CN115380986B - 一种苦荞蛋白纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苦荞蛋白纳米颗粒及其制备方法,其制备方法包括以下步骤:将苦荞蛋白溶解在PBS缓冲液中,得到苦荞蛋白溶液,调节pH值,搅拌1.5‑2.5h,然后置于3‑6℃条件下10‑15h,制得水化的苦荞蛋白溶液;离心,将上清液于75‑90℃条件下加热,然后冰水浴处理,制得苦荞蛋白凝胶;依次经均质和超声处理,然后冷冻干燥,制得苦荞蛋白纳米颗粒。本发明以苦荞蛋白为原料,制得的苦荞蛋白纳米颗粒具有粒径小、均一和稳定的特点,可作为一种纯天然植物蛋白应用于稳定Pickering乳液,可荷载功能成分应用于食品、医药、化妆品等领域,也可作为功能物质提高食品的稳定性和延长货架期,改变冻融稳定性等。
Description
技术领域
本发明涉及苦荞蛋白产品开发技术领域,具体涉及一种苦荞蛋白纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
荞麦是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)的双子叶植物,目前广泛栽培的品种有甜荞(Fagopyrum esculentum Mounch)和苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaench),即普通荞麦和鞑靼荞麦,其中,苦荞含有淀粉(40.70-86.41%)、膳食纤维(3.4-5.2%)、蛋白质(8.51-18.87%)、微量元素等营养物质,其蛋白含量高于甜荞、小麦、水稻、高梁等。因其含有很多生物活性物质,所以被誉为“长寿食品”。苦荞蛋白是一种全价蛋白,苦荞蛋白含量比甜荞高,氨基酸种类齐全,8种必需氨基酸比其他谷物高,营养价值好,有动物实验表明,通过分析蛋白质氨基酸、生物价、蛋白质利用率等,苦荞蛋白质量高于酪蛋白。除此之外,经研究发现,苦荞蛋白还具有抗氧化、调节肠道菌群、降血压降胆固醇、抗肿瘤、抗菌、改善脂质代谢等生物活性。
植物蛋白质作为食品中的一种重要营养素,具有一定的生理功能,对其进行开发和利用成为食品研究开发中的热点,对蛋白质的结构与功能进行修饰,可以改变其功能特性,在纳米尺度下对于苦荞蛋白进行修饰,可以显著降低其粒径与表面疏水性,增强Zeta电位,提高其稳定性,这项技术在食品工业中极具应用价值,如作为载体,荷载功能成分、营养物质,丰富食品功能和营养元素;作为天然稳定剂提高乳液、乳饮料、pickering乳液的稳定性;改变食品微结构,提高食品稳定性,延长食品货架期,提高冻融稳定性等;目前,蛋白纳米颗粒的制备方法通常会采用反溶剂法,不可避免地会用到大量的有机溶剂如乙醇和醋酸等,而且操作过程较为繁琐复杂,且制得的粒径较大,因此,通过现代技术手段,在较为简单、安全的条件下实现苦荞蛋白颗粒纳米化,未来在化妆品、食品、医药等行业具有良好的应用前景,具有现实意义。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种苦荞蛋白纳米颗粒及其制备方法,以解决现有技术中制备苦荞蛋白纳米颗粒制备过程复杂以及制得的粒径大的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:提供一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)将苦荞蛋白溶解在PBS缓冲液中,得到苦荞蛋白溶液,调节pH值,搅拌1.5-2.5h,然后置于3-6℃条件下10-15h,制得水化的苦荞蛋白溶液;
(2)将步骤(1)制得的水化的苦荞蛋白溶液离心,将上清液于75-90℃条件下加热,然后冰水浴处理,制得苦荞蛋白凝胶;
(3)将步骤(2)制得的苦荞蛋白凝胶依次经均质和超声处理,然后冷冻干燥,制得苦荞蛋白纳米颗粒。
