CN111073945B - 一种肽美拉德中间体、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肽美拉德中间体的制备方法，包括如下步骤：①将蛋白用蛋白内切酶酶解，或使用蛋白内切酶和蛋白外切酶双酶水解得到酶解液；②得到的酶解液加入还原糖反应经喷雾干燥即得所述肽美拉德中间体。将得到的肽美拉德中间体用于烟草加香，卷烟的香气量和香气质明显改善。
Description
技术领域
本发明属于香料领域，具体涉及一种基于生物酶解调控蛋白质水解度的方法制备的肽美拉德中间体及该中间体用于烟丝加香的用途。
背景技术
烟草行业中，在卷烟焦油量和危害性逐步降低的趋势下，如何弥补卷烟香味的损失、改善卷烟的燃吸品质成为行业对烟用香精香料研发提出的迫切要求。目前烟草加香中常用的热反应香精主要为完全美拉德反应产物(Maillardreaction products,MRPs)。然而，卷烟燃吸过程中烟支头段中心温度可达700～900℃，在这样的高温下，MRPs将分解失掉原有的香味，并热解产生不可预测的香味物质；且MRPs储藏稳定性差，风味逸失，产品质量很难控制。美拉德中间体化合物在常温下无色无味，具有较稳定的理化性质，其在后续加热或热裂解条件下能继续完成美拉德反应，迅速释放风味物质，已被证实为烟草香气重要的贡献者。因此，美拉德中间体可作为稳定的致香前体物来改善烟草吸味，增加烟草的香味等，在卷烟加香中具有较大的应用潜力。然而，目前美拉德中间体通用的制备方法为有机相合成法，一般在无水甲醇中回流5～8小时，然后用无水丙酮反复纯化，再重结晶得到中间体；该制备方法产率低、制备工艺复杂、有机试剂残留、安全性差，不便于规模化生产。此外，以氨基酸和还原糖为反应底物制备的美拉德反应中间体经热裂解后产品整体呈味单一，香韵不够饱满丰富，无法满足烟草加香的需要。
针对以上现有技术及产品的缺陷提出本发明。
发明内容
本发明提供一种基于生物酶解调控蛋白质水解度制备肽美拉德中间体烟用香料及方法。将制备的肽类美拉德中间体化合物添加至卷烟中，可以显著提高卷烟的香气，增强卷烟的吸味，圆和烟气，烘烤香和坚果香明显，与卷烟烟气香韵谐调性良好，应用效果理想。
本发明的技术方案如下：
本发明第一方面公开了一种肽美拉德中间体的制备方法，包括如下步骤：
①将蛋白溶于水中，热变性后冷却至一定温度，调节pH值，添加蛋白内切酶，酶解一定时间后升温灭酶，冷却分离后得到酶解液；或者添加蛋白内切酶，酶解一定时间后再添加蛋白外切酶继续酶解一定时间后升温灭酶，冷却分离后得到酶解液；
②将步骤①得到的酶解液加入还原糖，调节溶液pH值进行常压热反应，然后进行减压真空脱水反应，冰水浴冷却结束反应，经喷雾干燥即得所述肽美拉德中间体。
优选地，步骤①蛋白为植物蛋白，所述植物蛋白为玉米蛋白、小麦面筋蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、葵花籽蛋白的一种；所述蛋白内切酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或复合蛋白酶的一种或几种，所述的蛋白外切酶为羧肽酶、风味酶、氨肽酶的一种或几种。
优选地，步骤①的蛋白与水的质量比例为1：(8-20)，热变性温度为80-100℃，热变性时间为10-60min；酶解温度为30-60℃，酶解pH值为5-8，蛋白内切酶和蛋白外切酶添加量分别为蛋白的0.5-5wt％，酶解时间为1-8h。
优选地，步骤①调控玉米蛋白的水解度至4.0-5.0，调控小麦面筋蛋白的水解度至5.0-8.0，调控大豆蛋白水解度至10.0-12.0，调控花生蛋白水解度至12.0-14.0，调控葵花籽蛋白水解度至7.0-9.0；灭酶的温度为95-100℃，灭酶时间为10-30min。
优选地，步骤②的还原糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖中的一种；所述还原糖的添加量为酶解液固形物含量的5-40wt％。
优选地，步骤②常压热反应的温度为50-90℃且溶液pH为5-8，反应时间为20-200min；减压真空脱水反应的温度为50-90℃，反应时间为5-60min，脱水至固形物含量10-40wt％。
本发明第二方面公开了所述制备方法制得的肽美拉德中间体。
本发明第三方面公开了所述的肽美拉德中间体用于烟丝加香的用途。
优选地，所述肽美拉德中间体的添加量为烟丝重量的0.1wt‰-15wt‰。
本发明的具体方案为：
(1)采用以下其中一种方法对蛋白质水解度进行调控；
