KR20210067188A

KR20210067188A - 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자

Info

Publication number: KR20210067188A
Application number: KR1020190156550A
Authority: KR
Inventors: 임광희; 이은주
Original assignee: 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-06-08
Also published as: KR102368725B1

Abstract

본 발명은 구강섭취 시에 장내 흡수를 개선하여 생체 이용률(bioavailability)를 제고하는 키토산, 항암효과를 가진 푸코이단 및 커큐민 분해를 방지하고 암 조직에 누적되는 것으로 보고되어 암세포에 대한 항암제의 표적전달(target delivery)을 가능하게 하는 표적 리간드(target ligand)로서의 알부민으로 구성된 입자에 커큐민을 포함하는 난용성 약제를 담지함으로써, 난용성 약제의 인체 또는 소화기관에서의 빠른 분해 또는 제거로 인한 낮은 생체 가용도를 개선하고, 항암효과를 가진 푸코이단의 장내 흡수를 개선하여 생체 이용률(bioavailability)를 제고하는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항염(anti-inflammation), immuno-stimulation, 항암(anti-tumor), 항비만(anti-obesity), anti-hypertension, 항알츠하이머(anti-Altzheimer’disease), 조직재생촉진, 약물과 DNA 전달증대, 항균, 항산화 및 칼슘흡수증진 효과의 생물학적 특성을 가진 수용성인 키토산 올리고머의 장내 흡수를 개선하는 것에 관한 것이다.

Description

난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자 {Albumin-fucoidan-chitosan nano-particle entrapping poorly water-soluble drug}

본 발명은 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자와 이의 제조방법에 관한 것이다.

알부민과 커큐민 결합은 커큐민의 분해를 방지한다. 알부민과 결합된 약물은 장(주로 대장)의 암조직 및 암세포에서 알부민-흡착단백질과 알부민-수용기와 상호작용에 의해서 내부화 되면서 암세포 내부로 내포 작용된 후에, 약물(커큐민)을 서서히 방출하거나, 알부민 대사를 통해 인체 조직의 암세포에 항암제로서 약물(커큐민)을 공급한다.

키토산은 셀룰로스와 비슷한 구조를 가지는 다당류이나, 키토산은 아민기를 포함하고 있어 제약용도로서 매우 유용한 특성을 가지고 있다. 키토산 기본 나노입자는 대부분 양전하를 가지고, 양전하 나노입자는 음전하를 가진 세포표면에 정전기작용으로 부착되기 쉽기 때문에 키토산 기본 나노입자는 세포내 섭취가 용이하다. 키토산은 구강섭취에서 흡수를 증진하기 위하여 장 상피세포의 융합막(tight junction)를 개방을 촉진하므로, 키토산 나노입자 내에 담지하는 생체 이용률(bioavailability)를 증가시킨다. 키토산 나노입자가 가지는 양전하는 장에서의 흡수를 증가시킨다.

푸코이단과 같은 황산화 다당류 (sulfated polysaccharide)가 Caco-2 세포의 단층막을 통과할 때에도, 나노입자가 가진 양전하는 장 상피세포의 융합막의 개방을 유도한다. 푸코이단은 갈조류와 해양 무척추동물에서 발견되는 황산화 음전하를 가진 다당류이다. 상업적으로는 “Focus vesiculosus”라는 갈조류에서 푸코이단이 생산되며, 푸코이단 구조는 대부분 α(1→3) 글리코시드결합과 4번 위치에 설페이트기를 가진 L-fucose를 기본으로 한다. 푸코이단은 세포자살(apotosis)을 유도하는 항암효과가 체내(in-vivo) 및 체외실험(in-vitro)에서 입증되었다. 또한 푸코이단은 암세포의 혈관생성(angiogenesis) 방지와 같은 항발암성 효과(anticarcinogenic effect)가 체내(in-vivo) 및 체외실험(in-vitro) 연구에서 보고되었다.

