CN115606800A - 一种高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法。该方法包括如下步骤：（1）将BSA和糖类加入水中混合，将pH值调节为7.0‑9.0，再加入叠氮化钠抑制微生物生长，于室温条件下搅拌至BSA、糖类、叠氮化钠充分溶解后，冷冻干燥36 h，得到混合物冻干粉；（2）BSA和糖类的干热法美拉德反应：（3）将BSA‑糖类共价复合物加入超纯水中，搅拌至BSA‑糖类共价复合物完全溶解，配制成溶液；（4）调节步骤（3）所得溶液的pH值至2.0‑4.0，于85℃下搅拌加热0~48 h，搅拌转速为300 r/min，搅拌结束后迅速冷却，制得糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
Description
技术领域
本发明属于食品营养技术领域，具体地，涉及一种高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法。
背景技术
当前，基于蛋白质递送体系在食品工业、生物医药，及轻纺工业中应用广泛，如蛋白质纳米颗粒、分子复合物、微胶囊、水凝胶、纳米纤维，乳液等。其中，蛋白纤维即蛋白纤维化聚集体，是蛋白质分子或部分结构自发的形成高度有序的线样结构，也称蛋白质淀粉样纤维，在自然界中广泛存在。蛋白纤维最初发现于医学领域，与多种神经退行性疾病的发生密切相关。后续研究指出，部分蛋白质经酸热处理形成具有平行构型和反平行构型的β-sheet，后经不同排列、延伸、堆积形成原纤维，原纤维进行互相缠绕形成具有多股螺旋结构的蛋白质淀粉样纤维。体外蛋白纤维化聚集可有效提升蛋白质的多种性能，包括抗氧化性、乳化性、起泡性，和凝胶性等。此外，蛋白纤维也是营养素的稳定增溶的新型载体，具有广阔的应用前景。
以β-乳球蛋白、乳清蛋白、卵白蛋白、大豆蛋白为代表的多种天然来源的蛋白质在经pH、温度等处理后形成蛋白纤维，并应用于营养素递送、食品级乳液制备等领域。然而，纤维化聚集是以β-sheet为核心的组装过程，因此，当前的制备方法主要存在原料选择限制问题，因而制约了蛋白纤维在食品工业中的广泛应用。牛血清白蛋白（BSA）作为一种典型的生化模型，由于其具有低致敏性、来源广泛、价格低廉等优势，在生化研究、遗传工程、医药保健食品中具有广泛的研究应用。天然BSA分子量约为66 kDa，以单聚体的形式存在，共3个结构域，二级结构由α-helix构成。由于缺乏β-sheet结构，BSA通过传统的酸热法进行纤维化存在制备效率低、反应时间长、能源消耗大等缺点，因此BSA的纤维化聚集体研究应用较少。如何实现蛋白质纤维化聚集可控操作，特别是针对β-sheet结构缺乏蛋白质，是目前亟待的问题。
蛋白形成纤维化聚集体后，凝胶性、乳化性及泡沫稳定性等功能均得到显著提升，同时也是生物活性成分良好的运载体系，蛋白纤维在食品工业中具有广阔的应用前景。现有蛋白质纤维化技术主要集中于轻纺织手工业，主要应用于纺织和染料中，在食品工业中的关注度较低。中国发明专利CN110731513A“一种使用糖接枝蛋白纤维制备Pickering乳液的方法和Pickering乳液”提供一种糖接枝蛋白质纤维的制备方法，并利用该蛋白纤维稳定皮克林乳液。该发明以乳清分离蛋白为原料，通过葡萄糖、乳糖和麦芽糊精对乳清蛋白糖基化制备纳米纤维后，以纳米纤维为乳化剂制备皮克林乳液。中国发明专利CN113881595“一种包含蛋白纤维的乳酸菌发酵剂及其制备方法”公布了一种乳清蛋白纤维负载乳酸菌的制备方法。该发明原料同样为乳清分离蛋白（富含β-sheet结构），通过酸热法制备的乳清分离蛋白纤维,。现有专利关于蛋白质纤维化制备较少，集中于乳清分离蛋白、豆类蛋白、谷类蛋白等富含β-sheet结构的蛋白质，对于牛血清白蛋白一类缺乏β-sheet结构蛋白质的纤维化专利仍未见报道。