单酶酶解法：将蛋白按一定固液比溶于蒸馏水中混合均匀，热变性处理，冷却，调节酶解温度和pH，添加一种蛋白内切酶进行酶解，至一定水解度后升温灭酶，冷却离心后保留上清液；
双酶分步酶解法：将蛋白按一定固液比溶于蒸馏水中混合均匀，热变性处理，冷却，调节酶解温度和pH，添加一种蛋白内切酶进行酶解，酶解一定时间后，再添加一种蛋白外切酶继续酶解一定时间，至一定水解度后升温灭酶，冷却离心后保留上清液；
(2)取上述方法制备的蛋白酶解液，添加还原糖，调节溶液pH后进行常压热反应，再进行减压真空脱水反应处理，冰水浴冷却结束反应，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。
(3)将步骤(2)所得肽美拉德反应中间体添加至烟丝中，添加量为烟丝重量的0.1wt‰-15wt‰。
优选地所述的蛋白为植物蛋白，如玉米蛋白、小麦面筋蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、葵花籽蛋白等；所述蛋白内切酶为：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶等，所述的蛋白外切酶为：羧肽酶、风味酶、氨肽酶等。
优选地，所述的植物蛋白固水质量比例为1：(8-20)，热变性处理温度为80-100℃，热变性处理时间为10-60min。
优选地，所述的酶解pH为5-8，蛋白内切酶和外切酶添加量分别为蛋白质的0.5-5wt％，酶解温度为30-60℃，酶解时间为1-8h。
优选地，调控玉米蛋白水解度至4.0-5.0，调控小麦面筋蛋白水解度至5.0-8.0，调控大豆蛋白水解度至10.0-12.0，调控花生蛋白水解度至12.0-14.0，调控葵花籽蛋白水解度至7.0-9.0，灭酶温度为95-100℃，灭酶时间为10-30min。该数值为酶解后的蛋白溶液用甲醛滴定法测定的数值。
优选地，所述的还原糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖等，所述还原糖添加量为蛋白酶解液固形物含量的5-40wt％，调节溶液pH为5-8。
优选地，所述的常压热反应温度为50-90℃且溶液pH为5-8，反应时间为20-200min，减压真空脱水反应温度为50-90℃，反应时间为5-60min，脱水处理至固形物含量10-40wt％。
根据以上方法制备所得肽美拉德中间体为首次得到，作为烟用香料加入到卷烟中，添加量为烟丝重量的0.1wt‰-15wt‰；进一步优选为0.1wt‰-10wt‰；最优选为5wt‰。
所得肽美拉德中间体热裂解后产生的香气物质经分析，其中的醛类高于5wt％、吡嗪类高于2.8wt％、有利于增强烤烟香韵的吡咯类物质高于10wt％、有利于增加烟气浓度提供白肋烟特征香并对降低焦油卷烟香味补偿作用的吡啶类物质高于3.6wt％。将所得肽美拉德中间体应用于卷烟产品，经评吸卷烟的香气量和香气质明显改善，透发性强，协调性佳，烘焙香和焦香有所提高，烟气甜润、柔和、细腻，杂气明显改善，余味回甜舒适。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过对蛋白进行可控酶解，制备最优美拉德反应底物肽，底物肽再与还原糖进行低温美拉德反应，并通过减压真空脱水反应处理后采用喷雾干燥法得到肽美拉德中间体。将制备得到的肽美拉德中间体应用到卷烟加香中，通过卷烟燃吸感官评价确定了最佳酶解工艺和糖肽源种类。本发明所述的生物酶解可控技术和应用效果，对于开发安全稳定的新型致香前体烟用香料具有重要意义。
2、本发明所选择的植物蛋白如玉米蛋白粉、大豆蛋白粉等，为农产品加工副产物。这一方面避免了化学合成香料对人体健康的危害，另一方面实现了粮食、油料等农作物资源的综合利用，提高了农产品加工副产物的附加值，满足集约化、可持续发展的理念。
3、现有技术的美拉德中间体化合物通常在无水甲醇中加热回流合成，且使用其他有机溶剂纯化。这些制备方法往往产生有机污染物，在实际生产中存在较大的安全隐患；同时成本较高，难以实现工业化生产。而本发明所采用的肽美拉德中间体制备方法，酶解与糖基化过程均在水相中合成，操作简便，设备简易，温和温度下进行反应，制备时间短，产率高且食用安全。因此，本发明的制备方法可直接应用于实际生产，所制备的肽美拉德中间体可作为添加剂直接应用于卷烟产品中，具有较强的实际应用价值，满足绿色工业的发展要求。