키토산의 아민기가 가지는 양전하와 푸코이단의 황산화 음전하가 polyelectrolyte complexation(PEC)에 의하여 키토산-푸코이단 나노입자를 형성한다. 구강섭취에 의한 소화기관(GI tract)인 장의 흡수에서는 나노입자의 전하특성은 장의 상피세포에 의한 흡수에 영향을 준다. 한편 인체의 소화기관 (GI tract) 특히 장 상피세포 멤브레인에 박혀있는 P-글라이코단백질에 의하여 중요한 약성을 가진 기질들이 세포 밖으로 배출된다. 따라서 P-글라이코단백질에 의하여 중요한 약성을 가진 기질들의 생체 이용률(bioavailability)이 떨어지게 되는데, 커큐민 성분은 이러한 P-글라이코단백질의 활성을 억제하는 P-글라이코단백질 억제제로 알려져 있어서 중요한 약성을 가진 기질들의 세포 밖으로의 배출을 억제하여 생체 이용률(bioavailability)를 증가시킨다. 이러한 커큐민을 전달하는 방법으로 카제인(casein) 마이셀(micelle) 등이 있으나 안정성(stability) 등에서 약점이 있다. 커큐민(curcumin)은 Curcuma longa(tumeric)에서 2-5%를 차지하는 추출된 폴리페놀인 소수성의 노란 색소로서, 음식, 화장품과 약품에 광범위하게 쓰이고 있으며, 질병예방과 건강증진에 효과가 있다고 보고되고 있다. 커큐민은 우수한 항암효과가 알려져 있으며 강력한 천연 항산화제이다. 커큐민은 세포자살(apotosis)을 통하여 세포증식을 저해하고, 결장암을 유도한 쥐에서 결장의 ACF(변종(aberrant) crypt foci)를 줄였다고 보고되었다. 그러나 커큐민은 낮은 용해도, 알카리 pH조건에서 분해성, 낮은 흡수도 및 생체 내에서 빠른 분해 및 제거에 의해 생체 이용률이 매우 낮다. 커큐민은 지질에 잘 용해되는 높은 소수성으로서 약물동력학적으로 단점을 가지고 있다. 커큐민은 pH가 7 이상인 염기성 수용액에서는 불안정성으로 인하여 화학적으로 분해하고, pH가 7보다 작은 산성 수용액에서는 커큐민의 분자구조 변화에 따른 10-50 μm의 결정이 생성되어 빠르게 침전한다. 반면에 O/W 에멀젼은 커큐민의 수분산성과 안정성을 개선하는데, 산성인 O/W 에멀젼에서는 1개월 동안 커큐민 85%가 보존되고 O/W 에멀젼 색인 노란색이 유지되나, pH가 7.0, 7.4 및 8.0의 염기성 O/W 에멀젼에서는 각각 62, 60, 53%만이 보존되고 색깔은 고작 15분 후에 희미하게 바래진다. 커큐민을 구강섭취 시에 소화기인 위장관(GI tract)을 통과하면서 발생하는 커큐민의 불안정성(instability)은 효율성(effectiveness)에 대한 대표적 장애요소이다.

커큐민 분자는 α, β 불포화 β-diketone에 의하여 연결된 두 개의 ortho-methoxy-phenol group을 가지고 있다. β-diketone 성분(moiety)을 통한 2개의 aryl group 사이의 공액(conjugation)은 커큐민이 두 종류의 이성질체로 존재하는 토토메리즘 현상(tautomerism)과 흥미로운 광물리 화학적 특성을 준다. 커큐민은 cis-enol form에서 가장 안정적이고, 낮은 pH(산)조건에서 keto form으로의 전환이 커진다. 커큐민의 형태적 평형(conformational equilibrium)은 pH, 온도, 용매극성 등에 달려있다. Keto form은 강력한 수소공여자인 반면에 enolate form은 강력한 전자공여자이다. β-아밀로이드 아미노산의 Aβ 응집체(36~43개의 peptide)와 커큐민과의 흡착조사에서 커큐민의 각각의 다른 이성질체의 구조는 Aβ 응집체에 대한 다른 흡착특성을 가지는데, 커큐민의 keto form은 enol form보다 Aβ 응집체에 대하여 더 약한 흡착을 보이고, 커큐민 평형은 커큐민이 Aβ 응집체에 흡착되는 동안에 enol form 쪽으로 이동한다. 커큐민의 물리화학적 특성과 항산화 특성은 상대적 keto-enol-enolate 농도조성인 keto-enol-enolate의 평형농도에 의하여 결정된다. 커큐민은 에탄올 수용액에서 pH 또는 에탄올 함량이 커지면서 형태적 평형(conformational equilibrium)은 (di)keto form에서 enol form으로 이동하고, pH 또는 에탄올 함량이 적어지면 형태적 평형(conformational equilibrium)은 enol form에서 (di)keto form으로 이동한다. Keto form 생성은 산성 pH에서 유리하고, 중성 form(i.e., enol form)이나 음이온 form(i.e., enolate form)은 중성이나 염기 pH에서 매우 우세하다. 또한 커큐민은 수용액에서 pH가 적어지면 응집이 되고, pH가 커지면 분산된다. 그 결과로서 산성 또는 중성 pH에서는 커큐민의 여러 가지 응집 form이 존재하여 커큐민 용액은 비균질(heterogenous)하여진다.

