CN113880963B

CN113880963B - 一种桑黄多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113880963B
Application number: CN202111356036.XA
Authority: CN
Inventors: 杨焱; 楚文琪; 吴迪; 李正鹏; 陈万超; 张忠; 李文; 张劲松
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2041-11-16
Also published as: CN113880963A

Abstract

本发明提供了一种桑黄多糖及其制备方法和应用，涉及食用菌加工技术领域。本发明首次以酒泡桑黄为制备原料，采用水提‑分级醇沉及分离纯化的方法制备桑黄多糖。酒泡桑黄中的小分子杂质含量低，本发明以酒泡桑黄为制备原料，提高了多糖的纯度，得到的桑黄多糖的分子量分布低，还实现了泡酒后的桑黄残渣的废物再利用；采用水提‑分级醇沉的工艺，得到的桑黄多糖的单糖以葡萄糖、半乳糖和甘露糖为主，还有少量岩藻糖和果糖，桑黄多糖的分子量小且分布窄、纯度高，易于被人体吸收利用。而且，本发明制备的桑黄多糖的体外刺激巨噬细胞产生NO的活性和抗氧化活性高。

Description

一种桑黄多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食用菌加工技术领域，具体涉及一种桑黄多糖及其制备方法和应用。

背景技术

桑黄是一种珍稀的药用真菌，最早记载于中药学专著《神农本草经》中。现代桑黄的研究起于二战后，研究发现桑黄对癌症具有防治作用。我国吉林的长白山地区有较多的野生杨树上生长的桑黄Sanghuangporous.Vaninii，该菌株经野生组织分离后，经过多年的人工驯化栽培，目前在长白山地区已形成较大规模的种植。长白山因林业资源丰富，当地桑黄的种植以椴木栽培为主，通常是三年期的椴木栽培，生长的子实体干重可达150克左右。桑黄中富含甾醇、黄酮和多糖等活性物质，桑黄通过浸酒后饮用日渐成为一种养生途径。

中国专利CN106674368A公开了一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，包括如下步骤：将子实体水提胞内多糖的残渣粉碎、过筛、沸水反复提取，将所得桑黄残渣烘干后超细粉碎，沸水提取后采用20％乙醇水溶液沉淀，制得的活性粗多糖主要为大分子葡聚糖，分子量为2500～3500kDa。然而，上述制备方法得到的活性粗多糖的分子量大，导致其不宜被人体吸收利用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑黄多糖及其制备方法和应用。本发明提供的桑黄多糖的分子量小且分布窄，易被人体吸收利用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种桑黄多糖的制备方法，包括以下步骤：

将酒泡桑黄进行水提，得到水提物；

利用乙醇水溶液对所述水提物进行第一醇沉，得到醇沉液；所述乙醇水溶液的乙醇体积分数为20～30％；

将乙醇与所述醇沉液混合，将得到的混合液进行第二醇沉，将得到的桑黄粗多糖进行分离纯化，得到桑黄多糖；所述混合液中乙醇体积分数为50～55％。

优选的，所述酒泡桑黄与水提用水的质量比为1：20～25。

优选的，所述水提用水为沸水，时间为2～3h。

优选的，所述酒泡桑黄与乙醇水溶液的料液比为1g：10～20mL。

优选的，所述第一醇沉的温度为4℃，时间为8h。

优选的，所述第二醇沉的温度为4℃，时间为8h。

优选的，所述分离纯化地方式包括凝胶柱层析。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的桑黄多糖，所述桑黄多糖的单糖单元包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖；

所述桑黄多糖的数均分子量为2.331×10⁴。

本发明还提供了上述技术方案所述的桑黄多糖在抗氧化或制备免疫药物中的应用。

本发明提供了一种桑黄多糖的制备方法，包括以下步骤：将酒泡桑黄进行水提，得到水提物；利用乙醇水溶液对所述水提物进行第一醇沉，得到醇沉液；所述乙醇水溶液的乙醇体积分数为20～30％；将乙醇与所述醇沉液混合，将得到的混合液进行第二醇沉，将得到的桑黄粗多糖进行分离纯化，得到桑黄多糖；所述混合液中乙醇体积分数为50～55％。本发明以酒泡桑黄残渣为原料，桑黄中小分子质溶性物质经过酒泡被除去，提高了得到的桑黄多糖的纯度以及活性；采用水提-分级醇沉的工艺，经体积分数为20～30％的乙醇水溶液醇沉能够去除大分子多糖组分；经体积分数为50～55％的乙醇水溶液醇沉将分子量分布相对窄的多糖组分分离出来，提高了桑黄多糖的纯度，经过分离纯化将均一组分的桑黄多糖集中分离出来，提高了桑黄多糖的纯度，得到的桑黄多糖的单糖单元以葡萄糖、半乳糖和甘露糖为主，还有少量岩藻糖和果糖，桑黄多糖的分子量为2.331×10⁴，分子量小且分布窄，纯度高，易于被人体吸收利用。

