CN107892725B - 一种仙茅多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种仙茅多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于仙茅加工技术领域，具体涉及一种仙茅多糖及其制备方法和应用。本发明提供的仙茅多糖的制备方法包括水提分级醇沉、碱提醇沉、脱蛋白、透析、冻干、离子交换柱层析和凝胶分子筛柱层析等步骤。使用该方法可获得三种仙茅精多糖COP‑1、COP‑2、COP‑3，本发明还对获得的三种仙茅精多糖的化学结构进行了鉴定，明确了其结构，为探究其药理活性机制提供了结构依据。另外，本发明还提供了仙茅多糖在制备骨质疏松症和/或风湿病及其相关疾病治疗的药品、保健品或功能食品中的应用。

Description

一种仙茅多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于仙茅加工技术领域，具体涉及一种仙茅多糖及其制备方法和应用。
背景技术
骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以骨矿物量减少、骨微结构破坏、骨强度降低，从而导致骨脆性增加和易于发生骨折为特征的全身性骨代谢性疾病。高发人群多为老年人和绝经后的妇女。人体内骨代谢失衡、破骨细胞激活、骨吸收活动增强、骨量丢失增加、成骨细胞功能受到抑制、骨生成活动降低或骨量形成不足等均可导致OP。目前，防治OP的药物大致可分为抑制骨吸收类药物(如：雌激素、双膦酸盐类等)、促进骨形成类药物(如：氟化物、甲状旁腺素等)、促进骨矿化类药物(如：钙剂、维生素D等)，但患者长期服用这些药物均会产生不同程度的不良反应，并引起并发症。
中医药防治OP具有整体疗效好、副反应小的优势，已日渐成为国内外关注的热点。大量实验研究表明中药材中含有多种具有抗骨质疏松和/或风湿病活性的有效成分，包括多糖类、黄酮类、皂苷类等。仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)是石蒜科仙茅属植物，其干燥根茎属常用中药，产自浙江、福建、台湾、四川南部、云南和贵州等地，生于海拔1600米以下的林中、草地或荒坡上。药理研究表明，仙茅具有调节免疫、抗氧化、保肝、保护心血管系统、改善味觉及抗骨质疏松和/或风湿病等作用。
根据2015版《中国药典》记载，仙茅具有补肾阳，强筋骨，祛寒湿的功效，可用于阳痿精冷，筋骨痿软，腰膝冷痛，阳虚冷泻等。多糖是仙茅的主要成分之一，已有报道称仙茅多糖具有调节免疫功能。中国专利申请201210319606.2公开了仙茅多糖及其衍生物的一种用途，该专利所述仙茅多糖及其衍生物可用于制备抗癌化疗药物的增效药剂和抗癌化疗药物的减毒药剂。
目前国内外关于仙茅多糖在抗骨质疏松和/或风湿病活性、均一多糖的结构和活性的研究均未见报道，因此探究仙茅多糖在抗骨质疏松和/或风湿病的活性、均一多糖的结构和活性很有必要。
发明内容
为了解决现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种仙茅多糖，包括仙茅精多糖COP-1、仙茅精多糖COP-2、仙茅精多糖COP-3，本发明还提供了制备上述仙茅精多糖COP-1、仙茅精多糖COP-2、仙茅精多糖COP-3的方法，另外，本发明的再一目的在于提供本发明仙茅多糖的制备方法制备得到的精多糖在制备骨质疏松症和/或风湿病及其相关疾病治疗的药品、保健品或功能食品中的应用，以解决上述缺陷。
本发明提供的仙茅精多糖COP-1由甘露糖和葡萄糖组成，本发明提供的仙茅精多糖COP-2由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，本发明提供的仙茅精多糖COP-3由甘露糖和葡萄糖组成。
本发明提供的仙茅精多糖COP-1的结构为：
Figure BDA0001528513330000011
其中m+n＝10。
本发明提供的仙茅精多糖COP-2的其结构为：
Figure BDA0001528513330000021
其中n(v+w+x+y+z+m+19)＝314。
本发明提供的仙茅精多糖COP-3的其结构为：
其中n+1.3m＝22。
本发明提供的仙茅精多糖COP-3的结构还可能为：
其中n+1.3m＝22。
同时，本发明还提供了一种仙茅多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、切段：将干燥的仙茅药材洗净，切成3～5mm的小段，得切段仙茅；
S2、浸泡：将S1所得切段仙茅放入容器中，加入水没过切段仙茅浸泡过夜，过滤，得仙茅原料；
S3、水提：将S2所得仙茅原料用热水进行提取，过滤，收集粗水提液，晾干药渣，其中提取时的加水量为药材质量的5～15倍，热水的温度为50～100℃，提取次数为1～5次；
S4、分级醇沉：将S3所得粗水提液进行减压浓缩、真空抽滤，得精水提液，向精水提液中加入乙醇至乙醇体积百分数为a％，静置后得沉淀Co1，将静置后的上清液进行减压浓缩，加入乙醇至乙醇体积百分数为b％，静置后得沉淀Co2，再将静置后的上清液进行减压浓缩，再次加入乙醇至乙醇浓度为c％，静置后得沉淀Co3，所述a、b、c的取值范围为10<a<60，60<b<80，80<c<100；
S5、碱提醇沉：将S3所得药渣用0.1～1mol/L的NaOH溶液进行提取，所加NaOH溶液的体积为药材体积的8～12倍，得碱提液，将碱提液用0.1～1mol/L的HCl溶液进行中和，然后依次进行抽滤和减压浓缩，最后加入乙醇至乙醇百分数为d％，所述d的取值范围为30<d<100，静置后得沉淀CoB；
S6、初步纯化：将S4、S5所得沉淀Co1、Co2、Co3和CoB分别进行复溶、脱蛋白、透析、冷冻干燥，即得仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3和COB；
S7、将S6所得仙茅粗多糖CO2依次经离子交换柱层析分离、水或NaCl溶液洗脱、利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线等步骤后根据洗脱曲线收集主峰，浓缩，透析，冷冻干燥，得初步纯化的仙茅粗多糖CO2；将初步纯化的仙茅粗多糖CO2用蒸馏水溶解，离心，将离心所得上清液用凝胶分子筛柱层析进一步纯化，用水进行洗脱，同样使用苯酚-硫酸法再次检测多糖含量并绘制洗脱曲线，然后根据洗脱曲线收集多糖洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得仙茅精多糖COP-1和COP-2；
将S6所得仙茅粗多糖CO3依次经离子交换柱层析分离、水或NaCl溶液洗脱、利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线等步骤后根据洗脱曲线收集主峰，浓缩，透析，冷冻干燥，得初步纯化的仙茅粗多糖CO3；将初步纯化的仙茅粗多糖CO3用蒸馏水溶解，离心，将离心所得上清液用凝胶分子筛柱层析进一步纯化，用水进行洗脱，同样使用苯酚-硫酸法再次检测多糖含量并绘制洗脱曲线，然后根据洗脱曲线收集多糖洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得仙茅精多糖COP-3。
优选地，所述步骤S4和步骤S5中所述醇沉时静置时间为12～36h。
优选地，所述步骤S6脱蛋白的方法为Sevag法。
优选地，所述步骤S7所用离子交换柱为DEAE离子交换柱，分子筛凝胶层析柱为葡聚糖凝胶柱，NaCl溶液的浓度范围为0.05mol/L-0.15mol/L。
进一步地，仙茅多糖的口服给药量为300～500mg/kg/d。
本发明提供的仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3和COB经试验证实具有防治骨质疏松症的作用，为仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3和COB的应用提供了试验依据。