根据现有技术，牛血清白蛋白纤维作为营养素的递送体系的应用较为有限。前述两件蛋白纤维发明中的原料选用β-sheet结构丰富的乳清分离蛋白，经糖基化或直接通过酸热法制备乳清分离蛋白纤维。乳清分离蛋白是较常用的蛋白纤维化原料，由于其来源广泛，并且富含β-sheet结构。然而目前蛋白纤维化聚集体的制备主要存在反应效率低和原料限制的问题。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法包括如下步骤：
（1）将BSA和糖类加入水中混合，将pH值调节为7.0-9.0，再加入叠氮化钠抑制微生物生长，于20℃条件下搅拌至BSA、糖类、叠氮化钠充分溶解后，冷冻干燥36 h，得到混合物冻干粉；所述BSA与糖类质量比为1:1，所述BSA与糖类的混合物在水中的质量百分比含量为5-15%；所述叠氮化钠在含有BSA和糖类的水中的浓度为0.2 mg/mL；
（2）BSA和糖类的干热法美拉德反应：将混合物冻干粉放入装有饱和溴化钾溶液的干燥器内，于60℃反应12 h，得到BSA-糖类共价复合物；
（3）将BSA-糖类共价复合物加入超纯水中，搅拌至BSA-糖类共价复合物完全溶解，配制成溶液；所述BSA-糖类共价复合物在超纯水中的质量百分比浓度为5%-15%；
（4）调节步骤（3）所得溶液的pH值至2.0-4.0，优选为2.0，于85℃下搅拌加热6~48h，搅拌转速为300 r/min，搅拌结束后迅速冷却，制得糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
优选地，所述糖类为葡萄糖、乳糖或葡聚糖。
优选地，其特征在于，步骤（2）所述干燥器内的湿度为79%。
基于上述糖基化蛋白质纳米纤维递送体系负载姜黄素的方法是将糖基化蛋白质纳米纤维递送体系的pH值调节至3.0-5.0，优选为3.2，将姜黄素溶于乙醇后加入到糖基化蛋白质纳米纤维递送体系中，且姜黄素在糖基化蛋白质纳米纤维递送体系中的终浓度为0.3-0.6 mg/mL，避光、20℃下搅拌6-24h，冷却干燥后即得负载姜黄素的糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
下面对本发明作进一步说明：
蛋白质纤维递送体系是目前的解决营养素应用困难的方案之一，能够有效保护营养素免受物理化学损害。然而蛋白质纳米纤维的制备受到原料选择少和制备效率低下等因素的限制。针对现有技术缺陷，本发明选择β-sheet结构缺乏的牛血清白蛋白为原料，利用三种糖对其进行糖基化诱导产生β-sheet结构，高效制备牛血清白蛋白纤维化聚集体（糖基化蛋白纤维纳米递送体系）。并用于负载姜黄素，提高姜黄素的载量。糖基化蛋白纤维有潜力在原蛋白纳米纤维的基础上进一步提升递送体系的水溶性和稳定性等关键指标，具有很大的开发价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）选用β-sheet结构缺乏的牛血清白蛋白为原料，通过三种糖（葡萄糖、乳糖、葡聚糖）对其进行糖基化改性，制备蛋白质-多糖接枝共聚物。拓宽了蛋白质纤维化的原料，原料的选用不再局限于β-sheet结构丰富的蛋白质，通过糖基化诱导蛋白质产生β-sheet结构，加快纤维化聚集的效率。
（2）通过酸热法制备糖基化牛血清白蛋白纤维化聚集体，有效提高纤维化效率，得到具有优良乳化性、起泡性、粘弹性和可塑性的牛血清白蛋白纤维。构建原料均为自然界中广泛存在的生物大分子，来源广泛、经济实用。制备方法采用传统干热法和酸热法，操作便捷、绿色无污染。得到的牛血清白蛋白纤维具有优良品质，解决蛋白质纤维化原料限制和加工效率低下等问题。
（3）利用糖基化牛血清白蛋白纤维负载姜黄素，姜黄素载量提高10-15%，姜黄素储藏稳定性和热稳定性均得到提高，另外糖基化牛血清白蛋白纤维能够进一步减缓姜黄素在肠道中的释放，将有助于糖基化蛋白纤维在无脂酸性饮品中的应用。