而且，本发明提供的制备方法首次以酒泡后的桑黄残渣为制备原料，酒泡后的桑黄残渣中的小分子杂质含量低，提高了实现了桑黄多糖的纯度且降低其分子量分布，还实现了泡酒后的桑黄残渣的废物再利用。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的桑黄多糖。本发明提供的桑黄多糖分子量小、分子量分布均一性高且纯度高，体外刺激巨噬细胞产生NO的活性和抗氧化活性高，在抗氧化以及制备免疫药物方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的桑黄粗多糖的凝胶柱层分离纯化

图2为实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖的分子量分布图；

图3为SP50-1对DPPH自由基的清除结果；

图4为SP50-1对ABTS自由基的清除结果。

具体实施方式

本发明提供了一种桑黄多糖的制备方法，包括以下步骤：

将酒泡桑黄进行水提，得到水提物；

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明将酒泡桑黄进行水提，得到水提物。

在本发明中，所述酒泡桑黄的制备方法优选包括以下步骤：将桑黄子实体依次进行水洗、切片、第一干燥、酒浸泡、固液分离，将所得残渣第二干燥后粉碎，得到酒泡桑黄。在本发明中，所述桑黄子实体优选为椴木栽培的瓦宁桑黄子实体(Sanghuangporous.vaninii)，产地优选为长白山地区。本发明对于所述水洗没有特殊限定，能够将桑黄子实体表面的杂质去除即可。本发明对于所述切片没有特殊限定，能够保证切片得到的桑黄片的厚度为1～3mm即可。在本发明中，所述第一干燥的方式优选为烘干，所述干燥的温度的优选为50～70℃，更优选为60℃；本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。在本发明中，所述酒浸泡的温度优选为室温；所述酒浸泡的时间优选为30天。本发明对于所述酒浸泡用酒没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售白酒即可；在本发明的实施例中，所述酒优选为酒精度数为50°的高粱酒。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述第二干燥的方式优选为烘干，所述干燥的温度的优选为50～70℃，更优选为60℃；本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。本发明对于粉碎的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎方式粉碎至酒泡桑黄呈颗粒状即可。

在本发明中，所述酒泡桑黄与水提用水的质量比优选为1：20～25，更优选为1：21～24，进一步优选为1：22～23；所述水优选为沸水；所述水提的总时间优选为4～6h，更优选为5h。在本发明中，所述水提的次数优选为2～3次。

所述水提后，本发明优选还包括浓缩，得到水提物。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可；所述浓缩的浓缩比优选为1g：1～1.5mL，更优选为1g：1.1～1.4mL，进一步优选为1g：1.2～1.3mL。

得到水提物后，本发明利用乙醇水溶液对所述水提物进行第一醇沉，得到醇沉液。在本发明中，所述乙醇水溶液的醇体积分数为20～30％，优选为22～28％，更优选为24～25％。在本发明中，所述酒泡桑黄与乙醇水溶液的料液比优选为1g：10～20mL，更优选为1g：12～18mL，进一步优选为1g：15～16mL。在本发明中，所述第一醇沉的温度优选为4℃；所述第一醇沉的时间优选为8h；所述第一醇沉优选在静置条件下进行；所述第一醇沉优选在冰箱中进行。

所述第一醇沉后，本发明优选还包括将所述第一醇沉的体系固液分离，得到液体组分和固体组分；将所得固体组分进行醇洗，得到醇洗液；合并所述液体组分和醇洗液，得到醇沉液。在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心分离；所述离心分离的速度优选为8000r/min；所述离心分离的时间优选为18～24h，更优选为24h。在本发明中，所述醇洗优选利用乙醇水溶液进行，所述乙醇水溶液的醇体积分数优选为20～30％，更优选为22～28％，进一步优选为24～25％；所述醇洗的温度优选为室温；所述醇洗的次数优选为2～3次。