进一步地，本发明将效果最为显著的仙茅粗多糖CO2、CO3进一步纯化进行精提取，得到仙茅精多糖COP-1、COP-2、COP-3，本发明通过对仙茅精多糖COP-1、COP-2、COP-3进行单糖组成分析、红外光谱检测、甲基化分析、核磁共振分析，明确了仙茅精多糖COP-1、COP-2、COP-3的结构，为仙茅精多糖COP-1、COP-2、COP-3的应用提供了理论依据。本发明经试验证实了仙茅精多糖COP-2、COP-3对骨形成具有促进作用，为仙茅精多糖COP-2、COP-3的应用提供了试验依据。
本发明人为了开发仙茅多糖这一宝贵资源，首先用雌性SD大鼠为实验对象，对其进行了实验设计。由于雌性SD大鼠在卵巢切除后，体内雌激素水平降低、骨代谢活跃、骨转换增强、骨吸收大于骨形成，骨密度降低、骨矿物量丢失，与妇女绝经或卵巢切除后由于性腺功能衰退，雌激素缺乏，可致使骨代谢呈负平衡，伴随骨吸收加快，骨形成代偿性加快，而出现高转换型骨质疏松病理机制相同，所以可作为比较理想的骨质疏松研究模型。
雌性SD大鼠的研究表明，本发明中仙茅多糖制备方法制备得到的仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB均能显著增加去卵巢大鼠股骨和腰椎骨的骨密度以及骨矿物量，调节血清和尿液中各骨代谢生化指标趋于正常，明显改善股骨和腰椎骨的生物力学性能以及微观结构，增加骨小梁数量和厚度，降低骨小梁分离度，改善结构模型指数，发挥其防治骨质疏松症的作用。
其次，本发明对仙茅精多糖COP-2和COP-3的体外促进骨形成活性进行研究，结果表明仙茅精多糖COP-2能够显著提高MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨细胞)成骨细胞的ALP(碱性磷酸酶)活性，促进成骨细胞分化、矿化；仙茅精多糖COP-3能够显著促进小鼠原代成骨细胞的增殖和分化，说明仙茅精多糖COP-2和COP-3可以通过促进成骨细胞增殖、分化和矿化发挥其促进骨形成的作用。
与现有技术相比，本发明提供的仙茅多糖具有以下优势：
1、本发明通过对现有仙茅多糖的提取工艺进行调整和优化，采用水提和碱提相结合的方法，分别提取了水溶性多糖和碱溶性多糖，其中水溶性多糖还采取了分级醇沉的方法，得到3种不同分子量分布的仙茅粗多糖，不仅大大的提高了仙茅多糖的提取率，还增加了仙茅多糖提取物的种类。
2、本发明通过柱层析法筛选出的含量高、活性强的仙茅粗多糖，并对筛选出的仙茅粗多糖进行分离纯化，首次制备出三种仙茅精多糖COP-1、仙茅精多糖COP-2、仙茅精多糖COP-3，并对制备出的三种仙茅精多糖的结构进行了鉴定，明确了它们的理化性质及结构，为探究其药理活性及作用机制提供重要的结构信息。
3、本发明仙茅多糖的制备方法具有制备工艺简单，可大规模生产的优点。
4、本发明制备得到的仙茅多糖具有预防和治疗骨质疏松和/或风湿病的作用。
5、本发明制备得到的仙茅多糖可应用于骨质疏松症和/或风湿病及其相关疾病治疗的药品、保健品或功能食品中。
附图说明
图1为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠体重的影响。
图2为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠子宫系数的影响。
图3为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠脏器系数的影响。
图4为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响。
图5为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠股骨骨矿物量的影响。
图6为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠腰椎骨骨密度的影响。
图7为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠腰椎骨骨矿物量的影响。
图8为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠股骨骨微结构的影响。
图9为仙茅粗多糖对去卵巢大鼠腰椎骨骨微结构的影响。
图10为仙茅精多糖COP-1的红外光谱。
图11为仙茅精多糖COP-1的1H NMR图谱。
图12为仙茅精多糖COP-1的13CNMR图谱。
图13为仙茅精多糖COP-1的HSQC图谱。
图14为仙茅精多糖COP-1的HMBC图谱。
图15为仙茅精多糖COP-2的1H NMR图谱。
图16为仙茅精多糖COP-2的13CNMR图谱。
图17为仙茅精多糖COP-2的HSQC图谱。
图18为仙茅精多糖COP-2的HMBC图谱。
图19为仙茅精多糖COP-3的1H NMR图谱。
图20为仙茅精多糖COP-3的13CNMR图谱。
图21为仙茅精多糖COP-3的HSQC图谱。
图22为仙茅精多糖COP-3的HMBC图谱。
图23为仙茅精多糖COP-2对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响。
图24为仙茅精多糖COP-2对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响。
图25为仙茅精多糖COP-3对小鼠原代成骨细胞增殖和分化的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述结合说明书附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、仙茅粗多糖的制备方法
S1、切段：将干燥的仙茅药材洗净，切成3～5mm的小段，得切段仙茅；
S2、浸泡：将S1所得切段仙茅放入容器中，加入切段仙茅10倍体积量的水没过切段仙茅浸泡过夜，过滤，得仙茅原料；
S3、水提：将S2所得仙茅原料用仙茅原料5倍体积且温度为90℃的热水进行提取，过滤，重复提取3次，收集粗水提液，晾干药渣；
S4、分级醇沉：将S3所得粗水提液进行减压浓缩、真空抽滤，得精水提液，向精水提液中加入乙醇至乙醇体积百分数为50％，静置后得沉淀Co1，将静置后的上清液进行减压浓缩，再加入乙醇至乙醇体积百分数为70％，静置后得沉淀Co2，再将静置后的上清液进行减压浓缩，再次加入乙醇至乙醇体积百分数为90％，静置后得沉淀Co3；
S5、碱提醇沉：将S3所得药渣用0.5mol/L的NaOH溶液进行提取，所加NaOH溶液的体积为药材体积的10倍，得碱提液，将碱提液用0.5mol/L的HCl溶液进行中和，然后依次进行抽滤和减压浓缩，最后加入乙醇至乙醇体积百分数为50％，静置后得沉淀CoB；
S6、初步纯化：将S4和S5所得沉淀Co1、Co2、Co3和CoB分别进行复溶、脱蛋白、透析(截留量为1000Da)、冷冻干燥，即得仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3和COB。
试验例一、仙茅粗多糖的抗骨质疏松和/或风湿病作用研究
(一)试验材料：蒸馏水，雌二醇，本发明实施例1制备得到的仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB的溶液。
(二)试验对象：未交配雌性SD大鼠的尿液、血清、脏器、股骨和椎骨。
(三)实验分组与设计：
选取84只SPF级的3月龄未交配雌性SD大鼠，体重为265±15g，随机分为7组：假手术组(Sham)；模型组(OVX)；阳性对照组(E2)；CO1溶液给药组(CO1)；CO2溶液给药组(CO2)；CO3溶液给药组(CO3)；COB溶液给药组(COB)。每组12只，7组SD大鼠的初始体重无统计学差异。
适应性饲养一周后进行去卵巢手术造模，造模两天后按表1剂量进行灌胃给药，给药频率为一天一次，连续给药88天，给药期间每7天进行一次体重称量和记录。给药方案如表1所示。
表1给药方案
Figure BDA0001528513330000051
