CN109385457A - 一种具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽的制备方法。其特点是方法包括如下步骤：以大鲵肌肉为原料，切块并使用清水高温高压蒸煮；冷却后加入复合蛋白酶酶解，得到大鲵多肽酶解液；煮沸灭酶后，通过过滤、离心、微滤、超滤浓缩后得到的小分子量多肽酶解液；加入多糖溶液并加热反应，得到大鲵美拉德肽溶液；通过超滤截留得到分子量大于5000相对分子量的美拉德肽，喷雾干燥或冷冻干燥即得到具有较高抗氧化活性的大鲵美拉德肽。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品加工技术领域，具体涉及一种以大鲵为料的具有抗氧化活性的美拉德肽的制备领域。
背景技术
大鲵是世界上现存最大也是最珍贵的两栖动物。其肌肉蛋白是一种优质蛋白，必需氨基酸含量高，组成比例好，完全符合人体需要量模式，其营养价值远优于鲍鱼、燕窝、鱼翅和甲鱼。大鲵肌肉蛋白富含18种氨基酸，其中6种呈味氨基酸占氨基酸总量的42.77％，8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的40.72％，必需氨基酸与非必需氨基酸比值为68.68％近年来，大鲵人工养殖日益成熟。随着大鲵产量的提高，国家已经批准人工饲养大鲵二代可以进入市场销售。但目前市场上大鲵的高附加值产品极少，这制约了大鲵产业的繁荣发展。
贵阳学院在专利CN103766961中公布一种即食大鲵肉干，通过预处理、加工、配料等工艺制成肉干，具有肉质鲜嫩，味道鲜美的特点。其还在在专利CN103734797中公布了一种大鲵肉松，将大鲵肉与山药粉，大豆粉 山药粉科学伍配，可直接食用，也可与米粉面条等搭配食用，且具有促进人体新陈代谢，改善睡眠等功效。
四川溪源水产养殖有限公司在专利CN201410404611中公布了一种大鲵多肽饮品及其制备方法，通过酶解大鲵肌肉和复配调味剂的基础上制得具有色泽呈均匀一致的金黄色或浅黄色，外观呈半透明均匀一致的饮品，口感和风味好，营养价值高，方便日常对大鲵的优质多肽进行补充。
但是上述发明均只是对大鲵的简单处理和搭配，忽略了大鲵自身功效的开发潜力。
因此，利用大鲵为原材料开发能广泛应用于食品、保健品领域的高附加值产品是当前的迫切需求。
发明内容
为解决现有技术的不足指出，本发明提供一种具有较好抗氧化效果的大鲵美拉德肽的制作方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽的制备方法包括如下步骤：
（1）原料预处理：以大鲵肌肉为原料，切块，加入清水后煮沸并冷却至酶解温度；
（2）酶解：加入复合蛋白酶，酶解后即得到大鲵肌肉酶解液；
（3）灭酶:将酶解液加热煮沸灭酶，并冷却；
（4）过滤：将灭酶后的酶解液依次进行过滤、离心、微滤、超滤得到无杂质的小分子大鲵酶解液；
（5）美拉德肽溶液的制备：将酶解液浓缩得浓缩液，加入多糖溶液并在加热条件下反应，得到美拉德肽溶液；
（6）超滤：将美拉德肽溶液经过超滤，得到大分子量的美拉德肽溶液；
（7）美拉德肽的制备：将美拉德肽溶液用冻干或者喷雾干燥的方式最终得到美拉德肽。
进一步的，步骤（1）中所述大鲵肌肉为去除皮和油脂的大鲵肌肉；所述清水质量为大鲵肌肉的3-6倍；煮沸时间为10-30min。
进一步的，步骤（2）中所述复合蛋白酶的添加量为大鲵肌肉质量的1-5%，其酶解条件为温度40-60℃，时间6-7h，酶解程度为酶解至水解度为20%-25%；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、菠萝酶、风味蛋白酶复配而成，按质量百分比计其复配比例为中性蛋白酶25%-35%，菠萝酶为5%-15%，余量为风味蛋白酶。
进一步的，步骤（3）中所述灭酶煮沸时间为5-15min。
进一步的，步骤（4）中所述离心条件为转速4000r/min，时间20min；所述微滤条件为微滤膜孔径0.5um；所述超滤条件为超滤膜孔径2000相对分子量。
进一步的，步骤（5）中所述浓缩方式为真空浓缩或加热蒸发浓缩，浓缩液质量分数为10-25%。
进一步的，步骤（5）中所述多糖溶液加入量为大鲵浓缩液质量的25%-100%，反应条件为时间2-5h，温度为100-121℃；所述多糖溶液为香菇多糖溶液。
进一步的，步骤（6）中所述超滤条件为超滤膜孔径5000相对分子量。