得到醇沉液后，本发明将乙醇与所述醇沉液混合，将得到的混合液进行第二醇沉，将得到的桑黄粗多糖进行分离纯化，得到桑黄多糖。

在本发明中，所述所述混合液中乙醇体积分数为50～55％，优选为51～54％，进一步优选为52～53％；所述第二醇沉的温度优选为4℃；所述第二醇沉的时间优选为8h；所述第二醇沉优选在静置条件下进行；所述第二醇沉优选在冰箱中进行。

所述第二醇沉后，本发明优选还包括将所述第二醇沉的体系固液分离，将得到的固体组分依次进行进行醇洗、水溶和干燥，得到桑黄粗多糖。在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为8000r/min；所述离心分离的时间优选为18～24h，更优选为24h。在本发明中，所述醇洗优选利用乙醇水溶液进行，所述乙醇水溶液的醇体积分数优选为50～55％，更优选为51～54％，进一步优选为52～53％；所述醇洗的温度优选为室温；所述醇洗的次数优选为2～3次。在本发明中，所述干燥优选包括依次进行的除醇和冻干；所述除醇的方式优选为水浴挥发；所述除醇的温度优选为100℃，本发明优选除醇至无醇味即可；所述冻干的温度优选为-60～-50℃，更优选为-55℃；冻干至恒重即可。

在本发明中，所述分离纯化优选包括：将桑黄多糖溶解于水中后离心分离，将所得上清液进行色谱分离纯化。在本发明中，所述水优选包括蒸馏水或去离子水；所述溶解优选在加热条件下进行，加热至桑黄多糖溶解于水中即可。在本发明中，所述离心分离的速度优选为13000r/min；所述离心分离的时间优选为15min。在本发明中，所述色谱分离纯化优选包括凝胶柱层分离纯化。在本发明中，所述凝胶柱层分离纯化的条件优选包括：凝胶色谱柱优选为PCC26/1000column；凝胶优选为SephacrylTMS-300High Resolution；流动相优选为去离子水，所述流动相流速优选为2mL/min。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的桑黄多糖，所述桑黄多糖的单糖单元包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖。在本发明中，所述桑黄多糖优选包括以下质量分数的单糖：岩藻糖为8.65％，半乳糖为25.58％，葡萄糖为44.33％，甘露糖为14.6％，果糖为6.83％。在本发明中，所述桑黄多糖的数均分子量为2.331×10⁴。

本发明提供了上述技术方案所述的桑黄多糖在抗氧化或制备免疫药物中的应用。在本发明中，所述桑黄多糖具有体外刺激巨噬细胞的活性和抗氧化活性，在抗氧化以及制备免疫药物中具有良好的应用前景。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中桑黄多糖及其制备方法和应用的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)将长白山椴木栽培的瓦宁桑黄子实体(Sanghuangporous.vaninii)依次进行水洗、切片至厚度为1～3mm、在60℃条件下烘干、用50°高粱酒浸泡30天和过滤，将滤渣在60℃条件下烘干后粉碎至颗粒状，得到酒泡桑黄。

(2)将酒泡桑黄置于沸水中第一水提2h后过滤，得到第一水提液和滤渣；将所述滤渣置于沸水中第二水提2h后过滤，得到第二水提液；合并第一水提液和第二水提液后浓缩至浓缩比为1g:1mL，得到水提物；其中，第一提取和第二提取过程中，酒泡桑黄与沸水的质量比均为1:20。

(3)在所述水提物中加入体积分数为20％的乙醇水溶液(料液比为混合均匀，在4℃冰箱中、静置条件下第一醇提8h，以8000r/min的速度离心24h，得到液体组分和固体组分；利用体积分数为20％的乙醇水溶液将所述固体组分醇洗2次，将得到的醇洗液与所述液体组分合并，得到醇沉液；其中，酒泡桑黄与第一醇提用乙醇水溶液的料液比为1g：15mL。

(4)在所述醇沉液中加入乙醇至体系中乙醇的体积分数为50％，混合均匀后，在4℃冰箱中、静置条件下第二醇提8h，以8000r/min的速度离心24h，用体积分数为50％的乙醇水溶液对得到固体组分进行醇洗2次，加入蒸馏水溶解后在100℃、水浴条件下挥发除去乙醇，然后在-55℃条件下冷冻干燥至恒重，得到桑黄粗多糖。