Figure BDA0001528513330000061
连续给药达到88天后，对SD大鼠进行尿液、血清、脏器、股骨和椎骨取材。然后探究仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB对去卵巢SD大鼠体重、子宫及其它脏器系数、股骨和腰椎骨骨密度、骨矿物量、股骨和腰椎骨骨生物力学、尿液与血清中相关骨代谢生化指标、股骨和腰椎骨松质骨骨微结构等的影响。
(四)试验方法：
1、去卵巢手术造模方法：
在所有SD大鼠的腹腔注射含4％的戊巴比妥钠溶液(剂量为45mg/kg)进行麻醉和腹位固定。先任取一侧摘除卵巢，缝合手术切口后用同样的方法再摘除另一侧卵巢。其中假手术组(Sham)找到卵巢后不进行卵巢切除，只是切除卵巢周围的脂肪团。手术后将SD大鼠放回清洁干燥的鼠笼，并进行观察，以及时处理突发情况。
2、尿液、血清取材及处理方法：
处死前将SD大鼠放入代谢笼中，禁食不禁水，24h后收集尿液。将所得尿液在转速为3000rmp条件下离心5min，-80℃保存待测。将SD大鼠称重麻醉后进行腹主动脉采血，用普通采血管和肝素钠抗凝采血管收集，普通管的血样在转速为3000rmp条件下离心5min，将血清和血浆分离，同样在-80℃的条件下保存待测。
尿液和血清的相关生化指标用Elisa(酶联免疫吸附剂测定)试剂盒进行检测，尿液检测的指标有肌酐Cr、羟脯氨酸Hyp、脱氧吡啶啉DPD，血清检测的指标有I型胶原C端肽CTX-I、I型前胶原羧基端原肽PINP、骨钙素OC、特异性碱性磷酸酶BAP、抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP。
3、脏器取材及处理方法：
采血结束后将SD大鼠的肝、心、肾、脾、大脑、肺取出，称重记录后将左肾、左大脑及其它脏器的其中一半放入质量分数为4％的多聚甲醛溶液的尿杯中，固定24h后将多聚甲醛溶液换为体积分数为70％的乙醇溶液，于-20℃保存。右肾、右大脑及另一半脏器用浸有生理盐水的纱布包裹好后放入密封袋，于-20℃保存。
4、股骨和椎骨取材及处理方法：
将SD大鼠的左右腿骨及第3、4、5腰椎取下后，先将骨头上的肉剔除干净，右股骨、右胫骨和第5腰椎于含有多聚甲醛溶液的尿杯中固定24h后更换为体积分数为70％的乙醇溶液浸泡，并于-20℃保存，左股骨、左胫骨和第3、4腰椎用生理盐水浸湿的纱布包裹后再用锡箔纸包裹，放入密封袋于-80℃保存待测。
骨密度检测：检测前先将-80℃保存的左股骨和第3、4腰椎骨于-20℃、4℃、室温逐步解冻，并用生理盐水复湿。采用双能X线骨密度仪(Hologic Discovery WI 85003DXA)，分别检测第四腰椎(L4)的骨密度(bone mineral density，BMD)和骨矿物含量(bone mineralcontent，BMC)，左股骨的全骨骨密度、前端股骨骨密度(1cm)、末端股骨骨密度(2cm)和骨矿物含量。
骨生物力学检测：采用Mini858Bionix材料测试系统分析左股骨(三点弯曲实验)和第3腰椎(压缩实验)的生物力学性能。测试时MTS试验机压头的直径为1mm，加载速度为0.01mm/s，跨距(L)为15mm，传感器为500N。系统自动记录每个时刻点载荷和桡度的变化值，处理时通过绘制载荷-桡度曲线即可获得相应参数。
Micro-CT扫描及三维重建：将在三点弯曲实验中已折断的左股骨远心端(完整)标本和第四腰椎骨标本分别沿长轴垂直固定于样品固定器内，Viva CT 40选择扫描参数进行扫描。扫描完成后，股骨选取距生长板远端1.0mm、层厚3.0mm的骨组织，椎骨选取距上下生长板0.5mm中间的骨组织为松质骨感兴趣区域(ROI)进行三维重建，以最低阈值为190提取图像信息，获得重建图像，利用Micro-CT自带的软件进行定量分析，得到骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、结构模型指数(SMI)、骨小梁连接性密度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)等参数。
(五)实验结果
1、仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠体重的影响
仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠体重的影响见图1，图中的#号表示：与假手术组相比，#P<0.05，##P<0.01；图中的*号表示：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01(下同)。造模结束后开始给药的第一周至第三周，模型组(OVX)SD大鼠的体重增长趋势大于假手术组(Sham)，且从第五周开始模型组(OVX)的体重均显著性大于假手术组(P<0.05)，而各仙茅粗多糖给药组和阳性药组的SD大鼠给药三周后体重均显著性或极显著性小于模型组(P<0.05或P<0.01)，表明仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB和阳性药均能有效抑制SD大鼠切除卵巢后由于雌激素分泌紊乱导致的体重过快增长。
2、仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠的子宫及其它脏器系数的影响
仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠子宫系数的影响见图2，模型组与假手术组相比，切除卵巢后SD大鼠子宫明显发生萎缩，其子宫系数与假手术组有极显著性差异(P<0.01)，与模型组相比，阳性药雌二醇有效缓解了SD大鼠去除卵巢后的子宫萎缩，其子宫系数与模型组有极显著性差异(P<0.01)，仙茅粗多糖CO2和CO3给药组也能明显改善去卵巢SD大鼠的子宫萎缩情况。
仙茅粗多糖对其它脏器系数的影响见图3，与假手术组相比，卵巢切除后，模型组SD大鼠的心脏、肝、脾、肺、肾和大脑均受到了不同程度的影响，其脏器系数均显著性小于假手术组(P<0.01)，而阳性药和仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB能在一定程度上有效缓解卵巢摘除对SD大鼠脏器系数的影响，这一结果同时说明仙茅粗多糖在长期给药的情况下并未对SD大鼠产生毒副作用。
3、仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠的股骨和腰椎骨骨密度、骨矿物量的影响
仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠的股骨骨密度(BMD)和骨矿物量(BMC)的影响如图4和图5所示，仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠腰椎骨骨密度和骨矿物量的影响如图6和图7所示。模型组的股骨和腰椎骨骨密度、骨矿物量与假手术组相比均极显著性降低(P<0.01)，表明SD大鼠摘除卵巢后出现了骨密度、骨量降低等骨质疏松症状，说明本实验中雌性SD大鼠去卵巢骨质疏松模型造模成功。与模型组相比，仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB均能极显著性增加去卵巢SD大鼠股骨的骨密度和骨矿物量(P<0.01)，且各仙茅粗多糖给药组SD大鼠的腰椎骨骨密度也显著性或极显著性增加(P<0.05或P<0.01)，仙茅粗多糖CO2和CO3对腰椎骨的骨矿物量也有改善作用，以上结果表明仙茅粗多糖具有防治去卵巢SD大鼠骨质疏松症的作用。
4、仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠的股骨和腰椎骨骨生物力学的影响