本发明具有以下优点：
本发明将大鲵多肽与天然提取物——香菇多糖高温高压反应，得到了具有独特风味的美拉德肽粉，实现了对大鲵的综合利用，且安全性更高。
本发明改变了当前大鲵产品附加值低的现状，较好地发掘了大鲵的保健功效。
本发明的工艺流程简单，操作性强，适合规模化生产。
本发明制备的产品通过与香菇多糖的美拉德反应较好地去除了两栖动物肉中附带的腥味。
本发明采用的复配酶配方，条件温和，在不引入杂质的同时，也具有较高的水解速度和抗氧化性效果。
本发明使用两步超滤的方法截取了2000相对分子量以下的多肽参与反应并截取5000相对分子量以上的美拉德肽制备最终产品，其抗氧化效果更佳。
本发明所述的具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽羟自由基清除率为85-91%；DPPH清除率为84-90%。
具体实施方式
实施例1
一种大鲵美拉德肽的制备方法
（1）原料预处理：将大鲵肌肉去除外部皮与脂肪组织，切成3cm左右小块，加入4倍清水后煮沸20min并冷却。
（2）酶解：冷却后加入相当于大鲵肌肉质量2%的复配蛋白酶，复配比例为中性蛋白酶：菠萝酶：风味蛋白酶=5：1：10，在55℃酶解6h得到大鲵肌肉酶解液，其水解度为24.8%。
（3）灭酶:将酶解液加热煮沸约15min灭酶，冷却至常温。
（4）过滤：将灭酶后的酶解液依次进行滤纸过滤、4000r/min离心20min、0.5um微孔滤膜微滤， 2000相对分子量孔径超滤膜超滤得到去除杂质后的小分子大鲵酶解液。
（5）美拉德肽溶液的制备：将酶解液真空浓缩得到质量分数为15%的浓缩液，加入等量15%香菇多糖溶液并100℃下反应3h，得到美拉德肽溶液。
（6）超滤：将得到的美拉德肽溶液通过5000da的超滤膜，得到分子量不超过5000da的美拉德肽溶液。
（7）美拉德肽的制备：将美拉德肽溶液放入冻干机，真空冻干50h，得到美拉德肽。
（8）美拉德肽羟自由基清除率检测: 用蒸馏水将美拉德反应前后的待测样品配制成质量浓度为0.5mg/mL的溶液，取1 mL样品溶液与 1 mL 硫酸亚铁溶液（FeSO4·7H2O，9mmol/L） 、1 mL 过 氧化氢溶液（10 mmol/L）混匀，37 ℃孵育 10 min， 加入1 mL水杨酸溶液 （9 mmol/L）， 混匀后37 ℃ 孵 育 30 min，于 510 nm 处测定反应溶液的吸光度， 纯水做空白对照。计算方法如式下：羟自由基清除率（%）=（1- 实验组吸光度/空白组吸光度 ）× 100%。最终得到产品羟自由基清除率为90.1%
（9）美拉德肽DPPH自由基清除能力的测定：用蒸馏水将美拉德反应前后的待测样品配制成质量浓度为0.5mg/mL的溶液，：以 95%的乙醇为溶剂配制 浓度为 0.1 mmol/L 的DPPH 自由基溶液，此溶液需 现配现用。取 2.0 mL 不同浓度的受试物溶液同 2.0 mLDPPH 溶液混合，25 ℃避光孵育 30 min，于 517 nm 处测定反应溶液的吸光度，95%乙醇做空白 对照[23]。计算方法如式（2） 。 DPPH 自由基清除率（%）=（1- 实验组吸光度 空白组吸光度 ）× 100%。最终得到产品DPPH清除率为89.1%。
具体实施方式2：
一种大鲵美拉德肽的制备方法
（1）原料预处理：将大鲵肌肉去除外部皮与脂肪组织，切成3cm左右小块，加入5倍清水后煮沸20min并冷却。
（2）酶解：冷却后加入相当于大鲵肌肉质量3%的复配蛋白酶，复配比例为中性蛋白酶：菠萝酶：风味蛋白酶=5：2：13，在55℃酶解6h得到大鲵肌肉酶解液，其水解度为24.1%。
（3）灭酶:将酶解液加热煮沸约10min灭酶，冷却至常温。
（4）过滤：将灭酶后的酶解液依次进行滤纸过滤、4000r/min离心20min、0.5um微孔滤膜微滤，2000相对分子量孔径超滤膜超滤得到去除杂质后的小分子大鲵酶解液。（5）美拉德肽溶液的制备：将酶解液真空浓缩得到质量分数为15%的浓缩液，加入等量15%香菇多糖溶液并于100℃下反应2h，得到美拉德肽溶液。
（6）超滤：将得到的美拉德肽溶液通过5000da的超滤膜，得到分子量不超过5000da的美拉德肽溶液。
（7）美拉德肽的制备：将美拉德肽溶液放入冻干机，真空冻干50h，得到美拉德肽。