(5)将20mg桑黄粗多糖溶解于2mL去离子水中，加热至溶解后以13000r/min的转速离心15min，取上清进行凝胶柱层分离纯化，得到桑黄多糖。其中，凝胶柱层分离纯化的条件：凝胶色谱柱为PCC26/1000column；凝胶为SephacrylTMS-300High Resolution；流动相为去离子水，流动相流速为2mL/min。

图1为实施例1桑黄粗多糖的凝胶柱层分离纯化的结果，其中，圈出的部分为桑黄多糖。由图1可知，本发明制备得到均一组分的桑黄多糖。

对比例1

按照实施例1的方法制备桑黄多糖，与实施例1的区别仅在于步骤(1)中桑黄子实体未进行酒浸泡，得到桑黄多糖。

对比例2

按照实施例1的方法制备桑黄多糖，与实施例1的区别仅在于，将步骤(3)～(4)替换为：在所述水提物中加入体积分数为20％的乙醇水溶液(料液比为1g：15mL)混合均匀，在4℃冰箱中、静置条件下第一醇提8h，以8000r/min的速度离心24h，得到固体组分，利用体积分数为20％的乙醇水溶液将所述固体组分醇洗2次，加入蒸馏水溶解后在100℃、水浴条件下挥发除去乙醇，然后在-55℃条件下冷冻干燥至恒重，得到桑黄粗多糖。

对比例3

按照实施例1的方法制备桑黄多糖，与实施例1的区别仅在于，将步骤(3)～(4)替换为：在所述水提物中加入体积分数为50％的乙醇水溶液(料液比为1g：15mL)混合均匀，在4℃冰箱中、静置条件下醇提8h，以8000r/min的速度离心24h，用体积分数为50％的乙醇水溶液对得到固体组分进行醇洗2次，加入蒸馏水溶解后在100℃、水浴条件下挥发除去乙醇，然后在-55℃条件下冷冻干燥至恒重，得到桑黄粗多糖。

对比例4

按照实施例1的方法制备桑黄粗多糖，与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中第二醇沉时体系中乙醇的体积分数为70％。

图2为实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖的分子量分布图，由图2可知，本发明制备的桑黄多糖为均一组分，纯度高。

测试例1

实施例1和对比例1～4的得到的桑黄粗多糖的收率

表1实施例1和对比例1～4的得到的桑黄粗多糖的收率

样品	实施例1	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4	对比例5
							收率/％	0.24	0.125	0.11	0.03	0.35	0.91

由表1可知，经过高粱酒浸泡后，桑黄残渣中桑黄粗多糖的收率明显高于未进行酒浸泡的桑黄残渣中桑黄粗多糖的收率。

测试例2

分子量分布

分别5mg将实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖溶解于1mL超纯水中，配制成浓度为5mg/mL的待测溶液。以13000g的转速离心15min，取上清液经0.22μm水相微孔膜过滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析，使用Astra(version6.1.1)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算桑黄粗多糖分子量，结果如表2所示。

HPSEC-MALLS-RI分析条件：分析柱选TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL串联；柱温为30℃；流动相为硝酸钠-叠氮钠-去离子水溶液，其中，硝酸钠浓度为0.05mol/L，叠氮钠浓度为0.02wt％；流动相流速0.5mL/min；上样量为100μL。

表2实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖的分子量分布

	次峰/Mw	主峰/Mw
			实施例1	-	<![CDATA[2.331×10<sup>4</sup>]]>
对比例1	<![CDATA[9.731×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[6.023×10<sup>4</sup>]]>
			对比例2	<![CDATA[2.957×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[2.625×10<sup>4</sup>]]>
对比例3	<![CDATA[3.088×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[2.804×10<sup>4</sup>]]>
			对比例4	<![CDATA[2.967×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[1.217×10<sup>4</sup>]]>

由表2可知，本发明制备的桑黄多糖为均一组分，桑黄多糖的分子量分布窄且纯度高。

实施例1步骤(5)得到的桑黄多糖(记为SP50-1)的单糖单元组成

将准确称取2mg SP50-1于酸水解瓶中，加入3mL浓度为2mol/L的三氟乙酸(TFA)水溶液，在110℃条件下加热水解4h，水解结束后通入N₂吹干，之后加入3mL甲醇吹干，重复N₂吹干和甲醇继续吹干操作4～5次以除去残留TFA。用超纯水将反应后的样品完全溶解，按合适浓度稀释后，吸取1mL，以13000g的转速离心10min，吸取上清液上样进行高效阴离子交换色谱法检测，测试结果如表3所示。