总之，本发明选择β-sheet缺乏的牛血清白蛋白为原料，通过糖基化改性诱导β-sheet结构的产生，在酸热条件下，制备得BSA纤维，并负载姜黄素，突破蛋白质纤维化聚集选料局限，丰富蛋白质纤维化聚集的调控方法，同时实现姜黄素载量的提升。本发明原料来源广泛、制备方法简单、操作便捷，可应用于多种功能性营养素的负载，具有较强的实用性。
附图说明
图1为三种糖基化BSN的原子力显微镜图像；图中：a)BSA-葡萄糖。b) BSA-乳糖。c)BSA-葡聚糖；
图2为糖基化BSA纤维的乳化性；
图3为糖基化前后姜黄素的溶解度；
图4为糖基化前后姜黄素的沉积情况。
具体实施方式
实施例1
所述高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法包括如下步骤：
（1）将BSA和葡萄糖加入水中混合，将pH值调节为7.0，再加入叠氮化钠抑制微生物生长，于室温条件下磁力搅拌至BSA、葡萄糖、叠氮化钠充分溶解后，冷冻干燥36 h，得到混合物冻干粉；所述BSA与葡萄糖质量比为1:1，所述BSA与葡萄糖的混合物在水中的质量百分比含量为5-15%；所述叠氮化钠在含有BSA和糖类的水中的浓度为0.2mg/mL；
（2）BSA和葡萄糖的干热法美拉德反应：将混合物冻干粉放入装有饱和溴化钾溶液（湿度为79%）的干燥器内，于60℃反应12 h，得到BSA-葡萄糖共价复合物；
（3）将BSA-葡萄糖共价复合物加入超纯水中，搅拌至BSA-葡萄糖共价复合物完全溶解，配制成溶液；所述BSA-葡萄糖共价复合物在超纯水中的质量百分比浓度为5%-15%；
（4）调节步骤（3）所得溶液的pH值至2.0，于85℃下搅拌加热48 h，搅拌转速为300r/min，搅拌结束后迅速冷却，制得糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
基于上述糖基化蛋白质纳米纤维递送体系负载姜黄素的方法是将糖基化蛋白质纳米纤维递送体系的pH值调节至3.2，将姜黄素溶于乙醇后加入到糖基化蛋白质纳米纤维递送体系中，且姜黄素在糖基化蛋白质纳米纤维递送体系中的终浓度为0.5 mg/mL，避光、室温下搅拌12h，冷却干燥后即得负载姜黄素的糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
实施例2
与实施例1不同之处为将葡萄糖换为乳糖。
实施例3
与实施例1不同之处为将葡萄糖置换为葡聚糖。
本发明中，BSA纤维为纳米级，粒径均小于10 nm，糖基化后BSA纤维对姜黄素的载量较未糖基化纤维约提升15%。具体结果见图1至图4：
由图1可知，三种糖类糖基化后的牛血清白蛋白都能在相同的酸热条件后形成明显的不同于（“蠕虫状”）的长条状纤维结构，三种糖基化纤维结构的高度不同，形状接近且分布较均匀。此外也能充分说明糖基化过后的BSA依然可以在相同的酸热条件下自组装形成正常的纤维结构。
由图2可知，糖基化BSA纤维在pH 3.0，离子强度为0的乳化性测试。BSA纤维的乳化性指数（EAI）为44.5 m2/g，三种糖基化BSA纤维的EAI分别是45.2 m2/g、43.6 m2/g和41.6m2/g（BSN-Glu、BSN-Lac、BSN-Dex）。而乳化稳定性，不同的糖基化BSA纤维的稳定性BSA纤维有所不同，BSA纤维的乳化稳定性指数（ESI）为60.4 min，三种糖基化BSA纤维的ESI分别是64.4 min、65.5 min和75.7 min（BSN-Glu、BSN-Lac、BSN- Dex）。综合来看糖基化改性对纳米纤维的乳化性影响不大，但是可以增加纳米纤维的乳化稳定性，其中多糖的效果更好。观察乳滴显微镜图像可以看到，糖基化BSA纤维的乳滴平均粒径较BSA纤维都有所增大，说明糖基化改性影响了蛋白纤维的界面张力，形成了较稳定的大尺寸乳滴。