4、本发明所得到的致香前体物肽美拉德中间体用于烟用香料未见报道。将其添加至卷烟中后香气量和香气质明显改善，透发性强，协调性佳，烘焙香和焦香特征明显，烟气甜润、柔和、细腻，杂气改善明显，余味舒适。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
(1)将100g玉米蛋白按固液质量比比1：20溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为8.0，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的碱性蛋白酶0.5g，60℃酶解4h，调控水解度至4.5，升温至100℃，灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表1)，密封保存备用。
将100g玉米蛋白按固液比1：20(W/V)溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/LNaOH调节pH值为6.0，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的碱性蛋白酶0.5g，50℃酶解4h，自然pH下，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的风味酶0.5g，50℃酶解4h，调控水解度至9.11，升温至100℃灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表1)，密封保存备用。
表1玉米蛋白肽美拉德中间体制备条件
(2)取上述方法制备的玉米蛋白酶解液，分别添加蛋白酶解液固形物含量的5wt％的果糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为6.0后，在常压50℃下热反应60min，在50℃下进行减压真空脱水反应处理30min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德中间体粉末产品。将所得粉末产品溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝重量的1wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表2所示。
表2添加玉米肽美拉德中间体烟用香料的卷烟感官评吸效果
以空白烟丝C-0(未加本发明的肽美拉德中间体)为对照样进行对照。由表2可以看出，添加玉米蛋白肽美拉德中间体的卷烟，卷烟的烘烤香、坚果香、烤甜香明显，香气量明显提升，甜润感好，余味回甜较舒适，与烟香协调性好。其中玉米肽美拉德中间体C1加香效果较好，烟气较其他样品透发性强，具有较明显的坚果香和烘烤香且余味回甜舒适。由此可以确定玉米蛋白的最佳酶解酶种类为碱性蛋白酶，采用单酶酶解法，酶解时间为4h，酶添加量为玉米蛋白的0.5wt％，调控水解度至4.50，确定其糖源为果糖，该制备条件下所得肽美拉德中间体作为烟用香料在卷烟中的应用效果最理想。通过模拟卷烟燃吸条件，利用在线热裂解-气相色谱/质谱联用技术(Py-GC/MS)，对C1样品从300～900℃升温过程中高温热裂解的产物进行定性定量分析，明确起到卷烟感官品质改善作用的主要致香成分，结果见表3。
表3玉米蛋白肽美拉德中间体C1热裂解产物
由表3可知，在C1样品中总共鉴定出44种热裂解产物，其中主要裂解产物苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚和甲氧基苯酚等酚类化合物7种，共占比38.83％，该类化合物对烟气的香吃味主要影响为甜香、干草香、增加烟气丰满度。其次苯系化合物6种，占比24.46％，该类化合物对烟气的透发性具有显著影响。吡咯类化合物6种，占比10.29％，该类化合物对烟气产生甜香、花香、青香和葡萄酒样香气，具有柔烟气和增加烟气丰满度的作用。醛类化合物2种，占比6.05％，具有巧克力样香气、坚果香和白肋烟香。呋喃类化合物4种，占比5.61％，如糠醇具有谷物香，油样香；麦芽醇具有焦糖香和草莓香；2-乙酰基呋喃具有草本的辛香；2,3-二氢苯并呋喃具有甜香、辛香。吲哚类化合物2种，占比3.79％，具有优雅的茉莉花香。吡啶类化合物3种，占比3.63％，具有甜香，烤烟、白肋烟特征香。吡嗪类化合物2种，占比为2.73％，虽然占比较小，但其具有较低的阈值，是美拉德反应产物重要的致香成分，对烟气中的烘焙香和坚果香具有重要贡献，如2,5-二甲基吡嗪对烟气具有面包样的烘焙香。酸类3种，占比2.30％，酸类具有脂肪、蜡味、增甜的作用，对烟气具有柔和并增加其丰满度的作用。
