CN112931923A - 一种特定分子量肽美拉德中间体的制备方法、及其用于烟用香精的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特定分子量肽美拉德中间体的制备方法，包括如下步骤：①酶解植物蛋白得到植物蛋白肽分散液；②将步骤①得到的植物蛋白肽分散液经超滤系统进行分级分离，得到具有一定分子量分布的肽分散液；③将步骤②得到的肽分散液加入还原糖，调节肽分散液的pH值进行常压热反应，然后进行减压真空浓缩反应，降温冷却结束反应，经喷雾干燥即得所述的特定分子量肽美拉德中间体。本发明制备方法得到的特定分子量肽美拉德中间体用于烟草加香，解决了香精香料的储存不稳定性的问题，与卷烟的整体协调性较好；且本发明制备方法得到的特定分子量肽美拉德中间体对超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除效果较好。

Description

一种特定分子量肽美拉德中间体的制备方法、及其用于烟用 香精的用途

技术领域

本发明属于热反应香精和烟草加工领域，涉及美拉德反应技术和烟草加香技术，具体为一种具有抗氧化性的特定分子量肽美拉德中间体的制备方法、及其用于烟用香精的用途。

背景技术

香气和吸味是卷烟重要的品质特征，为增加卷烟香气、改善吸食特性及赋予卷烟独特风格，通常在卷烟生产过程中添加香精香料。随着烟草工业的发展，新型烟用香精不断被开发出来。目前，烟用香精香料种类繁多，其中，肽美拉德中间体是一种重要的烟用香料。肽美拉德中间体是肽与还原糖缩合反应所生成的脱氧氨基糖类化合物，是美拉德反应过程中可稳定存在的一类非挥发性中间产物；该类产物常温下理化性质稳定，高温或加热条件下可继续裂解，迅速产生大量挥发性化合物，可改善卷烟的吸味，增加甜香和烘烤香，可作为一种稳定的致香前体应用在卷烟加香中，从而实现卷烟的稳定加香和燃吸时香气的均匀释放。然而，并不是任意分子量的肽美拉德中间体都适宜卷烟的吸味，寻找出与卷烟的整体协调性较好的特定分子量肽美拉德中间体是热稳定烟用香精香料开发的重要方面。

发明内容

为克服烟用香精在长期贮藏过程中的香气挥发、氧化变质，以及卷烟燃吸过程中香精原料在高温燃吸过程中提前挥发或过度裂解，导致释香后劲不足或产生杂味异味等现象提出本发明。本发明提供一种具有抗氧化性的特定分子量肽美拉德中间体烟用香精的工业化制备方法，其具体工艺流程见图1。将制备得到的特定分子量肽美拉德中间体化合物添加至卷烟中，可以显著提高卷烟的香气，增强卷烟的吸味，圆和烟气，烘烤香和坚果香明显，与卷烟烟气香韵谐调性良好，并具有一定的抗氧化效果，可以延长烟丝在储藏过程中的稳定性，产品应用效果理想。

本发明的技术方案如下：

本发明第一方面公开了一种特定分子量肽美拉德中间体的制备方法，包括如下步骤：

①将植物蛋白溶于水中，在80-100℃条件下对植物蛋白分散液进行热处理10-60min，然后冷却至室温，调节分散液pH值至4-8，添加蛋白酶，在30-60℃条件下酶解1-8h后升温至90-100℃将蛋白酶灭活，而后将分散液冷却至室温，离心取上清液得到植物蛋白肽分散液；

②将步骤①得到的植物蛋白肽分散液经超滤系统进行分级分离，得到具有一定分子量分布的肽分散液；

③将步骤②得到的肽分散液加入还原糖，调节肽分散液的pH值进行常压热反应，然后进行减压真空浓缩反应，降温冷却结束反应，经喷雾干燥即得所述的特定分子量肽美拉德中间体。