에탄올 함량이 50%까지 증가할 때의, 커큐민 수용액의 경우에, 흡광도분석에서 429 nm에서의 흡광도 증가는 주로 (di)keto form에서 enol form으로의 전환에 기인한다. 커큐민의 물리화학적 특성과 항산화제 역할을 결정하는 커큐민의 keto-enol-enolate 평형에 의하여, diketone으로부터 안정된 enol을 형성하고, enol에서 수소원자가 방출되어서 enolate를 형성한다. 커큐민은 유기용매에서는 거의 enol form을, 물에서는 keto와 enol form을 동시에 유지한다. 수용액에서 산 조건에서는 비교적 안정적인 keto form이, 물에서 불안정한 enol form보다 크게 차지하여 종합적으로 비교적 안정적이다. 그러나 알카리 수용액에서는 enol form이 keto form 보다 훨씬 커서 종합적으로 불안정하여 빠르게 분해된다. 에탄올 및 기타 유기용매에서 커큐민은 enol form으로 존재하며 수용액보다 안정적이다. 커큐민은 여러 가지 유기용매에서 여기상태(excited state) 반응을 통하여 분해된다고 알려져 있다. 분해상수는 에틸렌글리콜 > 1,4 다이옥산 > 이소프로파놀 > DMSO > 에탄올의 순서로 작아져서 분해가 느려진다. 유기용매 중에서도 에탄올에서 커큐민은 가장 안정적이다. 실제로 에탄올에서는 상당히 안정적으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 커큐민은 산 조건에서 O/W 에멀젼으로 존재할 때의 화학적 안정성이 가장 크다. 또한 알부민과 커큐민 결합은 커큐민의 분해를 방지한다고 보고되고 있다.

커큐민은 실험 및 임상연구에도 불구하고, 커큐민은 생체 내에서 불안정하고 생체 이용률이 매우 낮기 때문에 의학적 용도로서는 확인되지 않았다. 커큐민은 복용 시에 소화기관을 따라 흡수되지 않고 거의 모두 분변으로 배출된다. 커큐민의 흡수율을 증가시켜 생체 이용률이 증가 시키는 방법에 관한 연구가 진행되고 있다. 이에 본 발명자들은 커큐민의 흡수율을 증가시키기 위해 연구한 결과, 알부민, 푸코이단 및 키토산을 이용하여 나노입자를 생성하고, 상기 알부민-푸코이단-키토산 나노입자에 커큐민을 담지한 결과, 커큐민이 위 pH에서는 안정성을 가지는 반면에 장 pH에서는 방출하는 효과를 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. 자세하게는 난용성 약제가 용해되어 안정적인 상태를 유지하는 에탄올 또는 아세톤 용매에 난용성 약제를 용해한 용액을 알부민-푸코이단-키토산 나노입자에 담지한 평균 직경이 300 nm 내지 15 μm의 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 난용성 약제의 안정성을 유지하는 반면에 장의 pH에서는 용해되어 나노입자에 담지된 난용성 약제를 방출하여 난용성 약제의 생체 이용률이 증가시키고, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자는 순전하(net charge)를 가져 장에서의 흡수가 증가하는 효과가 있다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다:

(i) 알부민 수용액에 푸코이단 수용액을 혼합하여 알부민-푸코이단 혼합물 수용액을 교반하는 단계;

(ii) 상기 알부민-푸코이단 혼합물 수용액에 난용성 약제를 용매에 용해한 용액을 적하하고 교반하여 난용성 약제를 담지한 입자가 생성된 현탁액(suspension)이 생성되는 단계; 및

(iii) 상기 현탁액에 키토산 수용액을 적하시키고 교반하여서 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 생성하는 단계.