由图3可知，三种糖糖基化后的BSA纤维对姜黄素的负载率分别达到50.2%、45.5%和47.5%，较之原BSA纤维负载率（36.7%）有明显增加，接近无序聚集体负载姜黄素达到的增溶效果。说明糖基化改性能够进一步促进姜黄素与蛋白质的复合过程，提高姜黄素的溶解度。
由图4可知，7 d后的三种糖基化BSA纤维负载姜黄素样品几乎没有出现沉积，15 d后才出现一层薄膜，与之前原BSA纤维负载姜黄素的沉积情况相比更加的稳定，说明糖基化改性后的BSA纤维与姜黄素的结合稳定性得到了提高，综合来看，BSA-葡萄糖纤维的效果最好。
糖基化后牛血清白蛋白纤维的乳化稳定性和起泡性均得到不同程度的提升。乳化稳定性指数由60.4 min（未糖基化）提升至64.4 min（BSN- Glu）、65.5 min（BSN-Lac）和75.7 min（BSN- Dex）。牛血清白蛋白纤维的起泡性和泡沫稳定性分别为47.1%和29.4%，糖基化后起泡性和泡沫稳定性分别为BSN-Glu（57.1%，35.7%），BSN-Lac（66.7%，41.7%），BSN-Dex（66.7%，43.3%），说明糖基化后蛋白质纤维的起泡能力和起泡稳定性显著增强。
糖基化后姜黄素的负载率由36.7%提升至50.2%（BSN- Glu）、45.5%（BSN-Lac）和47.5%（BSN- Dex）。储藏15天后姜黄素几乎无沉积情况。另外模拟胃部消化中，糖基化牛血清白蛋白纤维负载的姜黄素的释放量低于未经糖基化，进一步实现营养素的缓释，有助于在无脂酸性饮品中的应用。
Claims (4)
1.一种高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将BSA和糖类加入水中混合，将pH值调节为7.0-9.0，再加入叠氮化钠抑制微生物生长，于20℃条件下搅拌至BSA、糖类、叠氮化钠充分溶解后，冷冻干燥36 h，得到混合物冻干粉；所述BSA与糖类质量比为1:1，所述BSA与糖类的混合物在水中的质量百分比含量为5-15%；所述叠氮化钠在含有BSA和糖类的水中的浓度为0.2mg/mL；
（2）BSA和糖类的干热法美拉德反应：将混合物冻干粉放入装有饱和溴化钾溶液的干燥器内，于60℃反应12 h，得到BSA-糖类共价复合物；
（3）将BSA-糖类共价复合物加入超纯水中，搅拌至BSA-糖类共价复合物完全溶解，配制成溶液；所述BSA-糖类共价复合物在超纯水中的质量百分比浓度为5%-15%；
（4）调节步骤（3）所得溶液的pH值至2.0-4.0，于85℃下搅拌加热6~48 h，搅拌转速为300 r/min，搅拌结束后迅速冷却，制得糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
2.如权利要求1所述高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法，其特征在于，所述糖类为葡萄糖、乳糖或葡聚糖。
3.如权利要求1所述高稳定性高载量糖基化蛋白纤维纳米递送体系的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述干燥器内的湿度为79%。
4.基于权利要求1至3任一项所得糖基化蛋白质纳米纤维递送体系负载姜黄素的方法，其特征在于，所述方法是将糖基化蛋白质纳米纤维递送体系的pH值调节至3.0-5.0，将姜黄素溶于乙醇后加入到糖基化蛋白质纳米纤维递送体系中，且姜黄素在糖基化蛋白质纳米纤维递送体系中的终浓度为0.3-0.6 mg/mL，避光、20℃下搅拌6-24h，冷却干燥后即得负载姜黄素的糖基化蛋白质纳米纤维递送体系。
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