高效阴离子交换色谱法检测条件：色谱柱为Dionex公司CarboPacTMPA20检测柱(3mm×150mm)；柱温为30℃；检测器为脉冲安培检测器；流动相为NaOH-NaAc-去离子水溶液，其中，NaOH浓度为0.05mol/L，NaAc浓度为1mol/L。

表3 SP50-1的单糖单元

单糖	岩藻糖	半乳糖	葡萄糖	甘露糖	果糖
						含量/wt％	8.65	25.58	44.33	14.6	6.83

由表3可知，实施例1制备的桑黄残渣多糖的单糖单元主要有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖5种，其中葡萄糖的占比为44.33wt％，相对较高；其次是半乳糖，占比为25.58wt％；此外还含有少量甘露糖和岩藻糖。

测试例4

实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖的体外刺激巨噬细胞释放NO的活性试验

将桑黄多糖透析(3500Da)3天后置于灭过菌的离心管中，在无菌条件下用PBS配成5mg/mL的桑黄多糖溶液，以12000g的转速离心30min，在无菌操作台中将离心得到的上清液转入灭菌管中，经0.22μm水相微孔膜过滤，然后用PBS稀释至浓度分别为0.5mg/mL、2mg/mL、5mg/mL桑黄多糖溶液，备用。

细胞培养：取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞株(购自上海中科院细胞所)，用DMEM完全培养基(购自Gibco公司)在37℃、5％CO₂条件下传代培养，用0.05％胰酶溶液消化，将得到的混悬液以1000r/min的转速离心3min后收集细胞，计数备用。

Griess试剂的配制：在烧杯中加入6.25mL H₃PO₃和250mL蒸馏水，加入2.5g 4-氨基苯磺酰胺(sulfanilamide，Sigma公司)和0.25g盐酸萘乙二胺(naphthylethylenediaminedihydrochloride，Sigma公司)，用磁力搅拌器至全部溶解，置于棕色试剂瓶中在4℃冰箱保存。

标准曲线：将亚硝酸钠溶解于蒸馏水中，配成浓度梯度为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L和40μmol/L的系列亚硝酸钠溶液；分别取100μL系列亚硝酸钠溶液于96孔板孔中，加入50μL Griess试剂，测定系列亚硝酸钠溶液在543nm处的吸光值，每个浓度3重复测试3次，根据吸光值绘制标准曲线。

样品刺激巨噬细胞释放NO量的测定：收集RAW264.7细胞，用无色RPMI1640培养基(10％胎牛血清+1％抗生素液体，购自Gibco公司)将细胞稀释至5×10⁵个/mL，将得到RAW264.7细胞液加入到96孔板中，每孔加入量为180μL，然后分别加入20μL桑黄多糖溶液、(桑黄多糖作用终浓度分别为50μg/mL、200μg/mL和500μg/mL)、阳性对照10μg/mL LPS(细菌脂多糖，作用终浓度为1μg/mL)和阴性对照PBS，在37℃条件下培养48h，取100μL培养得到的上清液置于96孔板孔中，每孔加入50μL Griess试剂，在室温条件下孵浴10min后测定在543nm处的吸光值，根据标准曲线计算RAW264.7细胞的NO的释放量。

实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的测试结果表4所示。

表4实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性

由表4可知，与未经酒泡的桑黄残渣制备的桑黄多糖相比，经泡酒后的桑黄残渣制备的桑黄多糖具有更高的体外激活巨噬细胞释放NO的活性，在免疫方面具有广阔的应用前景。

测试例5

SP50-1的体外抗氧化活性试验

(1)体外抗氧化活性试验

DPPH自由基清除能力的测定：将DPPH用无水乙醇溶解后定容至100mL容量瓶中，配制成浓度为0.1mmoL/L的DPPH溶液，避光保存。用蒸馏水将SP50-1溶解，分别配制成浓度为0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL和的SP50-1待测液。取1mL桑黄多糖加入到试管中作为样品组，空白组用蒸馏水代替桑黄多糖，向样品组与对照组中分别加入1mL DPPH溶液混匀，空白组加1mL无水乙醇混匀，在室温下避光静置30min，以VC为阳性对照，在517nm处测定吸光度值，按照式(1)计算SP50-1的DPPH自由基清除率，计算其IC₅₀。测试结果如图3所示和表5。