优选地，所述植物蛋白为玉米蛋白、小麦面筋蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、葵花籽蛋白中的的一种；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、羧肽酶、风味酶、氨肽酶或复合蛋白酶中的一种或几种，蛋白酶的添加量分别为所述植物蛋白重量的0.3-6％。

优选地，步骤①的植物蛋白与水的质量比例为1:(6-25)。

优选地，步骤②的超滤系统使用的超滤膜为1kD和5kD；步骤②的分级分离的步骤为：先采用5kD的超滤膜对所述植物蛋白肽分散液进行过滤，得到的滤液再采用1kD的超滤膜过滤，取未通过膜的组分，最终得到的滤液中含有相对分子质量在1kD至5kD之间的植物蛋白肽。

优选地，所述还原糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖中的一种，所述还原糖的添加量为所得肽分散液中固形物重量的5-60％。

优选地，步骤③的常压热反应的温度为50-100℃且分散液的pH值为5-8，反应时间为20-220min；减压真空浓缩反应的温度为50-100℃，反应时间为5-60min；脱水至固形物含量10-60wt％。

本发明第二方面公开上述制备方法制得的特定分子量肽美拉德中间体。

本发明第三方面公开所述的特定分子量肽美拉德中间体用于烟草加香的用途。

优选地，所述特定分子量肽美拉德中间体的添加量为烟草重量的0.1wt‰-15wt‰；进一步优选为0.1wt‰-10wt‰；最优选为5wt‰。

对上述得到的特定分子量肽美拉德中间体进行热裂解，对其裂解后产生的香气物质进行分析，香气物质的主要成分为苯酚类、酮类、苯类、呋喃类、醇类、酯类、醛类、酸类、吡啶类、吲哚类、萘类、稠环类、烯类、烷烃等化合物，其中以醛类和呋喃类的含量最多；醛类物质主要是苯甲醛和苯乙醛，能产生令人愉快的花香、果香和甜香，对卷烟风味具有重要作用；呋喃类物质具有浓郁的焦糖风味，能够显著增强卷烟的焦香；酮类物质具有葡萄酒样香，有柔和烟气的作用。吡咯、吡嗪和吡啶类物质主要增强卷烟的烘烤香和坚果香。

将所得的特定分子量肽美拉德中间体应用于卷烟产品中，卷烟的香气量和香气质明显改善，透发性强，协调性佳，烘焙香和焦香有所提高，烟气甜润、柔和、细腻，杂气明显改善，余味回甜舒适。同时，对所得的肽美拉德中间体进行抗氧化性测定，显示其具有较强的还原力，其超氧阴离子自由基及DPPH自由基清除率高。所得的特定分子量肽美拉德中间体的抗氧化性效果见图5-图7。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的一种特定分子量肽美拉德中间体制备方法，酶解与糖基化过程均在水相中合成，操作简便，设备简易，在温和温度下进行反应，制备时间短，产率高且食用安全。因此，本发明的制备方法可直接应用于工业化大规模生产，所制备的特定分子量肽美拉德中间体可作为添加剂直接应用于卷烟产品中，具有较强的实际应用价值，满足绿色工业化生产的要求。

2.本发明的一种特定分子量肽美拉德中间体制备方法、及制备得到的特定分子量肽美拉德中间体用于烟用香料为首次报道。该特定分子量肽美拉德中间体在高温热裂解条件下可产生丰富的挥发性致香化合物，具有果香、甜香、烘烤香和坚果香等香味。将得到的特定分子量肽美拉德中间体添加至卷烟中，香气量和香气质明显改善，透发性强，烘焙香和焦香特征明显，烟气甜润、柔和、细腻，杂气改善明显，余味舒适回甜，与卷烟香气的整体协调性较好。而不在该分子量范围内的肽美拉德中间体效果较差或无此效果。

