CN105166834A - 一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法 - Google Patents
一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105166834A CN105166834A CN201510562583.1A CN201510562583A CN105166834A CN 105166834 A CN105166834 A CN 105166834A CN 201510562583 A CN201510562583 A CN 201510562583A CN 105166834 A CN105166834 A CN 105166834A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polysaccharide
- gelatin
- preparation
- maillard reaction
- carries out
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 40
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 40
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 title claims abstract description 37
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 title claims abstract description 37
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 108010005094 Advanced Glycation End Products Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000158200 Ulva fasciata Species 0.000 title abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 44
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241000196251 Ulva arasakii Species 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 13
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 238000005204 segregation Methods 0.000 claims description 3
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 4
- 238000013329 compounding Methods 0.000 abstract 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 abstract 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 abstract 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 abstract 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 abstract 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 abstract 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 abstract 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 9
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- -1 hydroxyl radical free radical Chemical class 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 3
- ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M Sodium salicylate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 2
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 229960004025 sodium salicylate Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000196319 Chlorophyceae Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000002789 Panax ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000196252 Ulva Species 0.000 description 1
- 241000196246 Ulvaceae Species 0.000 description 1
- 241000196247 Ulvales Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- BFSYFTQDGRDJNV-AYHFEMFVSA-N fructosyllysine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BFSYFTQDGRDJNV-AYHFEMFVSA-N 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000003895 organic fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 229940079877 pyrogallol Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009329 sexual behaviour Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法，包括如下步骤：(1)以洗净的裂片石莼为原料，利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖，加水配制水溶液，离心过滤后依次采用10kDa、100kDa的超滤膜进行超滤分离，得到10kDa＜分子量＜100kDa的初步分离纯化多糖；(2)用复合酶酶解初步分离纯化多糖，得到酶解产物；(3)将酶解产物配成水溶液，过滤所得滤液经DEAE-Sepharose？Fast？Flow离子柱层析系统进行离子柱层析、Sephadex？G-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，得到多糖酶解物；(4)用碱性蛋白酶酶解明胶，制得明胶肽；(5)多糖酶解物和明胶肽在蒸馏水中于pH？6.5-7.2、70-100℃条件下进行美拉德反应，反应0.5-3小时后得到美拉德反应产物，其具有良好的抗氧化活性。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法。
(二)背景技术:
美拉德反应是广泛存在于食品工业的一种羟基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应，又称羟氨反应，经历复杂的过程最终生成棕色甚至黑色的大分子物质。美拉德反应一方面会造成食品营养价值下降，但另一方面能赋予食品一定的风味，研究表明其主要产物具有良好的抗菌性和乳化性等功能，如EunJungCho用蒸汽加热高丽参发现，随加热时间的延长，其富含的美拉德产物表现出强大的抗氧化性。美拉德产物是食品储藏和加工过程中自身产生的一类物质，是无毒副作用的天然食品抗氧化剂，可以与一些人工合成的具有潜在毒副和致癌作用的抗氧化剂相媲美。
受饮食习惯影响，我国每年的猪皮产量相对较高，其初级加工产品明胶作为医药和食品工业材料，主要用于直接添加,在明胶改性或者修饰应用领域甚少。目前美拉德反应研究多集中在蛋白质与还原糖模式，而蛋白质水解物与还原糖体系研究较少。与蛋白质相比，蛋白水解物肽类反应过程中可以增加与还原糖的接触时间，经美拉德修饰后可以提高功能性质，并能形成特殊的风味物质。为进一步提高明胶的利用价值，拓展明胶应用领域，该研究以猪皮明胶为原料，酶解成明胶肽，制备美拉德肽产物。
LusaniNorahVhangani制得核糖-赖氨酸和果糖赖氨酸两种美拉德产物，由于参与反应的多糖不同表现出了不同的抗氧化性。杂多糖发生美拉德反应的研究则相对较少。樊素芳用红枣多糖与氨基酸发生美拉德反应制备出了具有芝麻酱香味的香料物质。由此可见参与美拉德反应的原料不同，反应产物所表现出的理化性质也会发生改变。
海藻是海洋生物资源的重要组成部分，估计15000余种，主要分为蓝藻、绿藻、红藻和褐藻。我国海藻资源丰富，产量居于世界前列。裂片石莼(Ulvafasciata)属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属，富含糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、粗纤维、无机盐等成分。裂片石莼中含有较多的水溶性硫酸多糖，在我国海藻类中石莼是重要的大型经济藻类，在沿海均有分布，市场上价格便宜。但目前主要应用于饲料、有机肥料方面，产品附加值低，造成资源的严重浪费。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法，该美拉德反应产物具有良好的抗氧化活性。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法，包括如下步骤：
(1)以洗净的裂片石莼为原料，利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖；将裂片石莼粗多糖加水配制水溶液，离心去除颗粒性不溶物后取上清液过0.45μm微孔滤膜，依次采用10kDa、100kDa的超滤膜进行超滤分离，并分别将截留液和透过液减压浓缩和冷冻干燥，得到10kDa＜分子量＜100kDa的初步分离纯化多糖；
(2)用复合酶酶解初步分离纯化多糖，然后选择孔径大小为500kDa规格的透析袋，对酶解反应液流水透析，透析液经浓缩、冷冻干燥得到酶解产物；所述复合酶是果胶酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按照质量比1:1：0.4混合得到；
(3)将酶解产物配成水溶液并用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液用DEAE-SepharoseFastFlow离子柱层析系统进行离子柱层析，分别以蒸馏水、0.1～0.4mol/LNaCl水溶液进行洗脱，选定最大洗脱峰对应的洗脱液，浓缩、用0.45μm微滤膜过滤得到滤液；所得滤液用SephadexG-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，以蒸馏水进行洗脱，以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到多糖酶解物；
(4)用碱性蛋白酶酶解明胶，将酶解液浓缩、冷冻干燥，制得明胶肽；
(5)步骤(3)制得的多糖酶解物和步骤(4)制得的明胶肽在蒸馏水中于pH6.5-7.2、70-100℃条件下进行美拉德反应，反应0.5-3小时后得到美拉德反应产物。
本发明步骤(1)为现有技术，可按照论文[PingShao,YapingPei,ZhongxianFang,PeilongSun.EffectsofpartialdesulfationonantioxidantandinhibitionofDLD-1cancercellofUlvafasciatapolysaccharide.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2014,65:307-313.]报道的方法进行操作。具体而言，所述的超声波辅助水提醇沉工艺具体按照如下操作：
(1-1)将洗净的裂片石莼阴干后置于乙醇中浸泡10-24小时，然后在55℃～65℃条件下烘干，粉粹得颗粒长度为3～6mm的粉末，得到粉碎物；