상기 난용성 약제는 커큐민(curcumin), 라이코펜(lycopene), 파클리탁셀(paclitaxel), 이트라코나졸(itraconazole), 이부프로펜(ibuprofen), 사이로리무스(sirolimus), 인도메타신(indomethacin), 코엔자임큐텐(coenzyme Q10), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 일라프라졸(ilaprazol) 및 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 난용성 약물일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조한 난용성 약제를 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 난용성 약제를 포함하는 코어부; 및 (b) 상기 난용성 약제 코어부 표면의 전체 또는 일부에 알부민-푸코이단-키토산 나노입자이 코팅된 쉘부;를 포함하는 나노입자를 제공할 수 있다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 난용성 약제는 커큐민(curcumin), 라이코펜(lycopene), 파클리탁셀(paclitaxel), 이트라코나졸(itraconazole), 이부프로펜(ibuprofen), 사이로리무스(sirolimus), 인도메타신(indomethacin), 코엔자임큐텐(coenzyme Q10), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 일라프라졸(ilaprazol) 및 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 난용성 약물이며, 나노입자에 담지한 난용성 약제의 평균직경은 300 nm 내지 15 μm일 수 있다.

본 발명은 구강섭취 시에 장내 흡수를 개선하여 생체 이용률(bioavailability)를 증가시키는 키토산; 항암효과를 가진 푸코이단; 및 커큐민 분해를 방지하고 암세포에 대한 항암제의 표적전달(target delivery) 효과가 있는 표적 리간드(target ligand)의 알부민을 이용하여 알부민-푸코이단-키토산의 나노입자를 제조한 뒤, 상기 나노입자에 커큐민을 담지함으로써, 커큐민이 인체 또는 소화기관에서의 빠른 분해 또는 제거되어 생체 이용률이 낮아지는 것을 개선하고, 푸코이단의 장내 흡수를 개선하여 생체 이용률(bioavailability)를 증가시키는 효과가 있다. 알부민-푸코이단-키토산 나노입자는 pH에 민감하여 위(pH 2-3)에서는 안정성이 있으며, 장(pH 7)에서는 알부민-푸코이단-키토산 나노입자가 흡수되어, pH 7.4 조건에서 알부민-푸코이단-키토산 입자가 정전기 힘에 의하여 해체(disintegration)가 되어 난용성 약제를 방추하여 인체의 흡수가 증가하여, 생체 이용률이 개선되는 효과가 있다. 반면에 커큐민 담지 알부민 나노입자의 경우에는 담지된 커큐민은 안정하나 구강섭취 시에 위에서 펩신(pepsin) 효소에 의하여 알부민의 가수분해가 쉽게 발생하여 알부민 나노입자에 담지된 커큐민이 장에 도달하지 못한다. 또한 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자가 순전하(net charge)로서 양전하를 가져 장에서의 흡수가 증가하는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1의 방법으로 제조된 커뮤민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자의 커큐민 담지율의 흡광도의 분석을 위한 커큐민의 검량선을 나타낸 것이다.

이하에서 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다: (i) 알부민 수용액에 푸코이단 수용액을 혼합하여 알부민-푸코이단 혼합물 수용액을 교반하는 단계; (ii) 상기 알부민-푸코이단 혼합물 수용액에 난용성 약제를 용매에 용해한 용액을 적하하고 교반하여 난용성 약제를 담지한 입자가 생성된 현탁액(suspension)이 생성되는 단계; 및 (iii) 상기 현탁액에 키토산 수용액을 적하시키고 교반하여서 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 생성하는 단계.

본 발명에서는 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자 제조를 위하여, 알부민 수용액에 푸코이단 수용액을 첨가 및 혼합한 알부민-푸코이단 혼합물 수용액을 교반하고, 에탄올 또는 아세톤에 난용성 약제를 용해한 용액을 적하하고 교반하여 난용성 약물을 담지한 입자가 생성된 현탁액(suspension)을 제조하였다. 상기 현탁액에 키토산 수용액을 적하시키고 교반하여서 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 생성하는 단계를 통하여 제조한다. 상기 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 생성한 현탁액을 원심 분리하여 상층액을 분리하고, 동결 건조시켜서 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 제조한다. 상기 알부민-푸코이단 혼합물 수용액의 교반속도는 500 내지 900 rpm이고, 상기 에탄올 또는 아세톤에 난용성 약제를 용해한 용액을 상기 알부민-푸코이단 혼합물 수용액에 적하하고 교반하는 속도 및 시간은 각각 500 내지 900 rpm 및 15 내지 30 분이고, 상기 키토산 수용액을 적하시키고 교반하는 속도 및 교반시간은 각각 500 내지 900 rpm 및 30 내지 60 분인 것이 바람직하다.