本发明的有益效果为:本发明以苦荞蛋白为原料,通过调节pH和加热使蛋白质变性,提高疏水性以及电势差,更利于蛋白质颗粒的稳定性,热处理会使处在蛋白质分子内部的部分疏水氨基酸残基由于二级结构的变化裸露在外部,引起疏水作用和氢键作用的增强,自身绿色无毒,不存在安全问题,通过超声和均质,可使蛋白质微粒化,降低其粒径,基于布朗运动和带电排斥的原因而更加稳定、均一。制得的苦荞蛋白纳米颗粒具有粒径小(127.87nm)、均一(PDI 0.089)和稳定(电位绝对值32.3mV)的特点,可作为一种纯天然植物蛋白应用于稳定Pickering乳液,可荷载功能成分应用于食品、医药、化妆品等领域,也可作为功能物质提高食品的稳定性和延长货架期,改变冻融稳定性等。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进:
进一步,步骤(1)中,采用盐析法从苦荞粉中提取苦荞蛋白。
采用上述进一步技术方案的有益效果为:采用盐析法从苦荞粉中提取苦荞蛋白,相较于碱溶酸沉提取法,得到的蛋白质纯度更高,对后续步骤有良好的支撑作用。
进一步,苦荞蛋白通过以下方法制得:
(1.1)将苦荞粉用PBS缓冲液溶解,经搅拌和离心,得到第一上清液,加入硫酸铵,经搅拌和离心,得到第二上清液,再继续加入硫酸铵,继续搅拌和离心,制得沉淀;
(1.2)将步骤(1.1)制得的沉淀用水复溶,然后经透析和冷冻干燥,制得苦荞蛋白。
进一步,步骤(1.1)中,苦荞粉和PBS缓冲液的质量体积比为1g:9-11mL。
进一步,步骤(1.1)中,PBS缓冲液的浓度为0.008-0.012mol/L,pH值为6.5-7.5。
进一步,步骤(1.1)中,将苦荞粉用PBS缓冲液溶解后,搅拌1.5-2.5h,3000-6000r/min离心25-35min。
进一步,步骤(1.1)中,第一上清液中硫酸铵的浓度为30-50wt%。
进一步,步骤(1.1)中,第二上清液中硫酸铵的浓度为70-90wt%。
进一步,步骤(1.1)中,第一上清液和第二上清液加入硫酸铵后,搅拌50-70min,9000-11000r/min离心10-20min。
进一步,步骤(1.2)中,3-6℃条件下,采用3000-4000Da透析袋透析40-50h。
进一步,步骤(1.2)中,于-80~-70℃和4-6Pa条件下冷冻干燥40-50h。
进一步,步骤(1)中,苦荞蛋白溶液的浓度为4-8wt%。
进一步,步骤(1)中,苦荞蛋白纯度为80-82wt%。
进一步,步骤(1)中,pH值为6.5-7.5。
进一步,步骤(1)中,pH值为7。
采用上述进一步技术方案的有益效果为:通过调节体系pH值为7,使颗粒带有更多的电势差,可以获得稳定分散的颗粒体系。
进一步,步骤(1)中,用0.8-1.2mol/L的盐酸溶液调节pH。
进一步,步骤(2)中,在3-6℃和离心力5000-7000g条件下离心8-12min。
进一步,步骤(2)中,加热时间为8-12min。
进一步,步骤(2)中,于80℃条件下加热。
采用上述进一步技术方案的有益效果为:于80℃条件下加热,可以提高表面疏水性及颗粒电势差,以疏水作用及二硫键等强作用力维持其内部结构稳定,使其吸附到界面时,不易发生结构改变而保持颗粒完整性。
进一步,步骤(3)中,均质速度为10000-15000r/min,均质时间为1-3min。
进一步,步骤(3)中,采用细胞破碎仪超声1-3min。
进一步,步骤(3)中,于-80~-70℃和4-6Pa条件下冷冻干燥40-50h。
本发明还提供上述苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法制得的苦荞蛋白纳米颗粒。