3.本发明制备方法制备得到的特定分子量肽美拉德中间体，常温状态下理化性质稳定并具有良好的抗氧化效果，可以延长烟丝在储藏过程中的稳定性。

4.本发明制备方法制备得到的特定分子量肽美拉德中间体，经测试，在浓度为1.2mg/mL时对超氧阴离子自由基的清除率可达39.50％，对DPPH自由基清除率达30.23％，还原力较高为0.46。而不在该分子量范围内的肽美拉德中间体效果较差或无此效果。

附图说明

图1为本发明的特定分子量肽美拉德中间体的工业化生产工艺流程图。

图2为实施例玉米蛋白酶解液C1-5kD的相对分子质量分布。

图3为对比例玉米蛋白酶解液C1kD的相对分子质量分布。

图4为实施例得到的特定分子量肽美拉德中间体C1-5kD的质谱基峰谱图。

图5为实施例和对比例中所制备的玉米肽美拉德中间体的还原力比较。

图6为实施例和对比例中所制备的玉米肽美拉德中间体的DPPH自由基清除率比较。

图7为实施例和对比例中所制备的玉米肽美拉德中间体的超氧阴离子自由基清除率比较。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例

本实施例的一种特定分子量肽美拉德中间体的工业化生产工艺流程见图1，具体步骤如下：

①将100公斤玉米蛋白按固液质量比1:20溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节至pH值为8.0，添加复合蛋白酶0.5公斤(玉米蛋白质量的0.5wt％)，60℃酶解4h，升温至100℃，灭酶10min，离心机离心30min后得到的上清液为玉米蛋白酶解液；

②采用超滤系统将上述方法制备的玉米蛋白酶解液，经5kD超滤膜分离，取通过膜的组分，得到玉米肽分散液C5kD，将所得分散液经1kD超滤膜分离，取未通过膜的组分，得到玉米肽分散液C1-5kD，其中的玉米肽分子量鉴定结果见图2；C1-5kD分子量分布结果见下表1。

表1C1-5kD分子量分布结果

	移动时间	Mn	Mw	MP	Mz	面积	％面积
								1	14.783	3514	3601	3007	3712	79335	0.10
2	15.483	2330	2358	2026	2388	454324	0.55
								3	16.733	1270	1314	1001	1363	5465374	6.58
4	17.967	668	694	499	721	16071824	19.36
								5	18.849	297	317	304	337	46762493	56.34
6	19.783	83	112	179	128	14170660	17.07

③添加步骤②所得的玉米肽分散液C1-5kD固形物含量的5wt％的葡萄糖，调节溶液pH值为6.0，在常压80℃下热反应60min，在80℃下进行减压真空浓缩反应处理至固形物含量40wt％；反应结束后循环水冷却，经喷雾干燥即得特定分子量玉米肽美拉德中间体粉末产品。

经测试，该特定分子量玉米肽美拉德中间体在浓度在1.2mg/mL时对超氧阴离子自由基的清除率为39.50％，对DPPH自由基清除率为30.23％，还原力为0.46(见图5-图7)。

采用Py-GC/MS模拟卷烟燃吸过程，分别在300℃、600℃、900℃三个温度点对所制得的特定分子量玉米肽美拉德中间体进行热裂解，并分析对其热裂解产物进行定性定量分析，明确其致香成分，共得到200种化合物，结果见表5。由表5可知热裂解产物主要分为苯酚类、酮类、苯类、呋喃类、醇类、酯类、醛类、酸类、吡啶类、吲哚类、萘类、稠环类、烯类、烷烃等化合物；其中以醛类和呋喃类的含量最多；醛类物质主要是苯甲醛和苯乙醛，产生的令人愉快的花香、果香和甜香，对卷烟风味具有重要作用；呋喃类物质具有浓郁的焦糖风味，能够显著增强卷烟的焦香。酮类物质具有葡萄酒样香，有柔和烟气的作用；吡咯、吡嗪和吡啶类物质主要增强卷烟的烘烤香和坚果香。