상기와 같이, 본 발명에 있어서, 난용성 약제로서 커큐민을 일 구체예로서 설명하였으나, 다른 난용성 약제도 본 발명의 입자에 담지될 수 있음이 자명하다, 따라서, 본 발명의 입자에 담지될 수 있는 난용성 약제는 특히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 커큐민(curcumin), 라이코펜(lycopene), 파클리탁셀(paclitaxel), 이트라코나졸(itraconazole), 이부프로펜(ibuprofen), 사이로리무스(sirolimus), 인도메타신(indomethacin), 코엔자임큐텐(coenzyme Q10), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 일라프라졸(ilaprazol) 및 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 난용성 약제일 수 있으며, 상기 난용성 약제는 물에 대한 난용성 약물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 또는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)일 수 있고, 상기 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 또는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)의 농도는 2.5 내지 7.5 %w/v 이 바람직하다. 또한 상기 푸코이단 수용액의 농도는 0.02 내지 5 %w/v이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 난용성 약물을 담지한 입자가 생성된 현탁액(suspension)이 생성되는 단계 및 상기 현탁액에 키토산 수용액을 적하시키는 단계의 사이에, 가교제를 첨가하여 교반하여 가교 반응시키는 단계를 추가할 수 있다. 상기 가교제는 제니핀(genipin), 글루타알데히드(glutaraldehyde) 및 글라이옥살(Glyoxal)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 가교제를 첨가하여 가교 반응시킨 후에 미 반응된 가교제를 제거하기 위하여 상기 현탁액을 원심 분리하여 상층액을 분리시키는 단계;를 추가할 수 있다. 왜냐하면 가교제가 글루타알데히드인 경우에 상층액에 용해된 미반응 글루타알데히드의 알데히드기와 키토산의 아민기와의 이민(imine) 반응으로 인한 가교(crosslinking)에 따른 응집이 발생하기 때문이다. 응집이 발생하는 경우에 비교적 큰 입도의 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자가 구해질 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 가교제 대 알부민의 투입 질량비를 더 적게 할 수 있다. 상기 가교제가 글루타알데히드 경우 가교제 대 알부민의 투입 질량비가 0.1:5 내지 1:5이고, 교반 속도는 500 내지 900 rpm이고, 교반시간은 12시간 내지 24시간일 수 있으며, 상기 난용성 약제가 커큐민일 때에 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 수율은 80% 이상일 수 있고, 입도는 300 nm 내지 15 μm일 수 있다.

상기 난용성 약제가 커큐민일 때에, 상기 알부민, 푸코이단 및 난용성 약제의 투입 질량비는 50:2:5 내지 50 :10:15일 수 있고, 상기 푸코이단 및 키토산의 투입 질량비는 1:1 내지 1:2일 수 있다. 또한 난용성 약제가 커큐민이고, 상기 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 특성으로서, 질소, 탄소, 수소 및 황의 원소구성은 각각 7 내지 15%, 40 내지 60%, 5 내지 10% 및 1 내지 3%의 원소 구성비를 보여주었다.

본 발명에서 상기 키토산 수용액은 pH는 pH 1 내지 pH 14 일 수 있으며, 산성, 중성 및 알카리 등 모든 pH 조건의 키토산 수용액을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 100% 메탄올 용매에 용해된 커큐민 및 금속염의 커큐민 혼합물(curcumin-metal complex)은 흡광도분석결과, 흡광도 피크가 428 nm으로 나타났다. 이는 순수 커큐민-메탄올 용액의 흡광도 피크인 425 nm보다 더 큰 파장으로, 피크의 세기가 더 크다. 키토산은 pH가 높을수록(~10.5), 커큐민의 친화도(Ka~400 μM)가 증가하여, 키토산 1몰 당 20 몰의 커큐민을 흡착한다. 상기 흡착은 pH에 민감하여서 산성(pH~5.0)에서는“영(zero)”으로 감소한다. 고농도의 염(0.1~2.0 M NaCl)은 이러한 흡착 친화도를 바꾸지 못한다. 그러나 12% 만큼 흡착 능(capacity)을 증가시킨다. 높은 pH에서 생성된 키토산-커큐민 복합체는 pH 7.0~10.5와 높은 염농도(1.0~4.0 M NaCl)에서 매우 작은 해리효과를 보이며, 매우 안정적이다. 생성된 키토산-커큐민 복합체는 복합체 이전과 화학적으로 동일하다. 그러나 pH를 7.0 미만으로 내리면 키토산-커큐민 복합체는 효과적으로 해리된다. pH 8.5에서 키토산의 글루코사민 단위는 커큐민 흡착공정에 관여한다. 글루코사민을 UV/Vis-spectrophotomer 분석(λ=440 nm)한 결과 커큐민의 흡광도를 높이는 것으로 확인되었다. 그러나 pH 4.8의 산 조건에서는 커큐민의 흡광도는 증가하지 않았다.