骨生物力学主要反映骨的结构力学和材料力学特性，仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠的股骨和腰椎骨骨生物力学的影响见表2和表3。SD大鼠进行去卵巢手术后，模型组与假手术组相比，股骨和腰椎骨的生物力学相关参数均出现明显的减小，这一结果表明去卵巢后SD大鼠股骨和腰椎骨生物力学性能下降，骨脆性增加，骨强度和韧性都明显降低，增加了骨折的风险，产生了骨质疏松症状。而与模型组相比，仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB和阳性药雌二醇均能在一定程度上有效改善去卵巢SD大鼠股骨的生物力学性能，增加骨强度和骨韧性，降低骨折风险，各组的股骨韧度均恢复到了正常范围。值得注意的是，仙茅粗多糖CO2和CO3对腰椎骨的生物力学特性具有显著的改善作用。这一结果说明从改善骨生物力学性能的角度评价，四种仙茅粗多糖均具有防治骨质疏松症的作用，其中仙茅粗多糖CO2和CO3的活性更好，且与阳性药的效果相当。
表2仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠股骨生物力学的影响
Figure BDA0001528513330000071
Figure BDA0001528513330000081
图中的#号表示：与假手术组相比，#P<0.05，##P<0.01；图中的*号表示：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠腰椎骨生物力学的影响
参数 Sham OVX E2 CO1 CO2 CO3 COB
弹性挠度/mm 0.33±0.07 0.25±0.07<sup>#</sup> 0.34±0.09<sup>*</sup> 0.32±0.14 0.35±0.09<sup>*</sup> 0.35±0.10<sup>*</sup> 0.32±0.10
弹性载荷/N 178.40±35.17 140.25±27.03<sup>#</sup> 165.59±35.86 142.35±36.23 158.98±288.59 159.31±33.50 162.58±50.48
最大扰度/mm 0.80±0.13 0.62±0.15<sup>#</sup> 0.78±0.12<sup>*</sup> 0.84±0.26<sup>*</sup> 0.80±0.13<sup>*</sup> 0.83±0.13<sup>**</sup> 0.64±0.08
最大载荷/N 289.38±49.05 231.96±30.44<sup>##</sup> 245.21±37.35 238.03±37.32 268.89±21.62<sup>*</sup> 277.34±53.42<sup>*</sup> 247.46±33.20
刚度/N.mm<sup>-1</sup> 635.24±173.95 484.40±188.41<sup>#</sup> 502.34±146.33 472.29±46.54 469.34±62.63 521.38±143.94 521.46±106.52
韧性系数 0.005±0.002 0.004±0.001 0.005±0.001 0.005±0.001 0.005±0.002 0.005±0.001 0.004±0.000
弯曲能量/N.mm 35.97±9.75 25.80±6.91<sup>#</sup> 32.75±23.28 32.73±13.66 27.52±8.54 29.96±8.49 25.12±17.93
图中的#号表示：与假手术组相比，#P<0.05，##P<0.01；图中的*号表示：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
5、仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠尿液与血清中相关骨代谢生化指标的影响
本实验中SD大鼠的尿液与血清中用Elisa(酶联免疫吸附剂测定)检测的与骨代谢有关的生化指标结果见表4。由表4可知，模型组与假手术组SD大鼠的尿液和血清中骨代谢相关指标均存在极显著性差异(P<0.01)。脱氧吡啶啉(DPD)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和羟脯氨酸(Hyp)是骨吸收标志物，模型组SD大鼠的这三个指标均显著高于假手术组，这一结果表明模型组SD大鼠体内的骨吸收明显增加。而I型胶原C端肽(CTX-I)、I型前胶原氨基端原肽(PINP)和骨特异性碱性磷酸酶(BAP)的检测结果显示模型组SD大鼠的骨形成与假手术组相比也明显增加(P<0.01)，此外血清中骨钙素(OC)的浓度显示模型组SD大鼠体内的骨转换程度极显著性高于假手术组(P<0.01)。尿液中的Cr浓度用于衡量SD大鼠体内的骨量丢失，模型组的Cr浓度极显著性高于假手术组(P<0.01)，说明去卵巢SD大鼠体内的骨量丢失严重。
上述指标的检测结果表明本研究中所用SD大鼠去卵巢骨质疏松模型属于高转换型骨质疏松模型，SD大鼠体内的骨吸收和骨形成都增加，骨代谢失衡，导致骨量降低，形成骨质疏松。阳性药组和仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3、COB给药组与模型组相比，尿液和血清中的骨代谢生化指标浓度均有不同程度的降低，表明四种仙茅粗多糖均能有效抑制去卵巢SD大鼠体内的骨吸收和骨形成，降低骨转换程度，减少骨量流失，调节骨代谢趋于平衡，从而发挥防治骨质疏松的作用，其中仙茅粗多糖CO1在调节骨代谢方面表现出最显著的活性，仙茅粗多糖CO2对骨钙素(OC)浓度的改善作用比雌二醇显著。
表4仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠血清和尿液中生化指标的影响
Figure BDA0001528513330000082
参数 Sham OVX E2 CO1 CO2 CO3 COB
DPD/nmol.L<sup>-1</sup> 473.64±57.66 1296.34±53.46<sup>##</sup> 636.23±79.50<sup>**</sup> 495.51±46.80<sup>**</sup> 549.48±96.56<sup>**</sup> 844.20±159.24<sup>**</sup> 835.86±98.70<sup>**</sup>
TRAP/pg.mL<sup>-1</sup> 1416.32±182.56 1975.90±300.22<sup>##</sup> 1553.64±321.57<sup>*</sup> 1490.89±223.95<sup>**</sup> 1569.94±316.30<sup>*</sup> 1489.54±317.44<sup>*</sup> 1974.34±374.56
Hyp/μg.L<sup>-1</sup> 736.25±152.14 987.09±56.93<sup>##</sup> 867.32±148.22 849.68±155.00<sup>*</sup> 883.93±93.53<sup>*</sup> 978.01±169.01 848.47±85.16<sup>**</sup>
CTX-I/nmol.L<sup>-1</sup> 38.91±5.51 62.87±5.79<sup>##</sup> 32.38±3.30<sup>**</sup> 57.04±4.93<sup>*</sup> 43.01±5.39<sup>**</sup> 43.93±5.97<sup>**</sup> 45.16±16.92<sup>*</sup>
PINP/μg.L<sup>-1</sup> 9.79±0.96 12.09±1.41<sup>##</sup> 10.48±0.89<sup>*</sup> 9.84±1.00<sup>**</sup> 10.39±0.88<sup>*</sup> 11.50±0.97 10.42±2.11