(1-2)取步骤(1-1)得到的粉碎物，以1:20～1:80加入蒸馏水，以超声功率240～720W进行超声波辅助提取5～40min，冷却静置0.5～2h，冷冻离心得上清液和沉淀；
(1-3)将步骤(1-2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10～1/15，加入75％～95％的乙醇溶液使样品最终浓度为80～90％，放置过夜，离心，所得沉淀冷冻干燥，得到裂片石莼粗多糖。
进一步，所述的超声波辅助水提醇沉工艺优选按照如下操作：
(1-1)将洗净的裂片石莼阴干后置于乙醇中浸泡10～24小时，然后在55℃～65℃条件下烘干3～5小时，粉粹后过80目筛，得到粉碎物；
(1-2)取步骤(1-1)得到的粉碎物，以料液比1:25加入蒸馏水，以超声功率400W进行超声波辅助提取8min，冷却静置0.5h，离心得上清液和沉淀；
(1-3)将步骤(1-2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10，加入95％的乙醇溶液使样品最终浓度为85％，放置过夜，离心，所得沉淀冷冻干燥，得到裂片石莼粗多糖。
本发明步骤(2)中，复合酶的加入量为初步分离纯化多糖质量的7.5～8.0(优选7.7)％，酶解反应在pH4.30～4.60(优选4.50)、温度55℃条件下进行，反应时间4～6(优选5)h。
本发明步骤(4)中，碱性蛋白酶的加入量为明胶质量的6.5～7.2(优选7)％，酶解反应在pH7.8～8.2(优选8.0)、温度56℃条件下进行，反应时间4～6(优选5)h。
本发明步骤(5)中，多糖酶解物和明胶肽的投料质量比为1：1-1：1.4，优选1:1。
本发明中，果胶酶、葡聚糖酶、木聚糖酶和碱性蛋白酶均可使用市售商品，如果胶酶(3×104U/g)采用阿拉丁试剂；葡聚糖酶(1×104U/g)采用宁夏和氏璧生物技术有限公司；木聚糖酶(5×104U/g)采用宁夏和氏璧生物技术有限公司；碱性蛋白酶(200U/mg)采用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产的产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明针对性选择得率较高的分子量范围10-30k组分裂片石莼多糖为原料，进行酶法修饰，提高其还原糖含量，促进与明胶肽美拉德反应，提高美拉德产物体外抗氧化性。
2)本发明采用复合酶解法降解裂片石莼多糖，针对性的根据该裂片石莼多糖的单糖组成选择性降解，以适度增加其中还原糖的含量，以更利于后续美拉德反应的的进行。
(四)附图说明
图1是美拉德反应产物·OH清除活性。
图2是美拉德反应产物对O2 -·的清除作用。
图3是美拉德反应产物对ABTS清除活性的影响。
图4是美拉德反应产物还原力的影响。
(五)具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：实施例1：
1、裂片石莼多糖提取与分离
原料预处理：裂片石莼经淡水反复冲洗干净，阴干后于95％酒精中浸泡过夜，置60℃烘箱中烘干，粉碎后过80目筛，干燥器中保存备用。
微波辅助提取过程：取适量藻粉，按一定料液比加入蒸馏水，按照设定的参数进行微波辅助提取：微波功率400W、提取时间8min、液料比25mL/g，在此参数下，提取率的可达16.37％。提取完成后冷却静置0.5h，然后以转速10000rpm、温度4℃冷冻离心10min，得上清液和沉淀。取上清液，旋转蒸发浓缩至2倍浓度后，加入95％乙醇溶液使样品最终乙醇浓度为85％，放置过夜，离心得沉淀，加入少量蒸馏水使沉淀溶解，并将残留的少量酒精完全蒸发，冷冻干燥得裂片石莼粗多糖。
称取一定量微波辅助提取的裂片石莼粗多糖，用蒸馏水配制成浓度为5mg/mL左右的粗多糖溶液，离心去除颗粒性不溶物，过0.45μm的微孔滤膜，依次采用10kDa、100kDa的超滤膜进行超滤分离，并分别将截留液和透过液减压浓缩和冷冻干燥，得到三个不同分子量组分的初步分离纯化多糖：分子量＜10kDa的UFP1、10kDa＜分子量＜100kDa的UFP2、分子量＞100kDa的UFP3。选择10kDa＜分子量＜100kDa的UFP2为原料(多糖含量84.74W％，得率8.69W％)。
2、多糖酶解及纯化
粗多糖加入蒸馏水配成20mg/mL的溶液，加入复合酶(果胶酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按照质量比1:1：0.4混合得到)进行酶解，加酶量为多糖质量的7.7％，在pH4.50、水解温度55.0℃条件下水解5h，沸水浴终止反应。选择孔径大小为500kDa规格的透析袋，对酶解反应液流水透析，重复2次，透析液经浓缩、冷冻干燥得到酶解产物；
酶解产物配成水溶液用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液用DEAE-SepharoseFastFlow离子柱层析系统进行离子柱层析，分别以蒸馏水、0.1～0.4mol/LNaCl水溶液进行洗脱，选定最大洗脱峰对应的洗脱液，浓缩、用0.45μm微滤膜过滤得到滤液；所得滤液用SephadexG-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，以蒸馏水进行洗脱，以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到多糖酶解物，样品总糖含量为92.63％。
3、明胶肽的制备
明胶(sigma公司)加入蒸馏水配成20mg/mL的溶液，加入碱性蛋白酶(西安沃尔森生物技术有限公司)进行酶解，加酶量为0.07g/g明胶，在pH8.0、水解温度56℃条件下水解5h，将酶解液浓缩，冷冻干燥，制得明胶肽。
4、美拉德反应产物制备
分别称取多糖酶解物和明胶肽各0.5g溶于100mL蒸馏水中，使多糖酶解物浓度和明胶肽浓度均达到5mg/mL，并将混合液pH调至10.0。将所得溶液各取10mL分装到带塞玻璃试管中，分别于70℃、80℃、100℃下水浴0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，反应所得产物即为美拉德反应产物。将美拉德反应样液均稀释60倍，备用。美拉德反应70℃、80℃、100℃下产物列为UG-70，UG-80，UG-100。
对比实施例
分别称取实施例1步骤2和步骤3制得的多糖酶解物和明胶肽各0.5g溶于100mL蒸馏水中，使多糖酶解物浓度和明胶肽浓度均达到5mg/mL，并将混合液pH调至10.0，保持室温，将样液均稀释60倍，备用，列为UG-25。
实施例3