본 발명에서 산성 조건의 키토산 수용액을 사용하는 경우에는 커큐민이 안정적이고 키토산이 물에 용해되므로 키토산의 분자량의 크고 작음에 구애받지 않는 공정상의 장점이 있다. 그러나 용해된 키토산입자가 산성 조건의 수용액에서는 커큐민 입자와 흡착 효율이 낮아 커큐민의 담지하는 효율이 떨어진다. 그러나 중성 또는 알카리 수용액 조건에서는 분자량이 약 1,000~5,000 미만의 저분자 키토산만이 용해되고, 또한 커큐민이 중성 또는 알카리 수용액 조건에서 불안정하여 빠르게 분해되는 단점이 있다. 그러나 pH가 커질수록 용해된 키토산 입자(molecule)와 커큐민 입자 간의 흡착효율이 커져서 커큐민의 담지효율은 커지는 장점이 있다. 본 발명에서는 산성, 중성 및 알카리 등 모든 pH 조건의 키토산 수용액의 사용을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 키토산 수용액의 키토산의 농도는 0.001 내지 10 %w/v일 수 있고, 상기 키토산의 분자량은 300,000 이하일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 iii) 단계 이전에 키토산 분자량이 5,000보다 크거나 중성 pH에서 수용성이 아닌 경우에 키토산을 0 내지 20%의 아세트산에 첨가하는 단계; 를 추가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 키토산 분자량이 5,000 미만이어서 수용성인 경우에 바람직한 키토산 수용액의 pH는 pH 7 내지 pH 14 일 수 있다. 키토산 분자량이 커서 중성 pH(pH 7)에서 수용성이 아닌 경우에는 바람직한 키토산 수용액의 pH 범위는 pH 1 내지 pH 7 일 수 있다. 수용성인 키토산 올리고머(oligomer)는 항염(anti-inflammation), immuno-stimulation, 항암(anti-tumor), 항비만(anti-obesity), anti-hypertension, 항알츠하이머(anti-Altzheimer’disease), 조직재생촉진, 약물과 DNA 전달증대, 항균, 항산화 및 칼슘흡수증진 효과의 생물학적 특성을 가지므로, 수용성 키토산 올리고머의 적용이 바람직하다.

본 발명에서 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자 제조를 위한 더욱 구체적인 예를 <실시예 1>과 같이 수행하고, 분석결과로서 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자의 수율, 입도분포, 제타포텐셜 및 원소분석을 수행하고, 흡광도 분석을 위한 커큐민에 대한 검량선을 도 1에 나타내었다. 또한 제조된 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 커큐민 담지율을 구하기 위하여, 알부민의 커큐민에 대한 매우 큰 친화성(affinity)를 고려하여 커큐민을 담지한 알부민 입자의 커큐민 담지율로 대신한 <실시예 2>를 수행하였다.

이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 일 구체적인 예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