实施例2
(1)将100g大豆蛋白按固液质量比1：15溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为7.0，添加大豆蛋白质量的1wt％的中性蛋白酶1g，60℃酶解2h，调控水解度至7.52，升温至100℃，灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表4)，密封保存备用。
将100g大豆蛋白按固液比1：15(W/V)溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/LNaOH调节pH7.0，添加大豆蛋白质量的1wt％的中性蛋白酶1g，58℃酶解2h，自然pH下，添加大豆蛋白质量的1wt％的氨肽酶1g，60℃酶解2h，调控水解度至10.93，升温至100℃灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表4)，密封保存备用。
表4大豆蛋白肽美拉德中间体制备条件
(2)取上述方法制备的大豆蛋白酶解液，分别添加蛋白酶解液固形物含量的20％果糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，用6mol/LNaOH调节溶液pH7.0后转移至烧瓶中，常压70℃下热反应100min后，在70℃下进行减压真空脱水反应处理15min，脱水至固形物含量25wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。将所得粉末产品溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝重量的2wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表5所示。
表5添加大豆蛋白肽美拉德中间体烟用香料的卷烟感官评吸效果
以空白烟丝(S-0)为对照样进行对照。由表5可以看出，将大豆蛋白肽美拉德中间体添加至卷烟中，卷烟的烘焙香、烤甜香明显，协调性较好。其中大豆蛋白肽美拉德中间体S8加香效果最好，烤甜香、坚果香显著，甜润感提升。由此可以确定大豆蛋白的最佳酶解酶种类为中性蛋白酶和氨肽酶，采用双酶分步法酶解大豆蛋白、酶解时间为2h，两种酶添加量各为大豆蛋白质量的1％，调控水解度至10.93，确定其糖源为阿拉伯糖，该制备条件下所得肽美拉德中间体作为烟用香料在卷烟中的应用效果最理想。对该样品进行热裂解，分析其主要致香成分，结果见表6。
表6大豆蛋白肽美拉德中间体S8热裂解产物
由表6可知，在S8样品中总共鉴定出49种热裂解产物，其各类化合物香味特征如实施例1中所述。其中主要裂解产酚类化合物7种，共占比26.81％。其次苯系化合物9种，占比20.06％。吡咯类化合物9种，占比11.58％。醛类化合物2种，占比5.61％。呋喃类化合物1种，占比1.94％。吲哚类化合物2种，占比8.53％。吡啶类化合物6种，占比5.79％。
实施例3
(1)将100g小麦面筋蛋白按固液质量比1：10溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为7.5，添加小麦面筋蛋白质量的3wt％的复合蛋白酶3g，70℃酶解4h，调控水解度至5.38，升温至100℃，灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表7)，密封保存备用。
将100g小麦面筋蛋白按固液比1：10溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为7.5，添加小麦面筋蛋白质量的3wt％的复合蛋白酶3g，70℃酶解4h，自然pH下，添加小麦面筋蛋白质量的3wt％的氨肽酶3g，70℃酶解4h，调控水解度至9.29，升温至100℃灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表7)，密封保存备用。
表7小麦面筋蛋白肽美拉德中间体制备条件
(2)取上述方法制备的小麦面筋蛋白酶解液，分别添加蛋白酶解液固形物含量的10wt％果糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为7.5后转移至烧瓶中，常压70℃下热反应120min后，在70℃下进行减压真空脱水反应处理30min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。将所得固体粉末产品溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝重量的3wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表8所示。