1、美拉德反应产物清除羟基自由基·OH的测定
移取美拉德反应备用样液各0.8mL，分别加入2mL2mmol/LFeSO4溶液，1mL2mmol/L水杨酸钠和1ml0.1％H2O2，空白对照管以蒸馏水替代UG样液，样品对照管以蒸馏水替代水杨酸钠溶液，恒温水浴1h(37℃)，静置冷却，于510nm波长下测其吸光值。
R％＝[A0-(Ai-Aj)]/A0×100％
式中：A0、Ai、Aj分别代表空白对照、样品及样品对照的吸光度。
羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基之一，也是生物体内毒性最大的自由基，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病发生从而危害生物体。三个反应体系对·OH的清除作用实验结果见图1。实验表明：反应温度越高、反应时间越长，UG清除羟基自由基的能力则越大。UG-100(反应3h)的·OH清除率为57.68％，比UG-70(反应0.5h)高27.57％。三个反应体系的羟基自由基清除活性与中间产物的变化呈一定的正相关性，美拉德反应的中间产物可能对反应体系的羟基自由基清除能力具有重要作用。
2、美拉德反应产物对超氧阴离子自由基O2 -·的清除作用
移取美拉德反应备用样液各0.1mL，加入4.5mL0.05MTris-HCl缓冲溶液(pH8.2)，25℃水浴中恒温10min，加入0.4mL10mM邻苯三酚溶液，摇匀。25℃下反应5min，然后加入0.5mLHCl溶液以终止反应。在325nm波长下测得吸光值。
R％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％
式中：Ai、Aj、Ac分别代表样品、样品对照及空白对照的吸光度。
超氧阴离子自由基是基态氧接受一个电子形成的氧自由基，是其他活性氧的前体，具有细胞毒性、引起细胞畸变。UG对O2 -·的清除作用如图2所示。实验表明：UG美拉德产物随反应温度和时间的升高对超氧阴离子自由基的清除能力会随之增强。UG-70反应0.5hO2 -·的清除率为28.95％，UG-100反应3h对O2 -·的清除率为47.42％，清除率提高18.47％。UG的O2 -·清除活性与中间产物呈一定的相关性，美拉德中间产物对UG的O2 -·清除活性有一定的结果。
3、美拉德反应产物清除ABTS+的测定
将ABTS+(7mmol/L，5mL)与过硫酸钾溶液(2.4mmol/L，5mL)混合均匀，室温避光条件下反应12～16h，制得ABTS自由基储备液。使用磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.4)将储备液稀释至其在734nm处吸光值为0.70±0.02备用。取美拉德反应备用样液各2mL，加2mLABTS自由基溶液，于暗处反应1h，记录其在734nm处的吸光度。
R％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％
式中：Ai、Aj、Ac分别代表样品、样品对照及空白对照的吸光度。
ABTS·在734nm处有特征吸光值，加入抗氧化物质后，体系的蓝绿色降低，通过测定吸光值的变化得到ABTS·清除活性。UG对ABTS·的清除作用实验结果见图3。实验表明：三个反应体系对ABTS·的清除能力并不随反应温度的升高而增强，其清除能力依次为UG-100、UG-70、UG-80。这可能是由于较高的温度会破坏反应原料本身的一部分具有抗氧化性的物质，而相对较低的温度又不利于美拉德物质的生成，故在ABTS·的清除作用中UG-80体系处于弱势。
4、美拉德反应产物还原力的测定
取美拉德反应备用样液各1mL，加入1mL0.2mol/LpH6.6的磷酸盐缓冲液和2.0mLl％的铁氰化钾溶液，混匀，50℃保温20min，再加入2.5mL质量分数10％TCA，冷却，加入1.0mL0.1％FeC13，反应10min后在700nm波长处测吸光值。
在酸性条件下，抗氧化剂可将Fe3+还原为蓝色的Fe2+，在593nm处有特征吸光值，通过测定Fe2+的含量即可判断还原力。UG的还原力实验结果见图4。实验表明：UG的还原力测定结果与ABTS·清除实验结果相似，三个体系的还原力强度为：UG-100>UG-70>UG-80。其原因可能是反应温度对原有抗氧化物质的破坏和对美拉德物质生成的抑制，使UG-80的还原力低于其他两个反应体系。
Claims (7)
1.一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法，包括如下步骤：
(1)以洗净的裂片石莼为原料，利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖；将裂片石莼粗多糖加水配制水溶液，离心去除颗粒性不溶物后取上清液过0.45μm微孔滤膜，依次采用10kDa、100kDa的超滤膜进行超滤分离，并分别将截留液和透过液减压浓缩和冷冻干燥，得到10kDa＜分子量＜100kDa的初步分离纯化多糖；
(2)用复合酶酶解初步分离纯化多糖，然后选择孔径大小为500kDa规格的透析袋，对酶解反应液流水透析，透析液经浓缩、冷冻干燥得到酶解产物；所述复合酶是果胶酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按照质量比1:1：0.4混合得到；
(3)将酶解产物配成水溶液并用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液用DEAE-SepharoseFastFlow离子柱层析系统进行离子柱层析，分别以蒸馏水、0.1～0.4mol/LNaCl水溶液进行洗脱，选定最大洗脱峰对应的洗脱液，浓缩、用0.45μm微滤膜过滤得到滤液；所得滤液用SephadexG-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，以蒸馏水进行洗脱，以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到多糖酶解物；
(4)用碱性蛋白酶酶解明胶，将酶解液浓缩、冷冻干燥，制得明胶肽；
(5)步骤(3)制得的多糖酶解物和步骤(4)制得的明胶肽在蒸馏水中于pH6.5-7.2、70-100℃条件下进行美拉德反应，反应0.5-3小时后得到美拉德反应产物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，复合酶的加入量为初步分离纯化多糖质量的7.5～8.0％，酶解反应在pH4.30～4.60、温度55℃条件下进行，反应时间4～6h。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，复合酶的加入量为初步分离纯化多糖质量的7.7％，酶解反应在pH4.50、温度55℃条件下进行，反应时间5h。