将所得特定分子量玉米肽美拉德中间体粉末产品溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝重量的1wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表3和表4所示。以空白烟丝(未添加玉米肽美拉德中间体的空白卷烟)为对照样进行对照。由表3可以看出，添加C1-5kD玉米蛋白肽美拉德中间体的卷烟，卷烟的口腔刺激/舌部灼烧减弱，烟气细腻、柔和、饱满、丰富性增强，香气量明显提升，甜润感好，余味回甜较舒适，与烟香协调性好。由表4可知，添加C1-5kD的玉米蛋白肽美拉德中间体的卷烟，其烤烟烟香比对照样更强烈，果香、青滋香、烘焙香和甜香均得到显著提升，并新增添了清香、花香、豆香的香气风格。

表3卷烟样品的品质特征得分

表4卷烟样品的评吸香气风格得分

通过Uniprot Protein Database数据库对比分析形成C1-5kD肽美拉德中间体的肽的结构信息，从其质谱信息中找到形成中间体的45种蛋白质分子，明确了其333条糖基化底物肽段的结构信息，其质谱基峰谱图见图4，其蛋白种类和对应肽段数量见表7。

表7 C1-5kD蛋白种类和对应肽段数量

对比例

与实施例不同之处在于采用超滤系统将上述方法制备的玉米蛋白酶解液，经5kD超滤膜分离，取通过膜的组分，再经1kD超滤膜分离，取通过膜的组分得到玉米肽溶液C1kD，相对分子质量鉴定结果见图3，分子量分布见表2。

表2 C1kD分子量分布结果

	移动时间	Mn	Mw	MP	Mz	面积	％面积
								1	16.733	1167	1193	1001	1226	324624	0.67
2	17.790	619	637	552	658	4250771	8.79
								3	19.134	269	284	259	302	31757100	65.70
4	19.783	75	99	179	119	12002978	24.83

将所得玉米肽美拉德中间体粉末产品溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝重量的1wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表3和表4所示。

该产品在浓度为1.2mg/mL时对超氧阴离子自由基的清除率为35.10％，对DPPH自由基清除率为28.03％，还原力为0.42。此外，由数据可知，该分子量分布的玉米肽美拉德中间体的抗氧化活性均弱于C1-5kD玉米肽美拉德中间体(见图5-图7)。

以空白烟丝(未添加玉米肽美拉德中间体的空白卷)为对照样进行对照。由表3卷烟样品的品质特征得分可以看出，C1kD玉米肽美拉德中间体相对于分子量在C1-5kD之间玉米肽美拉德中间体，其与卷烟的整体协调性不如C1-5kD。由表4卷烟样品的评吸香气风格得分同样可知，添加C1kD玉米肽美拉德中间体的卷烟，其原有的烤烟烟香较对照样空白卷烟更强烈，果香、青滋香、烘焙香和甜香均得到显著提升，并新增添了清香、花香、豆香的香气风格。但整体评分效果仍不如分子量在C1-5kD之间玉米肽美拉德中间体的整体评分效果。

采用Py-GC/MS模拟卷烟燃吸过程，分别在300℃、600℃、900℃三个温度点对对比例所制备的玉米肽美拉德中间进行热裂解，并分析对其热裂解产物进行定性定量分析，明确其致香成分，共得到218种化合物，结果见表6。主要也分为苯酚类、酮类、苯类、呋喃类、醇类、酯类、醛类、酸类、吡啶类、吲哚类、萘类、稠环类、烯类、烷烃等化合物。但显著致香化合物如醛类、酮类、呋喃类及吡嗪、吡咯、吡啶等，其含量和种类均不如实施例得到的特定分子量玉米肽美拉德中间体。

上述的热裂解条件及测试条件如下：

裂解条件：氧氮混合气(氧气和氮气按体积比9:91混合)，反应气的流量20mL/min。热裂解探头初始温度40℃，保持5s，然后以10℃/ms的升温速率，分别升至300℃、600℃、900℃，并保持5s。吸附肼设置：吸附温度-50℃。