式(1)中，A₁为样品组的吸光度，A₂为溶剂本底的吸光度，A₀为空白组的吸光度。

表5实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖对DPPH的清除效果

浓度(mg/mL)

0.025

0.05

0.1

0.15

0.2

0.4

<![CDATA[IC<sub>50</sub>]]>

实施例1

46.74％

68.07％

89.73％

91.34％

92.78％

91.86％

0.025mg/mL

对比例1

41.69％

65.17％

88.91％

88.41％

88.74％

89.40％

0.028mg/mL

对比例2

38.88％

54.12％

86.68％

89.41％

89.57％

88.93％

0.035mg/mL

对比例3

42.81％

61.10％

88.21％

90.37％

91.18％

89.89％

0.03mg/mL

对比例4

37.85％

54.14％

81.42％

87.49％

89.01％

89.25％

0.037mg/mL

由图3和表5可知，SP50-1对DPPH自由基有较好的清除效果，其IC₅₀值为0.025mg/mL。

(2)ABTS自由基清除能力的试验

配浓度为2.45mmoL/L的过硫酸钾水溶液、7mmoL/L的ABTS水溶液和pH＝6.6的磷酸缓冲液，将5mL过硫酸钾水溶液与5mLABTS溶液混匀，得到ABTS测定液，并避光静置12h备用，使用前将ABTS测定液用磷酸缓冲液稀释至734nm处吸光度值为0.7。

用蒸馏水将SP50-1溶解，分别配制成浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1mg/mL的SP50-1待测液。

样品组：分别取0.2mL各SP50-1待测液与2mL ABTS测定液混匀，反应6min；对照组：分别取0.2mL各SP50-1待测液与2mL磷酸缓冲液混匀，反应6min；空白组：分别取0.2mL各SP50-1待测液与2mL蒸馏水混匀，反应6min。在734nm下测定的样品组的吸光值记为A₁，对照组的吸光度值记为A₂，空白组的吸光度值记为A₀，按照式(1)计算ABTS自由基清除率，计算其IC₅₀。结果如图4和表6所示。

表6实施例1和对比例1～4制备的桑黄多糖对ABTS的清除效果

浓度(mg/mL)

0.05

0.1

0.2

0.6

0.8

1

<![CDATA[IC<sub>50</sub>]]>

实施例1

20.10％

34.60％

61.35％

89.43％

99.51％

0.129mg/mL

对比例1

18.25％

29.02％

51.77％

78.59％

99.60％

99.68％

0.153mg/mL

对比例2

15.52％

24.64％

39.89％

65.84％

84.71％

97.83％

0.203mg/mL

对比例3

12.78％

20.26％

43.00％

59.08％

79.82％

95.98％

0.239mg/mL

对比例4

12.52％

19.28％

32.03％

56.33％

76.39％

92.03％

0.258mg/mL

由表6和图4可知，SP50-1对ABTS自由基有较好的清除效果，其IC₅₀值为0.129mg/mL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种桑黄多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将酒泡桑黄进行水提，得到水提物；所述酒泡桑黄采用的酒为市售白酒，酒浸泡温度为室温，时间为30天；

利用乙醇水溶液对所述水提物进行第一醇沉，得到醇沉液；所述乙醇水溶液的乙醇体积分数为20～25％；

将乙醇与所述醇沉液混合，将得到的混合液进行第二醇沉，将得到的桑黄粗多糖进行分离纯化，得到桑黄多糖；所述混合液中乙醇体积分数为50～55％；所述分离纯化的方式包括凝胶柱层分离纯化，所述凝胶柱层分离纯化的条件包括：凝胶色谱柱为PCC26/1000column，凝胶为SephacrylTMS-300High Resolution，流动相为去离子水。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酒泡桑黄与水提用水的质量比为1：20～25。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述水提用水为沸水，时间为2～3h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酒泡桑黄与乙醇水溶液的料液比为1g：10～20mL。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述第一醇沉的温度为4℃，时间为8h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二醇沉的温度为4℃，时间为8h。

7.权利要求1～6任一项所述制备方法得到的桑黄多糖，所述桑黄多糖的单糖单元包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖；

所述桑黄多糖的数均分子量为2.331×10⁴。

8.权利要求7所述的桑黄多糖在抗氧化或制备免疫药物中的应用。