4.如权利要求1～3之一所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，碱性蛋白酶的加入量为明胶质量的6.5～7.2％，酶解反应在pH7.8～8.2、温度56℃条件下进行，反应时间4～6h。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，碱性蛋白酶的加入量为明胶质量的7％，酶解反应在pH8.0、温度56℃条件下进行，反应时间5h。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，多糖酶解物和明胶肽的投料质量比为1：1-1：1.4。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，多糖酶解物和明胶肽的投料质量比为1：1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510562583.1A CN105166834B (zh) | 2015-09-07 | 2015-09-07 | 一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510562583.1A CN105166834B (zh) | 2015-09-07 | 2015-09-07 | 一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105166834A true CN105166834A (zh) | 2015-12-23 |
| CN105166834B CN105166834B (zh) | 2017-12-05 |
Family
ID=54889679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510562583.1A Expired - Fee Related CN105166834B (zh) | 2015-09-07 | 2015-09-07 | 一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105166834B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111264662A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-12 | 江西师范大学 | 鱼明胶乳液及其制备方法和鱼明胶咖啡奶精以及它们的应用 |
| CN112826092A (zh) * | 2019-11-22 | 2021-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种果胶类黑精及制备方法 |
| CN113603799A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-11-05 | 南昌大学 | 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法 |
| CN116019215A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-04-28 | 江苏御娘食品有限公司 | 一种香味功能性大豆蛋白调味料及其制备方法与应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101589775A (zh) * | 2009-06-26 | 2009-12-02 | 华南理工大学 | 一种超声波低温制备食用安全性美拉德反应产品的方法 |
| WO2010008452A1 (en) * | 2008-06-24 | 2010-01-21 | Nestec S.A. | Maillard flavor compositions and methods for making such compositions |
| CN102308904A (zh) * | 2011-07-20 | 2012-01-11 | 华南理工大学 | 一种快速制备糖肽的方法 |
| CN104250309A (zh) * | 2014-10-08 | 2014-12-31 | 浙江工业大学 | 一种裂片石莼多糖及其应用 |
-
2015
- 2015-09-07 CN CN201510562583.1A patent/CN105166834B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010008452A1 (en) * | 2008-06-24 | 2010-01-21 | Nestec S.A. | Maillard flavor compositions and methods for making such compositions |
| CN101589775A (zh) * | 2009-06-26 | 2009-12-02 | 华南理工大学 | 一种超声波低温制备食用安全性美拉德反应产品的方法 |
| CN102308904A (zh) * | 2011-07-20 | 2012-01-11 | 华南理工大学 | 一种快速制备糖肽的方法 |
| CN104250309A (zh) * | 2014-10-08 | 2014-12-31 | 浙江工业大学 | 一种裂片石莼多糖及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 刘平等: "大豆肽-木糖美拉德反应体系中肽的降解与交联规律研究", 《食品工业科技》 * |
| 孙常雁 等: "乳清蛋白肽美拉德反应产物的抗氧化活性与稳定性]", 《食品科学》 * |
| 孟思彤 等: "多糖的化学修饰对其生物活性影响研究进展", 《天然产物研究与开发》 * |
| 肖怀秋等: "美拉德反应及其在食品风味中的应用研究", 《中国食品添加剂》 * |