GC工作条件：色谱柱：DB-WAXETR(60m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：280℃；程序升温：柱温40℃保持3min，以10℃/min升至240℃，再以20℃/min升至280℃，保持15min；载气流速：He，1mL/min；分流比50:1。

MS工作条件：质谱传输线温度：280℃；电离方式：EI；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离能量：70eV；扫描范围：33-550amu。采用Nist08数据库检索，以匹配度≥85％者定性，峰面积归一化法定量。

感官评吸由9名省级以上卷烟感官评吸专家完成，参考GB/T16447—2004《烟草和烟草制品调节和测试的大气环境》调节卷烟样品的水分，制备样品；参考YC/T 497-2014《卷烟中式卷烟风格感官评价方法》对各卷烟样品的品质特征、风格特征进行评分，中式卷烟风格的感官评价方法包含卷烟产品的品质特征(包括舒适感特性，烟气特性)和风格特征(包括风味特征，香气风格)共27个指标。品质特征以0.1分为计分单位，最后结果取平均值，保留两位小数；其他指标均以0.5分为计分单位，最后结果取平均值，保留一位小数。上述实施例和对比例的实验中，空白卷烟样品由云南中烟工业有限责任公司提供；采用CIJECTOR加香注射机将实施例和对比例的肽美拉德中间体分别注射至空白卷烟样品中；使用的水为蒸馏水。糖和蛋白使用食品级，蛋白溶出率(％)＝上清液中蛋白质含量/原料中蛋白质含量×100；其中，蛋白质的测定采用GB/T5009.5-2010凯氏定氮法。

品质特征和评吸香气风格评分标准分别见表8和表9。

表8品质特征指标评分标准

表9评吸香气风格指标评分标准

表5实施例得到的特定分子量肽美拉德中间体C1-5kD在不同温度下的热裂解产物

表6对比例得到的C1kD肽美拉德中间体在不同温度下的热裂解产物

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的范围之内。

Claims (9)

1.一种特定分子量肽美拉德中间体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①将植物蛋白溶于水中，在80-100℃条件下对植物蛋白分散液进行热处理10-60min，然后冷却至室温，调节分散液pH值至4-8，添加蛋白酶，在30-60℃条件下酶解1-8h后升温至90-100℃将蛋白酶灭活，而后将分散液冷却至室温，离心取上清液得到植物蛋白肽分散液；

②将步骤①得到的植物蛋白肽分散液经超滤系统进行分级分离，得到具有一定分子量分布的肽分散液；

③将步骤②得到的肽分散液加入还原糖，调节肽分散液的pH值进行常压热反应，然后进行减压真空浓缩反应，降温冷却结束反应，经喷雾干燥即得所述的特定分子量肽美拉德中间体。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述植物蛋白为玉米蛋白、小麦面筋蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、葵花籽蛋白中的一种；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、羧肽酶、风味酶、氨肽酶或复合蛋白酶中的一种或几种，蛋白酶的添加量分别为所述植物蛋白重量的0.3-6％。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤①的植物蛋白与水的质量比例为1:(6-25)。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤②的超滤系统使用的超滤膜为1kD和5kD；步骤②的分级分离的步骤为：先采用5kD的超滤膜对所述植物蛋白肽分散液进行过滤，得到的滤液再采用1kD的超滤膜过滤，取未通过膜的组分，最终得到的滤液中相对分子质量在1kD至5kD之间的植物蛋白肽。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述还原糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖中的一种，所述还原糖的添加量为所得肽分散液中固形物重量的5-60％。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤③的常压热反应的温度为50-100℃且分散液的pH值为5-8，反应时间为20-220min；减压真空浓缩反应的温度为50-100℃，反应时间为5-60min；脱水至固形物含量10-60wt％。

7.根据权利要求1-6任一所述制备方法制得的特定分子量肽美拉德中间体。

8.根据权利要求7所述的特定分子量肽美拉德中间体用于烟草加香的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述特定分子量肽美拉德中间体的添加量为烟草重量的0.1wt‰-15wt‰。

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