本发明还提供上述苦荞蛋白纳米颗粒在作为载体和稳定剂方面的应用。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明的苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,其原料苦荞来源广泛、成本低廉,制备过程简单,容易操作,不需要复杂的设备,成本低廉,安全可靠,易于推广,制备工艺简单且重复性好,作为天然植物蛋白可用于形成稳定的纳米级皮克林乳液,可作为载体荷载功能成分,适用于食品、医药、化妆品等行业。
2、本发明制备的苦荞蛋白纳米颗粒具有较小的粒径(127.87-307.70nm)以及较小的PDI(0.089-0.450),相较于目前报道的微米级蛋白颗粒具有极强的优势。
3、本发明制备的苦荞蛋白纳米颗粒具有广泛的pH稳定区间(2-4、6-8)、具有较强的热稳定性。
附图说明
图1为实施例1制得的苦荞蛋白纳米颗粒的粒径分布曲线图;
图2为实施例1制得的苦荞蛋白纳米颗粒的热稳定性检测图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1:
一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)将苦荞粉用浓度为0.01mol/L,pH值为7的PBS缓冲液溶解,放置于磁力搅拌器上搅拌2h,4000r/min离心30min,得到第一上清液,加入硫酸铵,使第一上清液中硫酸铵的浓度为40wt%,搅拌60min,10000r/min离心15min,得到第二上清液,再继续加入硫酸铵,第一上清液中硫酸铵的浓度为80wt%,继续搅拌60min,10000r/min离心15min,制得沉淀;其中,苦荞粉和PBS缓冲液的质量体积比为1g:10mL;
(2)将步骤(1)制得的沉淀用水复溶,4℃条件下,采用3500Da透析袋透析48h(每4h换水一次),然后于-76℃和5Pa条件下冷冻干燥48h,制得苦荞蛋白;
(3)将步骤(2)制得的苦荞蛋白溶解在浓度为0.01mol/L,pH值为7的PBS缓冲液中,得到浓度为6wt%的苦荞蛋白溶液,用1mol/L的盐酸溶液,调节pH值为7,室温下搅拌2h,然后置于冰箱中,在4℃条件下充分水化12h,制得水化的苦荞蛋白溶液;
(4)将步骤(3)制得的水化的苦荞蛋白溶液置于于冷冻离心机中,在4℃和离心力6000g条件下离心10min,将上清液于80℃条件下水浴加热10min,然后冰水浴处理,制得苦荞蛋白凝胶;
(5)将步骤(4)制得的苦荞蛋白凝胶置于高速剪切机中均质,均质速度为12000r/min,均质时间为2min,然后用细胞破碎仪超声处理2min,超声功率为500W,超声开、关时间分别为10s和5s,再在﹣80℃冰箱中预冷冻,最后置于冷冻干燥机中,于-76℃和5Pa条件下冷冻干燥48h,制得苦荞蛋白纳米颗粒。
实施例2:
一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)将苦荞粉用浓度为0.008mol/L,pH值为6.5的PBS缓冲液溶解,放置于磁力搅拌器上搅拌1.5h,3000r/min离心35min,得到第一上清液,加入硫酸铵,使第一上清液中硫酸铵的浓度为30wt%,搅拌50min,9000r/min离心10min,得到第二上清液,再继续加入硫酸铵,第一上清液中硫酸铵的浓度为70wt%,继续搅拌50min,9000r/min离心20min,制得沉淀;其中,苦荞粉和PBS缓冲液的质量体积比为1g:9mL;
(2)将步骤(1)制得的沉淀用水复溶,3℃条件下,采用3000Da透析袋透析50h(每4h换水一次),然后于-80℃和4Pa条件下冷冻干燥40h,制得苦荞蛋白;
(3)将步骤(2)制得的苦荞蛋白溶解在浓度为0.008mol/L,pH值为6.5的PBS缓冲液中,得到浓度为4wt%的苦荞蛋白溶液,用0.8mol/L的盐酸溶液,调节pH值为6.5,室温下搅拌1.5h,然后置于冰箱中,在3℃条件下充分水化10h,制得水化的苦荞蛋白溶液;