커큐민을 담지한 알부민-키토산-푸코이단 입자의 제조

2500 mg의 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, 이하 BSA)를 100 ml 증류수에 용해하여 만든 2.5 %w/v BSA 용액 2 ml을 40 ml 시험관에 담은 후에, 0.1%w/v 푸코이단 수용액 5 ml를 BSA 용액에 첨가하여 충분히 교반하였다. BSA와 푸코이단이 충분히 혼합되도록 교반된 용액을 900 rpm 조건으로 교반하면서, 교반 중인 용액에 100 mg 커큐민을 100 mml의 99.9% 에탄올에 용해한 0.1 %w/v 커큐민 용액 8 ml를 적하하였다. 혈청알부민, 푸코이단 및 커큐민의 질량비를 50 : 5 : 8로 하였다. 커큐민 용액의 적하를 마치고 500 rpm으로 교반한 15분 후에, 가교를 위하여 8%의 글루타알데히드(glutaraldehyde)의 0.11 ml를 첨가하고 커큐민의 분해를 방지하기 위해 암(darkness) 조건에서 24 시간 동안 교반하였다. 24 시간 교반이 끝난 후에, 0.2% 초산 100 ml에 100 mg 키토산을 용해시킨 0.1 %w/v 키토산 용액 10 ml을 900 rpm 조건에서 적하시키고 적하가 끝난 시점부터 30분간 교반시켰다. 교반 시킨 용액을, 105℃에서 건조시킨 팔콘튜브에 넣고 10,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 시료에서 상층액과 입자를 분리하였다. 이와 같이 분리시킨 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자는 -75℃의 극저온냉동고에서 24 시간 이상 동결시킨 후에 동결 건조시켰다. 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자의 특성은 다음과 같이 분석되었다. 첫 번째로 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자 수율(yield) 분석결과는 83.77(±2.23)%로서 가교제를 첨가하는 경우가, 가교제를 첨가하지 않는 경우보다 커큐민 담지 키토산-푸코이단 나노입자 수율이 두 배 이상 커졌다. 둘째로서 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자의 입도분포 분석결과 10.09(±1.42)μm이었다. 셋째로서 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자의 제타포텐셜 분석결과는 18.1(±0.7)mV이었다. 마지막 특성으로서 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자의 원소분석결과는 하기 표 1과 같다.

원소	함유량 (%)
Nitrogen	11.38%
Carbon	50.56%
Hydrogen	6.81%
Sulfur	1.82%

위와 같은 원소분석 결과에 따라서 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자 100 mg 당 황(S) 1.82 mg을 함유하였다. 본 실험에 투입된 푸코이단(Sigma, F5316-1G)의 황 함량(7~11%, 약 10%) 및 BSA의 황함량(1.93%)으로부터, 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자 질량의 푸코이단과 BSA의 구성 질량비가 투입질량비와 같다고 가정할 때에 투입된 푸코이단 질량의 75.8%(푸코이단 담지율)가 커큐민 담지 알부민-푸코이단-키토산 입자에 담지되었다.

<실시예 2> 커큐민을 담지한 알부민 나노입자의 입도 및 담지율 분석

500 mg의 소 혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA)를 20 ml 증류수에 용해하여 만든 2.5 % w/v BSA 수용액 2 ml을 40 ml 시험관에 담고 500 rpm으로 교반 중에, 100 mg 커큐민을 100 mml의 99.9% 에탄올에 용해한 0.1 %w/v 커큐민 용액 8 ml를 적하하여서 커큐민과 BSA의 질량비를 8:50으로 하였다. 커큐민 용액의 적하를 마치고 500 rpm으로 교반한 15분 후에, 가교를 위하여 8%의 글루타알데히드(glutaraldehyde)의 0.11 ml를 첨가하고 커큐민의 분해를 방지하기 위해 암(darkness) 조건에서 24 시간 동안 교반하였다. 흡광도 분석을 위한 blank 용액은 커큐민이 없는 조건이므로, 500 rpm에 교반 중인 시료와 같은 농도의 BSA 수용액 2 ml에 99.9% ethanol 8 ml를 적하하고 적하를 완료한 시점에서 15 분 후에 8%의 글루타알데히드(glutaraldehyde)의 0.11 ml를 첨가하고 암(darkness) 조건에서 24 시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 105℃에서 하루 동안 건조시킨 팔콘 튜브에 담아 10,000 rpm으로 15 분간 원심분리를 수행하고, 시료의 상층액을 제거한 커큐민을 담지한 혈청단백질 나노입자를 -75℃의 극저온냉동고에서 24 시간 이상 동결시킨 후에 동결건조시켰다. 커큐민 담지율을 측정하기 위해서 시료 상층액의 3.5 ml를 뽑아내어 석영 셀에 담아 UV-spectrophotometer로 425nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 상기 blank 용액의 상층액이고, 분석된 흡광도를 검량선 식에 대입하여 혈청단백질 나노입자에 담지되지 않은 free 커큐민 양을 산출하였다. 커큐민의 검량선은 도 1과 같았다. 분석결과로서 커큐민 담지 혈청단백질 나노입자의 입도 분석 결과는 143.6(±2.5)nm이었고, 커큐민 담지율은 77.12(±1.75)%로서 가교제가 첨가되지 않은 경우보다 커큐민 담지율이 2배 이상 제고되었다. 이러한 커큐민 담지율은 알부민의 커큐민에 대한 매우 큰 친화성(affinity)를 고려하여 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 커큐민 담지율로서 간주하였다.