BAP/μg.L<sup>-1</sup> 10.12±1.78 14.83±1.10<sup>##</sup> 9.79±1.49<sup>**</sup> 11.97±1.52 10.71±2.69<sup>**</sup> 9.95±1.50<sup>**</sup> 10.04±1.44<sup>**</sup>
OC/ng.L<sup>-1</sup> 608.73±73.95 934.00±158.37<sup>##</sup> 789.23±59.99 697.44±111.11<sup>*</sup> 674.68±103.98<sup>**Δ</sup> 764.99±152.82 862.78±126.13
Cr/μmol.L<sup>-1</sup> 35.27±6.22 47.66±8.85<sup>##</sup> 40.51±6.01 37.95±6.35<sup>*</sup> 41.82±5.09 42.11±5.00 48.72±3.91
图中的#号表示：与假手术组相比，#P<0.05，##P<0.01；图中的*号表示：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；图中的Δ号表示：与阳性对照组相比，ΔP<0.05。
6、仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠的股骨和腰椎骨松质骨骨微结构的影响
Micro-CT对股骨和腰椎骨扫描重建的相关定量参数结果如表5和表6所示，相对于假手术组，模型组SD大鼠的结构模型指数SMI、骨表面积与骨体积比(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp)明显提高(P<0.01)，骨连接密度(Conn-Dens)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)均明显下降(P<0.01)，表明SD大鼠切除卵巢后股骨和椎骨的松质骨骨微结构受到损坏，出现骨质疏松症的病理特征，这一检测结果同样也表明本研究中的SD大鼠骨质疏松模型造模成功。各仙茅粗多糖均能够显著增加股骨的骨小梁的数量和骨小梁的厚度，降低骨小梁的分离度，通过有效改善去卵巢SD大鼠股骨和腰椎松质骨骨微结构，表现出良好的防治骨质疏松的作用，且效果与阳性药雌二醇相当，同时仙茅粗多糖CO2和CO3也能显著改善腰椎骨的骨微结构，且效果优于阳性药。
图8和图9可直观地看出各组SD大鼠三维重建后的骨小梁微结构的差异，模型组与假手术组相比骨小梁的结构由于卵巢遭到破坏，变得稀疏。各给药组SD大鼠骨小梁结构明显比模型组完好，表明阳性药和仙茅粗多糖均能改善骨质疏松导致的SD大鼠骨小梁微结构的破坏，其中仙茅粗多糖CO2和CO3的效果比仙茅粗多糖CO1和COB显著。SD大鼠股骨和腰椎骨的Micro-CT扫描重建结果也有力地证明了仙茅粗多糖具有防治骨质疏松症的作用。
表5仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠股骨骨微结构的影响
Figure BDA0001528513330000091
参数 Sham OVX E2 CO1 CO2 CO3 COB
Conn-Dens./mm<sup>-3</sup> 89.50±7.10 45.36±4.69<sup>##</sup> 51.45±3.52<sup>**</sup> 48.75±6.58 51.12±5.69<sup>*</sup> 54.42±9.42<sup>*</sup> 45.83±6.29
SMI -0.27±0.40 1.92±0.23<sup>##</sup> 1.56±0.22<sup>**</sup> 1.20±0.24<sup>**Δ</sup> 1.55±0.21<sup>**</sup> 1.23±0.31<sup>**Δ</sup> 1.40±0.23<sup>**</sup>
BV/TV 0.50±0.07 0.15±0.01<sup>##</sup> 0.21±0.03<sup>**</sup> 0.20±0.04<sup>*</sup> 0.20±0.02<sup>**</sup> 0.22±0.03<sup>**</sup> 0.19±0.03<sup>*</sup>
BS/BV/mm<sup>-1</sup> 19.99±2.18 29.54±2.15<sup>##</sup> 26.19±2.09<sup>**</sup> 24.83±2.93<sup>**</sup> 27.61±1.97 26.44±2.91<sup>**</sup> 26.08±1.99<sup>**</sup>
Tb.N/mm<sup>-1</sup> 4.56±0.15 2.27±0.27<sup>##</sup> 2.79±0.16<sup>**</sup> 2.66±0.33<sup>*</sup> 2.62±0.27<sup>*</sup> 2.69±0.22<sup>**</sup> 2.55±0.29
Tb.Th/mm 0.099±0.009 0.068±0.003<sup>##</sup> 0.075±0.004<sup>**</sup> 0.078±0.011<sup>*</sup> 0.074±0.006<sup>*</sup> 0.077±0.007<sup>**</sup> 0.075±0.007<sup>*</sup>
Tb.Sp/mm 0.11±0.01 0.34±0.04<sup>##</sup> 0.28±0.02<sup>**</sup> 0.28±0.05<sup>*</sup> 0.29±0.03<sup>*</sup> 0.26±0.03<sup>**</sup> 0.32±0.05
图中的#号表示：与假手术组相比，#P<0.05，##P<0.01；图中的*号表示：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；图中的Δ号表示：与阳性对照组相比，ΔP<0.05。
表6仙茅粗多糖对去卵巢SD大鼠腰椎骨骨微结构的影响
Figure BDA0001528513330000092
参数 Sham OVX E2 CO1 CO2 CO3 COB
Conn-Dens./mm<sup>-3</sup> 60.14±8.70 47.63±4.97<sup>#</sup> 55.16±2.74<sup>*</sup> 48.25±7.56 58.80±4.96<sup>**</sup> 48.66±7.11 49.38±2.38
SMI -1.809±0.516 0.477±0.149<sup>##</sup> 0.067±0.173<sup>**</sup> 0.053±0.447<sup>*</sup> -0.013±0.103<sup>**</sup> 0.052±0.288<sup>**</sup> 0.447±0.558
BV/TV 0.50±0.05 0.30±0.03<sup>##</sup> 0.31±0.04 0.33±0.04<sup>*</sup> 0.35±0.03<sup>**Δ</sup> 0.32±0.03<sup>*</sup> 0.26±0.07
BS/BV/mm<sup>-1</sup> 16.12±1.25 23.78±1.47<sup>##</sup> 23.99±1.97 21.98±1.55<sup>*</sup> 21.31±1.20<sup>**</sup> 21.43±1.12<sup>**</sup> 25.65±2.94
Tb.N/mm<sup>-1</sup> 4.14±0.28 3.56±0.12<sup>##</sup> 3.67±0.31 3.66±0.19 3.92±0.26<sup>**</sup> 3.79±0.09<sup>**</sup> 3.37±0.32
Tb.Th/mm 0.109±0.010 0.085±0.007<sup>##</sup> 0.086±0.005 0.090±0.007 0.093±0.006<sup>**</sup> 0.093±0.005<sup>*</sup> 0.078±0.010