表8添加小麦面筋蛋白肽美拉德中间体烟用香料的卷烟感官评吸效果
以空白烟丝(G-0)为对照样进行对照。由表8可以看出，将小麦面筋蛋白肽美拉德中间体添加至卷烟中，卷烟偏焦香，蜜甜香，略带果香，稍有刺激，协调性一般。其中小麦面筋蛋白肽美拉德中间体G2加香效果最好，烟气较其他样品状态较好，香气上扬，透发性好，具有较显的烘焙香和蜜甜香，余味回甜。由此可以确定小麦面筋蛋白的最佳酶解酶种类为复合蛋白酶，采用单酶法酶解，酶解时间为4h，酶添加量为小麦面筋蛋白质量的3wt％，调控水解度至5.38，确定其糖源为葡萄糖，该制备条件下所得肽美拉德中间体作为烟用香料在卷烟中的应用效果最理想。对该样品进行热裂解分析其主要致香成分，结果见表9。
表9小麦面筋蛋白肽美拉德中间体G2热裂解产物
由表9可知，在G2样品中总共鉴定出56种热裂解产物，其各类化合物香味特征如实施例1中所述。其中主要裂解产物酚类化合物6种，共占比18.64％。其次苯系化合物6种，占比16.77％。吡咯类化合物8种，占比11.00％。醛类化合物4种，占比5.00％。呋喃类化合物6种，占比13.55％。吲哚类化合物2种，占比3.79％。吡啶类化合物5种，占比3.63％。吡嗪类化合物3种，占比为2.53％。酸类1种，占比1.33％。酮类5种，占比5.27％，具有葡萄酒样香，有柔和烟气的作用。
实施例4
(1)将100g花生蛋白按固液质量比1：8溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为8.0，添加花生蛋白质量的5wt％的碱性蛋白酶5g，60℃酶解6h，调控水解度至4.16，升温至100℃，灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表10)，密封保存备用。
将100g花生蛋白按固液质量比1：8溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为8.0，添加花生蛋白质量的5wt％的木瓜蛋白酶5g，70℃酶解6h，自然pH下，添加花生蛋白质量的3wt％的风味酶3g，70℃酶解6h，调控水解度至12.22，升温至100℃灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表10)，密封保存备用。
表10花生蛋白肽美拉德中间体制备条件
(2)取上述方法制备的花生蛋白酶解液，分别添加蛋白酶解液固形物含量的40wt％果糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为8.0后转移至烧瓶中，常压80℃下热反应60min后，在80℃下进行减压真空脱水反应处理10min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。将所得固体粉末产品溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝重量的5wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表11所示。
表11花生蛋白肽美拉德中间体烟用香料的卷烟感官评吸效果
以空白烟丝P-0(未加本发明的肽美拉德中间体)为对照样进行对照。由表11可以看出，将花生肽美拉德中间体添加至卷烟中，卷烟的焦香和烘焙香气量明显改善，坚果香和烤甜香显著，烟气质感提升，其中花生肽美拉德中间体P7加香效果最好，烟气较其他样品更柔和细腻，整体协调性好，余味干净。由此可以确定花生蛋白的最佳酶解酶种类为木瓜蛋白酶和风味酶，采用双酶分步法酶解、酶解时间为6h，木瓜蛋白酶添加量为花生蛋白5wt％，风味酶添加量为花生蛋白3wt％，调控水解度至12.22，确定其糖源为木糖，该制备条件下所得肽美拉德中间体作为烟用香料在卷烟中的应用效果最理想。对该样品进行热裂解分析其主要致香成分，结果见表12。
表12花生蛋白肽美拉德中间体P7热裂解产物