Claims

(i) 알부민 수용액에 푸코이단 수용액을 혼합하여 알부민-푸코이단 혼합물 수용액을 교반하는 단계;
(ii) 상기 알부민-푸코이단 혼합물 수용액에 난용성 약제를 용매에 용해한 용액을 적하하고 교반하여 난용성 약제를 담지한 입자가 생성된 현탁액(suspension)이 생성되는 단계; 및
(iii) 상기 현탁액에 키토산 수용액을 적하시키고 교반하여서 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 생성하는 단계;
를 포함하는, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 난용성 약제는 커큐민(curcumin), 라이코펜(lycopene), 파클리탁셀(paclitaxel), 이트라코나졸(itraconazole), 이부프로펜(ibuprofen), 사이로리무스(sirolimus), 인도메타신(indomethacin), 코엔자임큐텐(coenzyme Q10), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 일라프라졸(ilaprazol) 및 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 난용성 약물인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 용매는 에탄올 또는 아세톤인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 키토산 수용액의 pH는 pH 1 내지 pH 14인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 키토산 수용액의 키토산 농도는 0.001 내지 10 %w/v인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 키토산 수용액의 키토산 분자량은 300,000 이하인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (iii) 단계에서 키토산 분자량이 5,000 이상이거나 중성 pH에서 수용성이 아닌 경우에 키토산을 0 내지 20%의 아세트산에 에 첨가하는 단계; 를 추가하는, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (ii) 단계 및 (iii) 단계 사이에 가교제를 첨가하여 교반하여 가교 반응시키는 단계를 추가하는, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 가교제는 제니핀(genipin), 글루타알데히드 및 글라이옥살(Glyoxal)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 가교제를 첨가하여 가교 반응시킨 후에 상기 현탁액을 원심분리하여 상층액을 분리시키는 단계;를 추가하는, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 가교제가 글루타알데히드 경우 가교제 대 알부민의 투입 질량비가 0.1:5 내지 1:5이고, 교반 속도는 500 내지 900 rpm이고, 교반시간은 12시간 내지 24시간인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 또는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 또는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)의 농도는 2.5 내지 7.5 %w/v 인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 푸코이단 수용액의 농도는 0.02 내지 5 %w/v 인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (iii) 단계 이후에 알부민-푸코이단-키토산 복합체 입자를 원심 분리하여 상층액을 분리하고, 동결건조 시키는 단계;를 추가하는, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 알부민, 푸코이단 및 난용성 약제의 질량비는 50:2:5 내지 50 :10:15인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 푸코이단 및 키토산의 질량비는 1:1 내지 1:2인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (i) 단계에서 알부민-푸코이단 혼합물 수용액의 교반속도는 500 내지 900 rpm인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 알부민-푸코이단 혼합물 수용액에 난용성 약제를 용매에 용해한 용액을 적하하고 교반하는 속도는 500 내지 900 rpm이고, 교반하는 시간은 15분 내지 30 분인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서 상기 (iii) 단계에서 현탁액에 키토산 수용액을 적하시키고 교반하는 속도는 500 내지 900 rpm이고, 교반하는 시간은 30 내지 60 분인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 난용성 약제가 커큐민이고, 상기 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 입도분포는 300 nm 내지 15 μm이고, 제타포텐셜은 10 내지 50 mV인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 난용성 약제가 커큐민이고, 상기 가교제가 글루타알데히드이고, 상기 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 수율은 80% 이상인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 2항에 있어서 상기 난용성 약제가 커큐민이고, 상기 커큐민을 담지한 알부민-푸코이단-키토산 입자의 질소, 탄소, 수소 및 황의 원소구성은 각각 7 내지 15%, 40 내지 60%, 5 내지 10% 및 1 내지 3%인, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자를 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한, 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자.
(a) 난용성 약제를 포함하는 코어부; 및
(b) 상기 난용성 약제 코어부의 표면의 전체 또는 일부에 알부민-푸코이단-키토산이 코팅된 쉘부;를 포함하는 나노입자.
제 25항에 있어서, 상기 난용성 약제는 커큐민(curcumin), 라이코펜(lycopene), 파클리탁셀(paclitaxel), 이트라코나졸(itraconazole), 이부프로펜(ibuprofen), 사이로리무스(sirolimus), 인도메타신(indomethacin), 코엔자임큐텐(coenzyme Q10), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 일라프라졸(ilaprazol) 및 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 난용성 약물인, 나노입자.