（8）美拉德肽羟自由基清除率检测: 用蒸馏水将美拉德反应前后的待测样品配制成质量浓度为0.5mg/mL的溶液，取1 mL样品溶液与 1 mL 硫酸亚铁溶液（FeSO4·7H2O，9mmol/L） 、1 mL 过 氧化氢溶液（10 mmol/L）混匀，37 ℃ 孵育 10 min， 加入1 mL水杨酸溶液 （9 mmol/L）， 混匀后37 ℃ 孵 育 30 min，于 510 nm 处测定反应溶液的吸光度，纯水做空白对照。计算方法如式下：羟自由基清除率（%）=（1- 实验组吸光度/空白组吸光度）× 100%。最终得到产品羟自由基清除率为85.6%。
（9）美拉德肽DPPH自由基清除能力的测定：用蒸馏水将美拉德反应前后的待测样品配制成质量浓度为2mg/mL的溶液，：以 95%的乙醇为溶剂配制 浓度为 0.1 mmol/L 的DPPH 自由基溶液，此溶液需现配现用。取 2.0 mL 不同浓度的受试物溶液同 2.0 mL DPPH溶液混合，25 ℃避光孵育 30 min，于 517 nm 处测定反应溶液的吸光度，95%乙醇做空白对照。计算方法如式（2） 。DPPH 自由基清除率（%）=（1- 实验组吸光度/空白组吸光度 ）×100%。最终得到产品DPPH清除率为84.1%。
以上为本发明的一个具体事实例，但并只用以限定本发明，根据本发明内容所得到的变形均应认为是本发明的保护内容。
对比试验例1，将实施例1中酶解条件替换为2%的中性蛋白酶，其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。结果显示其达到所需水解度时间为8.5h，且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为75.1%和72.1%，均低于实施例。
对比试验例2，将实施例1中酶解条件替换为2%的风味蛋白酶，其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。结果显示其达到所需水解度时间为8.4h，且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为72.1%和74.1%，均低于实施例。
对比试验例3，将实施例1中酶解条件替换为2%的菠萝蛋白酶，其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。结果显示其达到所需水解度时间为8.5h，且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为72.1%和72.2%，均低于实施例。
对比试验例4，将实施例1中酶解条件替换为1%的中性蛋白酶，1%风味蛋白酶。其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。结果显示其达到所需水解度时间为7.9h，且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为79.1%和78.0%，均低于实施例。
对比试验例5，将实施例1中酶解条件替换为1%的中性蛋白酶，1%菠萝蛋白酶。其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。结果显示其达到所需水解度时间为8.1h，且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为80.2%和78.2%，均低于实施例。
对比试验例6，将实施例1中酶解条件替换为1%的风味蛋白酶，1%菠萝蛋白酶。其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。结果显示其达到所需水解度时间为8.1h，且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为73.1和79.1%，均低于实施例。
由对比例1-6可见，添加单味蛋白酶或两酶相复配后制得的美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率均低于实施例，由此可知在本发明工艺中中性蛋白酶、菠萝酶、风味蛋白酶相互协同，使最终制得的产品美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率大大提高。
对比试验例7，将实施例1中得到的多肽溶液在不加入香菇多糖反应的情况下直接进行羟自由基和DPPH清除率测定，两个指标的结果分别为30.1%和26.9%，均低于实施例。
