅拌2h后，加入糖基化蛋白溶液万分之二质量分数的叠氮化钠，得到糖基化蛋白溶液(溶液中糖基化蛋白的浓度为10mg/mL)，之后于4℃冰箱中贮存备用；
步骤3，糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备：取出糖基化蛋白溶液，待其待恢复室温后作为水相，向水相中加入10％质量分数的茶油，于12000r/min条件下均质2min，之后于45℃、450W条件下超声10min，得到糖基化蛋白-茶油纳米乳液。
结果：本实施例制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的超声条件优化图如图1所示；其中，图(A)为超声功率优化图，图(B)为超声时间优化图；由图1可知，当超声功率小于400w时，乳液的粒径和乳液分散性系数(PDI)都较大，这可能是由于超声功率不够，油滴未能被乳化剂完全包裹，导致粒径偏大，不均匀程度增加。超声功率在400w和450w时，乳液的粒径差别不大，但PDI出现明显变化，功率为450w时两种乳液的PDI均小于0.3，这说明此条件下的乳液较均匀、分散性较好。在功率450w时超声处理，随着超声时间的延长乳液粒径和PDI数值呈现先减小后升高的趋势，在10min制得的乳液粒径最小为200-250nm，且PDI数值小，乳液分散性高，稳定性好。
本实施例制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的pH稳定性图如图2所示；由于WPI的等电点为4.8～5.2,因此在pH5附近蛋白中的氨基酸与氢离子结合,蛋白质结构较为紧密,阻碍了其在茶油油滴上的吸附,导致所制得乳液不稳定粒径显著增大。但是由2图能够看出，在乳液pH从9到2逐渐降低时，糖基化蛋白-茶油纳米乳液(WPI-Lac-茶油纳米乳液)始终比未糖基化的蛋白-茶油纳米乳液(WPI-茶油纳米乳液)要更稳定，这归因于D-乳糖的还原端碳基与WPI氨基在湿热条件下产生化学交联，导致WPI结构发生改变，提高了蛋白等电点附近的溶解性与其pH稳定性。在茶油相关的强酸性和弱碱性工业生产中，使用糖基化蛋白(WPI-Lac)作乳化剂制作的乳液更稳定，能更好的保护茶油，使其最终发挥自身功能价值。
本实施例制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的热稳定性图如图3所示；由图3能够看出，经D-乳糖糖基化改性之后的乳清分离蛋白制备的茶油纳米乳液热稳定性显著提高。随着温度的升高，WPI稳定乳液粒径和乳液分散性系数(PDI)显著增大，这是因为较高温度会使乳液结构发生变化，随着温度越来越高，蛋白部分的变性程度增加，对茶油的乳化能力逐渐降低。相比之下由于WPI-Lac热稳定性增强，糖基基团还可以通过空间位阻阻止蛋白质聚集，由WPI-Lac稳定的茶油乳液在不同温度下粒径变化较小、分散性好，且在70℃时粒径最小。乳液粒径在70℃时有小幅降低，后升温后显著升高，这是由于高温下部分蛋白热变性导致无法稳定乳液而结构崩塌，所以平均粒径小幅降低，后续温度继续升高，乳液开始热聚集所以粒径显著升高。两条曲线对比，说明纯WPI稳定纳米乳液特受温度影响严重，而WPI-Lac稳定纳米乳液在高温下更加稳定。
本实施例制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的贮藏稳定性图如图4所示；由图4能够看出，经糖基化改性后WPI-Lac制备的茶油乳液粒径增幅较没改性的要小，储藏相同时间时WPI-Lac-茶油纳米乳液的粒径比WPI-茶油纳米乳液的粒径要小，说明WPI-Lac-茶油纳米乳液的储藏稳定性更好。
本实施例制备的糖基化蛋白-茶油纳米乳液的氧化稳定性图如图5所示；由图5能够看出，两种茶油纳米乳液在图中都呈现了过氧化值随时间明显的上升趋势，但上升的较缓慢，说明乳液中的过氧化物随着天数的增加而增加的较少。观察纵坐标可以看出，14天的储藏过程中，乳液中过氧化物的浓度都很低，说明乳液中过氧化物的含量都很少，说明茶油被保护的较好，被氧化的程度较低。还能够看出，糖基化蛋白稳定的茶油纳米乳液中过氧化值始终低于原蛋白稳定的茶油纳米乳液，说明了超声均质得到的糖基化蛋白-茶油纳米乳液具有更好的氧化稳定性。因此使用乳糖改性后的乳清分离蛋白做乳化剂，包裹茶油油滴，可使乳液更稳定，茶油功效时间更长。