由表12可知，在P7样品中总共鉴定出43种热裂解产物，其各类化合物香味特征如实施例1中所述。其中主要裂解产酚类化合物3种，共占比9.83％。其次苯系化合物9种，占比31.47％。吡咯类化合物8种，占比23.98％。醛类化合物4种，占比5.23％。呋喃类化合物4种，占比10.40％。吲哚类化合物2种，占比5.42％。吡啶类化合物5种，占比3.63％。吡嗪类化合物2种，占比为2.75％成分。酸类1种，占比1.33％。酮类1种，占比0.80％，具有葡萄酒样香，有柔和烟气的作用。
比较例1
(1)将100g玉米蛋白按固液质量比1：20溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为8.0，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的木瓜蛋白酶0.5g，58℃酶解6h，调控水解度至5.50，升温至100℃，灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表13)，密封保存备用。
(2)取上述方法制备的玉米蛋白酶解液，分别添加蛋白酶解液固形物含量的5wt％果糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为6.0后，在常压50℃下热反应60min，在50℃下进行减压真空脱水反应处理30min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。将所得固体溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝的1wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表14所示。
比较例2
(1)将100g玉米蛋白按固液质量比1：20溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为6.0，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的木瓜蛋白酶0.5g，50℃酶解6h，自然pH下，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的羧肽酶0.5g，50℃酶解6h，调控水解度至10.95，升温至100℃灭酶10min，冷却离心(4300r/min)20min，取上清液，测定水解度和蛋白溶出率(结果见表13)，密封保存备用。
(2)取上述方法制备的玉米蛋白酶解液，分别添加蛋白酶解液固形物含量的5wt％果糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为6.0后，在常压50℃下热反应60min，在50℃下进行减压真空脱水反应处理30min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。将所得固体溶于水后添加至卷烟中，添加量分别为烟丝1wt‰。卷烟样品由专业感官评价员进行评吸，评吸结果如表14所示。
表13玉米蛋白肽美拉德中间体制备条件
表14添加玉米肽美拉德中间体烟用香料的卷烟感官评吸效果
由表13可知，当采用单酶法调控玉米蛋白水解度至5.50，双酶法调控水解度至10.95，参比实施例1，将玉米蛋白肽美拉德中间体添加至卷烟中，卷烟的整体评吸结果不如实施例1，香气量明显减弱，余味口腔略发干，略带酸刺感，透发性稍欠，口腔略叮刺，甜韵感不如实施例1。由此可以看出，水解度的调控与酶的种类直接相关，不同内切酶类控制水解度在一定范围内，不同内切酶和外切酶组合控制水解度在另一范围内(水解酶不参与美拉德反应，对风味影响无关)。而植物蛋白水解度、以及不同的还原糖与卷烟感官品质直接相关。因此采用不同水解酶对不同植物蛋白进行生物可控酶解的技术，决定了肽美拉德中间体的应用效果是否理想。
由上述实施例中的感官评吸结果可知，将肽美拉德中间体添加至卷烟中，不同水解度的肽源所制备的肽美拉德中间体具有不同的应用效果。感官评吸结果证实，经生物可控酶解技术调控玉米蛋白酶解度至4.0-5.0、小麦面筋蛋白水解度至5.0-8.0、大豆蛋白酶解度至10.0-12.0、花生蛋白水解度至12.0-14.0时，该底物肽制备的肽美拉德中间体应用于烟草加香，对卷烟的香气量和香气质明显改善，透发性强，香气谐调性佳，烘焙香、焦香和坚果香均可凸显，烟气甜润、柔和、细腻、余味回甜。通过在线热裂解分析技术(Py-GC/MS)进一步明确了不同肽美拉德中间体提升卷烟感官品质的主要致香化合物种类及含量组成。结果证实本发明的肽美拉德中间体作为烟用香料在卷烟中的应用效果理想；且该致香前体香料的制备介质使用的是水相。