对比试验例8，将实施例1中的香菇多糖溶液直接进行羟自由基和DPPH清除率测定，两个指标的结果分别为20.2%和21.2%，均低于实施例。
对比试验例8，将实施例1中多肽与多糖的反应条件设定为常温，其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。其DPPH自由基清除率的分别为26.2%和28.2%，均低于实施例。
对比试验例9，将实施例1中多肽与多糖的反应条件设定为温度50℃，其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。其DPPH自由基清除率的分别为30.2%和31.2%，均低于实施例。
对比试验例10，将实施例1中多肽超滤和美拉德肽超滤步骤省略，其余条件均相同，并使用相同的抗氧化测定方法。且其美拉德反应物在相同浓度下的羟自由基和DPPH清除率分别为77.7%和79.2%，均低于实施例。
本发明中的复合酶工艺、香菇多糖工艺密不可分，具有协同作用，是不可缺少的一个整体工艺，正是采用了本发明的复合酶工艺、香菇多糖工艺，才使制得的大鲵美拉德肽羟自由基清除率为85-91%；DPPH清除率为84-90%。
Claims (10)
1.一种具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）原料预处理：以大鲵肌肉为原料，切块，加入清水后煮沸并冷却至酶解温度；
（2）酶解：加入复合蛋白酶，酶解后即得到大鲵肌肉酶解液；
（3）灭酶:将酶解液加热煮沸灭酶，并冷却；
（4）过滤：将灭酶后的酶解液依次进行过滤、离心、微滤、超滤得到无杂质的小分子大鲵酶解液；
（5）美拉德肽溶液的制备：将酶解液浓缩得浓缩液，加入多糖溶液并在加热条件下反应，得到美拉德肽溶液；
（6）超滤：将美拉德肽溶液经过超滤，得到大分子量的美拉德肽溶液；
（7）美拉德肽的制备：将美拉德肽溶液用冻干或者喷雾干燥的方式最终得到美拉德肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述大鲵肌肉为去除皮和油脂的大鲵肌肉；所述清水质量为大鲵肌肉的3-6倍；煮沸时间为10-30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述复合蛋白酶的添加量为大鲵肌肉质量的1-5%，其酶解条件为温度40-60℃，时间6-7h，酶解程度为酶解至水解度为20%-25%；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、菠萝酶、风味蛋白酶复配而成，按质量百分比计其复配比例为中性蛋白酶25%-35%，菠萝酶为5%-15%，余量为风味蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述灭酶煮沸时间为5-15min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述离心条件为转速4000r/min，时间20min；所述微滤条件为微滤膜孔径0.5um；所述超滤条件为超滤膜孔径2000相对分子量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述浓缩方式为真空浓缩或加热蒸发浓缩，浓缩液质量分数为10-25%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述多糖溶液加入量为大鲵浓缩液质量的25%-100%，反应条件为时间2-5h，温度为100-121℃；所述多糖溶液为香菇多糖溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中所述超滤条件为超滤膜孔径5000相对分子量。
9.一种如权利要求1-8任意一项所述的方法制得的具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽。
10.根据权要求9所述的具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽羟自由基清除率为85-91%；DPPH清除率为84-90%。
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