实施例2
与实施例1相同，区别在于，叠氮化钠的添加量为糖基化蛋白溶液质量的万分之一。
结果：进行与实施例1相同的试验，试验结果相似，这里不再赘述。
实施例3
与实施例1相同，区别在于，叠氮化钠的添加量为糖基化蛋白溶液质量的万分之五。
结果：进行与实施例1相同的试验，试验结果相似，这里不再赘述。
对比例1
1)糖基化反应产物的制备
将质量比为1:1的乳清分离蛋白与D-(+)乳糖于水中混合溶解，得到混合溶液，混合溶液中蛋白和D-(+)乳糖的总含量为10wt％，并调节混合溶液的pH至6.5～7.5；将混合溶液于冷冻干燥机冻干三天，得到乳清分离蛋白-乳糖混合粉末；将乳清分离蛋白-乳糖混合粉末进行美拉德反应，美拉德反应的条件为：空气湿度为75％、温度为68℃、反应时间为18h，得到糖基化乳清分离蛋白粉末。
2)糖基化乳清分离蛋白-多酚复合物的制备
将糖基化乳清分离蛋白粉末与水混合得到5mg/mL的糖基化乳清分离蛋白溶液，加入表没食子儿茶素没食子酸酯，调节溶液的pH至3.0，充分混合至混合溶液呈乳白色，得到糖基化乳清分离蛋白-多酚复合物(WPI-Lac/EGCG)，糖基化乳清分离蛋白粉末与表没食子儿茶素没食子酸酯的质量比为1:1。
3)糖基化乳清分离蛋白-多酚Pickering乳液的制备
将糖基化乳清分离蛋白-多酚复合物与茶油混合(分别控制糖基化蛋白-多酚溶液与油相的体积比为3:7、5:5、7:3)，然后在10000rpm的转速下均质3min，得到所述糖基化乳清分离蛋白-茶油Pickering乳液。
结果：本对比例制得的乳液粒径为40-50μm，14天的储藏过程中，乳液中过氧化物的浓度逐步升高达到0.9μmol/L。
本发明实施例1-3与对比例1相比，采用超声波乳化，进一步减小了乳化粒径，能够更好的稳定体系，减弱因聚集或是重力引起的乳液失稳，增强了乳液的抗氧化性，降低了茶油纳米乳液在14储存过程中的氧化程度。
综上可知，本发明通过合理调整乳液制备过程中的工艺步骤、参数，提升了糖基化蛋白-茶油纳米乳液的稳定性和抗氧化性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以糖基化蛋白溶液为水相，向水相中加入茶油，均质、超声处理得到糖基化蛋白-茶油纳米乳液。
2.根据权利要求1所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，所述糖基化蛋白溶液通过将糖基化蛋白加入到水中得到；所述糖基化蛋白溶液中糖基化蛋白的浓度为10mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，所述糖基化蛋白溶液中还添加了叠氮化钠。
4.根据权利要求3所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，所述叠氮化钠的添加量为所述糖基化蛋白溶液质量的万分之一至万分之五。
5.根据权利要求2所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，将糖基化蛋白加入到水中后还包括于25℃，500r/min的条件下恒温搅拌2h的步骤。
6.根据权利要求1所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，所述糖基化蛋白-茶油纳米乳液中茶油的质量分数为10％。
7.根据权利要求1所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，所述均质具体为12000r/min条件下均质2min。
8.根据权利要求1所述的一种糖基化蛋白-茶油纳米乳液的制备方法，其特征在于，所述超声处理具体为45℃、450W条件下超声10min。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的糖基化蛋白-茶油纳米乳液。
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