(4)将步骤(3)制得的水化的苦荞蛋白溶液置于于冷冻离心机中,在3℃和离心力5000g条件下离心12min,将上清液于75℃条件下水浴加热12min,然后冰水浴处理,制得苦荞蛋白凝胶;
(5)将步骤(4)制得的苦荞蛋白凝胶置于高速剪切机中均质,均质速度为10000r/min,均质时间为3min,然后用细胞破碎仪超声处理1min,超声功率为500W,超声开、关时间分别为10s和5s,再在﹣80℃冰箱中预冷冻,最后置于冷冻干燥机中,于-80℃和4Pa条件下冷冻干燥40h,制得苦荞蛋白纳米颗粒。
实施例3:
一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)将苦荞粉用浓度为0.012mol/L,pH值为7.5的PBS缓冲液溶解,放置于磁力搅拌器上搅拌2.5h,6000r/min离心25min,得到第一上清液,加入硫酸铵,使第一上清液中硫酸铵的浓度为50wt%,搅拌70min,11000r/min离心10min,得到第二上清液,再继续加入硫酸铵,第一上清液中硫酸铵的浓度为90wt%,继续搅拌70min,11000r/min离心10min,制得沉淀;其中,苦荞粉和PBS缓冲液的质量体积比为1g:11mL;
(2)将步骤(1)制得的沉淀用水复溶,6℃条件下,采用4000Da透析袋透析40h(每4h换水一次),然后于-70℃和6Pa条件下冷冻干燥50h,制得苦荞蛋白;
(3)将步骤(2)制得的苦荞蛋白溶解在浓度为0.012mol/L,pH值为7.5的PBS缓冲液中,得到浓度为8wt%的苦荞蛋白溶液,用1.2mol/L的盐酸溶液,调节pH值为7.5,室温下搅拌2.5h,然后置于冰箱中,在6℃条件下充分水化15h,制得水化的苦荞蛋白溶液;
(4)将步骤(3)制得的水化的苦荞蛋白溶液置于于冷冻离心机中,在6℃和离心力7000g条件下离心8min,将上清液于90℃条件下水浴加热8min,然后冰水浴处理,制得苦荞蛋白凝胶;
(5)将步骤(4)制得的苦荞蛋白凝胶置于高速剪切机中均质,均质速度为15000r/min,均质时间为1min,然后用细胞破碎仪超声处理3min,超声功率为500W,超声开、关时间分别为10s和5s,再在﹣80℃冰箱中预冷冻,最后置于冷冻干燥机中,于-70℃和6Pa条件下冷冻干燥50h,制得苦荞蛋白纳米颗粒。
对比例1-6:
一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
步骤(3)中调节pH值分别为2、3、4、5、6和8,其余同实施例1。
对比例7-10:
一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
步骤(4)中加热温度分别为未加热、60℃、70℃和100℃,其余同实施例1。
试验例
一、实施例1-3制得的苦荞蛋白纳米颗粒进行外观和水溶性检测,可知本发明制得的苦荞蛋白纳米颗粒具有白色的外观和良好的水溶性,能稳定地分散在去离子水中。
二、将实施例1制得的苦荞蛋白纳米颗粒进行粒径检测,具体检测方法为:提前30min打开马尔文3600纳米粒度仪预热,用去离子水将样品稀释至1mg/mL,倒入比色皿中,分散介质设定为水,样品颗粒的折光系数设置为1.414,在25℃下平衡120s后开始测试,结果见图1,由图1可知,本发明制得的苦荞蛋白纳米颗粒具有较小的粒径,粒径范围为127.87-307.7nm。
三、将实施例1制得的苦荞蛋白纳米颗粒进行热稳定性能检测,具体检测方法为:将装有苦荞蛋白纳米颗粒液的带塞玻璃试管,于90℃水浴热处理30min,然后取出冷却至室温后测定其粒度,结果见图2,由图2可知,本发明制得的苦荞蛋白纳米颗粒在加热和未加热情况下,均保持相同的粒径范围,说明其具有较强的热稳定性。