Tb.Sp/mm 0.12±0.01 0.20±0.02<sup>##</sup> 0.18±0.01<sup>*</sup> 0.18±0.02<sup>*</sup> 0.17±0.02<sup>**</sup> 0.18±0.01<sup>**</sup> 0.23±0.04
图中的#号表示：与假手术组相比，#P<0.05，##P<0.01；图中的*号表示：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；图中的Δ号表示：与阳性对照组相比，ΔP<0.05。
由试验例一可知，仙茅粗多糖CO2和CO3的效果比仙茅粗多糖CO1和COB的效果更为显著。本发明对实施例1制备得到的仙茅粗多糖CO2和CO3进行了进一步的纯化和精提取。
实施例2、仙茅精多糖COP-1及其制备方法
仙茅精多糖COP-1，经过单糖组成分析、完全甲基化联合GC-MS分析、红外光谱分析和核磁分析，得出仙茅精多糖COP-1由甘露糖和葡萄糖组成，结构为：
Figure BDA0001528513330000101
其中m+n＝10。
所述仙茅精多糖COP-1的制备方法为：
S1、切段：将干燥的仙茅药材洗净，切成3～5mm的小段，得切段仙茅；
S2、浸泡：将S1所得切段仙茅药材放入容器中，加入切段仙茅10倍体积量的水没过切段仙茅浸泡过夜，过滤，得仙茅原料；
S3、水提：将S2所得仙茅原料用仙茅原料5倍体积且温度为90℃的热水进行提取，过滤，重复提取3次，收集粗水提液，晾干药渣；
S4、分级醇沉：将S3所得粗水提液进行减压浓缩，真空抽滤，得精水提液，向精水提液中加入乙醇至乙醇体积百分数为50％，静置24h后得沉淀Co1，将静置后的上清液进行减压浓缩，再加入乙醇至乙醇体积百分数为70％，静置24h后得沉淀Co2；
S5、初步纯化：将S4所得沉淀Co2复溶后用Sevag法进行脱蛋白，透析(截留量为1000Da)，冷冻干燥，即得仙茅粗多糖CO2样品；
S6、离子交换柱层析：取S5所得仙茅粗多糖CO2样品200mg，溶于10mL的水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用水进行洗脱，洗脱过程中利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集洗脱液，将所得洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到初步纯化的峰一CO2仙茅粗多糖；
S7、分子筛凝胶柱层析：将S6所得初步纯化的峰一CO2仙茅粗多糖，用水溶解、离心，取上清液，上样于Sephadex G-75柱，用水进行洗脱，洗脱过程中利用苯酚-硫酸法显色检测多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集洗脱液，将所得洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，即得。
实施例3、仙茅精多糖COP-2及其制备方法
仙茅精多糖COP-2，经过单糖组成分析、完全甲基化联合GC-MS分析、红外光谱分析和核磁分析，得出仙茅精多糖COP-2由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，结构为：
其中n(v+w+x+y+z+m+19)＝314。
所述仙茅精多糖COP-2的制备方法为：
S1、切段：将干燥的仙茅药材洗净，切成3～5mm的小段，得切段仙茅；
S2、浸泡：将S1所得切段仙茅放入容器中，加入切段仙茅10倍体积量的水没过切段仙茅浸泡过夜，过滤，得仙茅原料；
S3、水提：将S2所得仙茅原料用仙茅原料5倍体积且温度为90℃的热水进行提取，过滤，重复提取3次，收集粗水提液，晾干药渣；
S4、分级醇沉：将S3所得粗水提液进行减压浓缩，真空抽滤，得精水提液，向精水提液中加入乙醇至乙醇体积百分数为50％，静置24h后得沉淀Co1，将静置后的上清液进行减压浓缩，再加入乙醇至乙醇体积百分数为70％，静置24h后得沉淀Co2；
S5、初步纯化：将S4所得沉淀Co2复溶后用Sevag法进行脱蛋白，透析(截留量为1000Da)，冷冻干燥，即得到仙茅粗多糖样品CO2；
S6、离子交换柱层析：取S5所得仙茅粗多糖CO2样品200mg，溶于10mL水中，上样于DEAE-Cellulose52柱，在不同盐浓度的洗脱条件下出现三个峰，其中峰一为水洗脱部分，峰二为0.05mol/L的NaCl洗脱部分，峰三为0.15mol/L的NaCl洗脱部分，洗脱过程中利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集洗脱液，分别将所得洗脱液进行减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到三种仙茅多糖：初步纯化的峰一CO2仙茅粗多糖、初步纯化的峰二CO2仙茅粗多糖、初步纯化的峰三CO2仙茅粗多糖。
S7、分子筛凝胶柱层析：将S6所得初步纯化的峰三CO2仙茅粗多糖，用水溶解、离心，取上清液，上样于Sephadex G-75柱，用水进行洗脱，洗脱过程中利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集洗脱液，将所得洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，即得。
实施例4、仙茅精多糖COP-3及其制备方法
仙茅精多糖COP-3，经单糖组成分析、完全甲基化联合GC-MS分析、红外光谱分析和核磁分析，得出仙茅精多糖COP-3由甘露糖和葡萄糖组成，结构为：
Figure BDA0001528513330000121
其中n+1.3m＝22。
仙茅精多糖COP-3的结构还可能为：
Figure BDA0001528513330000122
其中n+1.3m＝22。
所述仙茅精多糖COP-3的制备方法为：
S1、切段：将干燥的仙茅药材洗净，切成3～5mm的小段，得切段仙茅；
S2、浸泡：将S1所得切段仙茅放入容器中，加入切段仙茅10倍体积量的水浸泡过夜，过滤，得仙茅原料；
S3、水提：将S2所得仙茅原料用仙茅原料5倍体积且温度为90℃的热水进行提取，过滤，重复提取3次，收集粗水提液，晾干药渣；
S4、分级醇沉：将S3所得粗水提液进行减压浓缩，真空抽滤，得精水提液，向精水提液中加入乙醇至乙醇体积百分数为50％，静置24h后得沉淀Co1，将静置后的上清液进行减压浓缩，再加入乙醇至乙醇体积百分数为70％，静置24h后得沉淀Co2，再将静置后的上清液进行减压浓缩，再次加入乙醇至乙醇体积百分数为90％，静置24h后得沉淀Co3；
S5、初步纯化：将S4所得沉淀Co3复溶后用Sevag法进行脱蛋白，透析(截留量为1000Da)，冷冻干燥，即得到仙茅粗多糖样品CO3；
S6、离子交换柱层析：取S5所得仙茅粗多糖CO3样品200mg，溶于10mL水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用水进行洗脱，洗脱过程中利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集洗脱液，将所得洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，得初步纯化的峰三CO3仙茅粗多糖；
S7、分子筛凝胶柱层析：将S6所得初步纯化的峰三CO3仙茅粗多糖，用水溶解、离心，取上清液，上样于Sephadex G-75柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集洗脱液，将所得洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，即得。
试验例二、仙茅精多糖的结构分析
(一)试验材料：实施例2制备得到的仙茅精多糖COP-1、实施例3制备得到的仙茅精多糖COP-2、实施例4制备得到的仙茅精多糖COP-3.