| 陈蒙: "裂片石莼多糖的提取分离、抗氧化活性及其保润应用研究", 《万方中国学位论文全文数据库》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112826092A (zh) * | 2019-11-22 | 2021-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种果胶类黑精及制备方法 |
| CN111264662A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-12 | 江西师范大学 | 鱼明胶乳液及其制备方法和鱼明胶咖啡奶精以及它们的应用 |
| CN113603799A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-11-05 | 南昌大学 | 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法 |
| CN113603799B (zh) * | 2021-06-30 | 2023-01-03 | 南昌大学 | 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法 |
| CN116019215A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-04-28 | 江苏御娘食品有限公司 | 一种香味功能性大豆蛋白调味料及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105166834B (zh) | 2017-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101160327A (zh) | 获得果胶的方法 | |
| CN105166834A (zh) | 一种裂片石莼多糖与明胶肽美拉德反应产物的制备方法 | |
| CN103540638B (zh) | 一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法 | |
| CN106565838B (zh) | 一种稳定性好的藻蓝蛋白及其制备方法、组合物和应用 | |
| CN104250286B (zh) | 一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽及其制备方法和用途 | |
| Yin et al. | Complex enzyme-assisted extraction, purification, and antioxidant activity of polysaccharides from the Button Mushroom, Agaricus bisporus (Higher Basidiomycetes) | |
| CN110916198A (zh) | 一种利用黄秋葵发酵酒酒渣同时制备果胶多糖和黏性糖蛋白的方法 | |
| CN111560412A (zh) | 一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法 | |
| JP2020122155A (ja) | ゲニポシド、ゲニピン、又はこれらの両方を除去する方法 | |
| CN109497469B (zh) | 一种山茱萸冲调粉的制备方法 | |
| CN104026329A (zh) | 一种天然高含量硒源大米肽的提取方法 | |
| CN104774827A (zh) | 一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法 | |
| CN112851722B (zh) | 一种栀子苷和栀子黄色素的制备方法 | |
| CN108713763A (zh) | 一种高品质柠檬膳食纤维复合酶制备方法 | |
| CN111892664A (zh) | 一种皂角米多糖胶的制备方法 | |
| Zhao et al. | In vitro antioxidant and antitumor activities of polysaccharides extracted from the mycelia of liquid-cultured Flammulina velutipes | |
| WO2009128264A1 (ja) | 醗酵生成物の製造方法および醗酵生成物 | |
| CN113439849B (zh) | 一种含有高良姜成分的海洋鱼肽及其制备方法 | |
| Jamshidi et al. | Optimization of protein extraction from Gelidiella acerosa by carbohydrases using response surface methodology | |
| WO2018133600A1 (zh) | 一种高活性甘蔗花色苷的制备方法 | |
| Fujisue et al. | Preparation and antioxidative activity of 1, 5-anhydrofructose | |
| CN109548951A (zh) | 藜麦麸皮蛋白质的提取方法及其在食品方面的应用 | |
| CN104188006A (zh) | 一种荞麦提取物、抑制果汁褐变的方法、制备苹果汁的方法 | |
| JPH06113871A (ja) | 柑橘類に含有されるフラボノイド化合物およびリモノイド化合物の分離回収方法 | |
| JPS63226294A (ja) | セロビオ−スの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181219 Address after: 311107 No. 6, Ginkgo Road, Renhe Street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province Patentee after: ZHEJIANG XINDIJIAHE FOOD CO., LTD. Address before: 310014 Chao Wang Road, Xiacheng City, Hangzhou, Zhejiang Province, No. 18 Patentee before: Zhejiang University of Technology |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171205 Termination date: 20190907 |