四、将实施例1-3制得的苦荞蛋白纳米颗粒和对比例1-10制得的苦荞蛋白纳米颗粒进行粒径、PDI和Zeta电位检测,检测方法具体为:提前30min打开马尔文3600纳米粒度仪预热,用去离子水将样品稀释至1mg/mL,分散介质设定为水,样品颗粒的折光系数设置为1.414,用去离子水将样品稀释至1mg/mL,在25℃下平衡120s后开始测试,结果见表1。由表1可知,在本发明条件下制备的苦荞蛋白纳米颗粒粒径较小,且PDI指数小,电位绝对值较高,蛋白纳米颗粒较稳定,相较于实施例,对比例的样品粒径较大,PDI及zeta电位均小于实施例样品。
表1苦荞蛋白纳米颗粒性能参数
粒径nm | PDI | 电位mV | |
实施例1 | 127.87 | 0.089 | 32.3 |
实施例2 | 128.93 | 0.088 | 32.4 |
实施例3 | 129.91 | 0.087 | 32.6 |
对比例1 | 165.20 | 0.152 | 20.97 |
对比例2 | 165.83 | 0.130 | 12.63 |
对比例3 | 210.37 | 0.200 | 10.23 |
对比例4 | 1082.00 | 0.543 | -5.03 |
对比例5 | 307.70 | 0.322 | -14.57 |
对比例6 | 129.80 | 0.248 | -16.5 |
对比例7 | 267.77 | 0.450 | -26.30 |
对比例8 | 249.70 | 0.333 | -23.47 |
对比例9 | 253.67 | 0.233 | -25.40 |
对比例10 | 279.70 | 0.219 | -25.23 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将苦荞蛋白溶解在PBS缓冲液中,得到苦荞蛋白溶液,调节pH值,搅拌1.5-2.5h,然后置于3-6℃条件下10-15h,制得水化的苦荞蛋白溶液;
(2)将步骤(1)制得的水化的苦荞蛋白溶液离心,将上清液于75-90℃条件下加热,然后冰水浴处理,制得苦荞蛋白凝胶;
(3)将步骤(2)制得的苦荞蛋白凝胶依次经均质和超声处理,然后冷冻干燥,制得苦荞蛋白纳米颗粒;
步骤(1)中,采用盐析法从苦荞粉中提取苦荞蛋白;
苦荞蛋白通过以下方法制得:
(1.1)将苦荞粉用PBS缓冲液溶解,经搅拌和离心,得到第一上清液,加入硫酸铵,经搅拌和离心,得到第二上清液,再继续加入硫酸铵,继续搅拌和离心,制得沉淀;
(1.2)将步骤(1.1)制得的沉淀用水复溶,然后经透析和冷冻干燥,制得苦荞蛋白;
步骤(1)中,苦荞蛋白溶液的浓度为4-8wt%;
步骤(2)中,在3-6℃和离心力5000-7000g条件下离心8-12min;
步骤(3)中,采用细胞破碎仪超声1-3min。
2.根据权利要求1所述的苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,pH值为6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,均质速度为10000-15000r/min,均质时间为1-3min。
4.根据权利要求1所述的苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,于-80~-70℃和4-6Pa条件下冷冻干燥40-50h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的苦荞蛋白纳米颗粒的制备方法制得的苦荞蛋白纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的苦荞蛋白纳米颗粒在制备载体和稳定剂方面的应用。
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