(二)试验方法：对仙茅精多糖COP-1、COP-2、COP-3进行单糖组成分析、红外光谱检测、甲基化分析、核磁共振分析。
(三)实验结果：
(1)仙茅精多糖COP-1的单糖组成分析、红外光谱、甲基化分析、核磁共振分析。
1、仙茅精多糖COP-1组成分析：通过完全酸水解-柱前PMP(1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮)衍生化-HPLC(高效液相色谱)分析可知，COP-1的单糖组成为甘露糖和葡萄糖。
2、仙茅精多糖COP-1红外光谱分析：由仙茅精多糖COP-1的红外光谱(图10)可以看出，仙茅精多糖COP-1的特征吸收峰为：3408cm-1为多糖中O-H伸缩振动的特征吸收峰，2923cm-1为多糖中C-H伸缩振动的特征吸收峰，1733cm-1和1247cm-1为酯基或乙酰基的特征吸收峰，表明COP-1中可能含有酯基或乙酰基，1090cm-1、1059cm-1、1030cm-1三个吸收峰表明仙茅精多糖COP-1为吡喃糖苷，与仙茅精多糖COP-1单糖组成分析结果一致。
3、仙茅精多糖COP-1甲基化分析：对仙茅精多糖COP-1进行甲基化-水解-还原-乙酰化联合GC-MS分析，结果表明仙茅精多糖COP-1中可能含有→3,4)-D-Manp-(1→、→4)-D-Glcp-(1→、→3,6)-D-Manp-(1→和D-Glcp-(1→四种连接残基，其中→3,4)-D-Manp-(1→为最主要的成分。
4、仙茅精多糖COP-1核磁共振分析：所得结果如图11～14所示，根据图11～14的核磁图谱对各残基的各个碳和氢的化学位移值进行归属，归属结果如表7所示。
表7仙茅精多糖COP-1中各糖残基的化学位移值
各残基之间的相互连接关系根据HMBC谱中的相关信号进行推断，综合单糖组成、红外光谱、甲基化和GC-MS、核磁共振分析可知COP-1是一种含有O-乙酰基的葡甘露聚糖，其结构为：
Figure BDA0001528513330000141
其中m+n＝10。
(2)仙茅精多糖COP-2、COP-3的结构分析与仙茅精多糖COP-1的分析方法类似。通过对仙茅精多糖COP-2、COP-3进行单糖组成分析、红外光谱检测、甲基化分析、核磁共振分析，可得仙茅精多糖COP-2是由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成，仙茅精多糖COP-2的核磁共振检测结果如图15～18所示，其结构为：
Figure BDA0001528513330000151
其中n(v+w+x+y+z+m+19)＝314。
仙茅精多糖COP-3是一种含有O-乙酰基的葡甘露聚糖，核磁共振检测结果如图19～22所示，其结构为：
其中n+1.3m＝22。
其中仙茅精多糖COP-3的结构还可能为：
Figure BDA0001528513330000161
其中n+1.3m＝22。
试验例三、仙茅精多糖COP-2和COP-3促进骨形成活性的研究
(一)试验材料：实施例3制备得到的仙茅精多糖COP-2、实施例4制备得到的仙茅精多糖COP-3。
(二)试验对象：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1、昆明小鼠原代成骨细胞。
(三)实验方法：
1、仙茅精多糖COP-2对MC3T3-E1细胞成骨分化和矿化的影响
处于对数生长期的MC3T3-E1细胞经胰蛋白酶消化，计数后调整细胞密度为15×104cell/mL，将细胞液按175μL/well接种于24孔板内，即每孔约2.6×104个细胞，每孔用完全培养基补至500μL，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养72h。根据实验设计分别加入0.94、1.87、3.84nmol/L的仙茅精多糖COP-2，每个浓度设置四个复孔。同时设置只给予完全培养基的正常组(Normal)，只给予成骨诱导培养基的对照组(Control)和含0.1μmol/L雌二醇的阳性对照组(E2)。每三天换一次液。药物分别作用2天(2d)、4天(4d)、6天(6d)、8天(8d)、10天(10d)和12天(12d)后，每孔加入100μL RIPA裂解液，4℃裂解细胞20min，收集裂解液于4℃下12,400×g离心5min，收集蛋白上清液，参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作检测蛋白浓度，参照ALP(碱性磷酸酶)检测试剂盒说明书操作进行ALP活性检测。
将重悬的MC3T3-E1细胞液混合均匀，计数，用新鲜的完全培养基稀释细胞液浓度为15×104cell/mL。细胞液按350μL/well接种于12孔板内，即每孔约5.25×104个细胞，每孔用完全培养基补至体积为1mL，置于5％的CO2、37℃的培养箱中培养72h。然后更换成含有不同浓度仙茅精多糖COP-2多糖样品的成骨诱导培养基，每孔1mL。同时设置只给予完全培养基的正常组(Normal)，只给予成骨诱导培养基的对照组(Control)和含0.1μM雌二醇的阳性对照组(E2)。药物作用15天后(可视细胞出现钙结节的情况确定具体作用时间)，取出培养板，吸出培养液后用10％中性福尔马林室温固定30min，PBS清洗3次，加入0.1％茜素红避光染色30min，再用PBS清洗3-5次直至正常组洗液为无色。于显微镜下观察，拍照存档。然后吸净12孔板孔内的液体，每孔加入400μL 10％的十六烷基吡啶，在室温下避光作用30min。最后向96孔培养板中转移十六烷基吡啶溶液，每孔100μL。设置3个复孔，检测562nm处的光密度(OD)值，根据公式计算出仙茅精多糖COP-2的矿化率。
2、仙茅精多糖COP-3对昆明小鼠原代成骨细胞增殖和分化的影响
从2日龄的昆明小鼠头骨中取出原代成骨细胞，将昆明小鼠原代成骨细胞接种于含有链霉素、青霉素和10％胎牛血清的α-MEM培养基中，于5％CO2、37℃的培养箱中进行细胞培养，每周换液三次。通过CCK-8试剂盒检测脱氢酶活性来评价仙茅精多糖COP-3对原代成骨细胞增殖的影响，将细胞稀释至1×104cell/mL，在96孔培养板中进行传代培养，预培养24h后，分别加入阳性药(阿仑膦酸钠)和不同浓度的仙茅精多糖COP-3，培养48小时后每个孔中加入10μL CCK-8溶液，加入10μL CCK-8溶液培养1h后在450nm处测定吸光度值，然后计算出各组成骨细胞的增殖率。
ALP(碱性磷酸酶)活性可作为成骨细胞分化的评价指标，根据ALP活性检测试剂盒操作检测原代成骨细胞的ALP活性，然后计算出精多糖COP-3对原代成骨细胞的促分化率。
(四)实验结果
1、仙茅精多糖COP-2对MC3T3-E1细胞分化和矿化的影响
仙茅精多糖COP-2对MC3T3-E1细胞分化的影响见图23，在加药培养的第10天，1.87nM的仙茅精多糖COP-2能够显著性增加MC3T3-E1细胞的ALP活性(P<0.05)，表明COP-2对MC3T3-E1细胞的分化有促进作用。
仙茅精多糖COP-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响见图24，0.94和1.87nM两个浓度的仙茅精多糖COP-2均能够显著性提高MC3T3-E1细胞的矿化率(P<0.01)，且与阳性药组的作用效果相当，表明仙茅精多糖COP-2能够显著促进MC3T3-E1细胞的矿化。
2、仙茅精多糖COP-3对昆明小鼠原代成骨细胞增殖和分化的影响
仙茅精多糖COP-3对昆明小鼠原代成骨细胞增殖和分化的影响见图25，从图25的结果可知，各浓度的仙茅精多糖COP-3对昆明小鼠原代成骨细胞的增殖和分化均有一定的促进作用，其中当仙茅精多糖COP-3的浓度为10.8μM时，增殖率为3.51％，是各浓度中最高的，与阳性对照组4.05％增殖率相比，仙茅精多糖COP-3对促进昆明小鼠原代成骨细胞增殖具有一定作用；当浓度为21.7μM时，仙茅精多糖COP-3的促分化率达到了6.20％。这些结果表明仙茅精多糖COP-3具有显著地促进昆明小鼠原代成骨细胞增殖和分化的作用。
以上所述只是本发明的一些实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的普通技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、简化、改进等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种仙茅多糖，其特征在于，包括仙茅精多糖COP-1，所述仙茅精多糖COP-1的结构为：
Figure FDA0002277215920000011
其中m+n＝10。
2.一种仙茅多糖，其特征在于，包括仙茅精多糖COP-2，所述仙茅精多糖COP-2的结构为：
Figure FDA0002277215920000012
其中n(v+w+x+y+z+m+19)＝314。
3.一种仙茅多糖，其特征在于，包括仙茅精多糖COP-3，所述仙茅精多糖COP-3的结构为：
Figure FDA0002277215920000021
其中n+1.3m＝22，或
Figure FDA0002277215920000022
其中n+1.3m＝22。
4.一种仙茅多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、切段：将干燥的仙茅药材洗净，切成3～5mm的小段，得切段仙茅；
S2、浸泡：将S1所得切段仙茅放入容器中，加入水没过切段仙茅浸泡过夜，过滤，得仙茅原料；
S3、水提：将S2所得仙茅原料用热水进行提取，过滤，收集粗水提液，晾干药渣，其中提取时的加水量为药材质量的5～15倍，热水的温度为50～100℃，提取次数为1～5次；
S4、分级醇沉：将S3所得粗水提液进行减压浓缩、真空抽滤，得精水提液，向精水提液中加入乙醇至乙醇体积百分数为a％，静置后得沉淀Co1，将静置后的上清液进行减压浓缩，加入乙醇至乙醇体积百分数为b％，静置后得沉淀Co2，再将静置后的上清液进行减压浓缩，再次加入乙醇至乙醇体积百分数为c％，静置后得沉淀Co3，所述a、b、c的取值范围为10<a<60，60<b<80，80<c<100；
S5、碱提醇沉：将S3所得药渣用0.1～1mol/L的NaOH溶液进行提取，所加NaOH溶液的体积为药材体积的8～12倍，得碱提液，将碱提液用0.1～1mol/L的HCl溶液进行中和，然后依次进行抽滤和减压浓缩，最后加入乙醇至乙醇百分数为d％，所述d的取值范围为30<d<100，静置后得沉淀CoB；
S6、初步纯化：将S4、S5所得沉淀Co1、Co2、Co3和CoB分别进行复溶、脱蛋白、透析、冷冻干燥，即得仙茅粗多糖CO1、CO2、CO3和COB；
S7、将S6所得仙茅粗多糖CO2依次经离子交换柱层析分离、水或NaCl溶液洗脱、利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线等步骤后根据洗脱曲线收集主峰，浓缩，透析，冷冻干燥，得初步纯化的仙茅粗多糖CO2；将初步纯化的仙茅粗多糖CO2用蒸馏水溶解，离心，将离心所得上清液用凝胶分子筛柱层析进一步纯化，用水进行洗脱，同样使用苯酚-硫酸法再次检测多糖含量并绘制洗脱曲线，然后根据洗脱曲线收集多糖洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得仙茅精多糖COP-1和COP-2；
将S6所得仙茅粗多糖CO3依次经离子交换柱层析分离、水或NaCl溶液洗脱、利用苯酚-硫酸法检测多糖含量并绘制洗脱曲线等步骤后根据洗脱曲线收集主峰，浓缩，透析，冷冻干燥，得初步纯化的仙茅粗多糖CO3；将初步纯化的仙茅粗多糖CO3用蒸馏水溶解，离心，将离心所得上清液用凝胶分子筛柱层析进一步纯化，用水进行洗脱，同样使用苯酚-硫酸法再次检测多糖含量并绘制洗脱曲线，然后根据洗脱曲线收集多糖洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得仙茅精多糖COP-3。
5.如权利要求4所述的仙茅多糖的制备方法，其特征在于，步骤S4和步骤S5中所述醇沉静置时间为12～36h。
6.如权利要求4所述的仙茅多糖的制备方法，其特征在于，步骤S7所述离子交换柱为DEAE离子交换柱，分子筛凝胶层析柱为葡聚糖凝胶柱，所述NaCl溶液的浓度范围为0.05mol/L-0.15mol/L。
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