表2、5、8、11、14中卷烟的感官评吸方法参照GB 5606.4-2005，卷烟样品的水分调节方法参照GB/T 16447-2004。上述实施例的实验中，空白卷烟样品由云南中烟工业有限责任公司提供；采用CIJECTOR加香注射机将本发明的肽美拉德中间体注射至空白卷烟样品中；使用的水为蒸馏水，糖和蛋白使用食品级。蛋白溶出率(％)＝(上清液中蛋白质含量/原料中蛋白质含量)×100；其中，蛋白质的测定采用GB/T 5009.5-2010凯氏定氮法。
甲醛滴定法测定水解度(DH)计算公式如下所示：
注：
C—氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；
V1—样品溶液在加入甲醛后滴定至终点所消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；
V2—空白溶液在加入甲醛后滴定至终点所消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；
V—酶解上清液的体积，mL；
m—样品质量，g；
8.38—每克蛋白质所含的肽键毫摩尔数，mmol/g。
热裂解条件如下：
升温程序：初始温度300℃，保持5s，以30℃/s升至900℃，保持5s；裂解氛围为：氧氮混合气(1:4)；气体流量为70mL/min。
热裂解产物的GC-MS分析条件如下：
色谱柱：HP-VOC弹性毛细管柱；规格：[60m(长度)×0.32mm(内径)×0.18μm(膜厚)]；载气流量：2.0mL/min；分流比：20:1；升温程序：初始温度40℃，保持4min，以10℃/min的速率升至250℃，保持75min；质谱传输线温度：280℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI；电子能量：70eV；四极杆温度：150℃；质量扫描范围：29～450a.m.u；溶剂延迟时间：3min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的范围之内。
Claims (4)
1.一种肽美拉德中间体的制备方法，其特征在于，所述肽美拉德中间体为玉米蛋白肽果糖美拉德中间体、大豆蛋白肽阿拉伯糖美拉德中间体、或花生蛋白肽木糖美拉德中间体；
所述玉米蛋白肽果糖美拉德中间体制备方法包括如下步骤：
(1)将100g玉米蛋白按固液质量比1：20溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为8.0，添加玉米蛋白质量的0.5wt％的碱性蛋白酶0.5g，60℃酶解4h，调控水解度至4.5，升温至100℃，灭酶10min，冷却离心20min，取上清液得到玉米蛋白酶解液；
(2)取玉米蛋白酶解液，添加蛋白酶解液固形物含量的5wt％的果糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为6.0后，在常压50℃下热反应60min，在50℃下进行减压真空脱水反应处理30min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得玉米蛋白肽果糖美拉德中间体粉末产品；
所述大豆蛋白肽阿拉伯糖美拉德中间体制备方法包括如下步骤：
(1)将100g大豆蛋白按固液比1：15(W/V)溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L NaOH调节pH7.0，添加大豆蛋白质量的1wt％的中性蛋白酶1g，58℃酶解2h，自然pH下，添加大豆蛋白质量的1wt％的氨肽酶1g，60℃酶解2h，调控水解度至10.93，升温至100℃灭酶10min，冷却离心20min，取上清液，得到大豆蛋白酶解液；
(2)取上述方法制备的大豆蛋白酶解液，添加蛋白酶解液固形物含量的20％阿拉伯糖，用6mol/L NaOH调节溶液pH7.0后转移至烧瓶中，常压70℃下热反应100min后，在70℃下进行减压真空脱水反应处理15min，脱水至固形物含量25wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得大豆蛋白肽阿拉伯糖美拉德中间体粉末产品；
所述花生蛋白肽木糖美拉德中间体制备方法包括如下步骤：
(1)将100g花生蛋白按固液质量比1：8溶于蒸馏水中混合均匀，升温至90℃热变性处理30min，冷却，用6mol/L的NaOH调节pH值为8.0，添加花生蛋白质量的5wt％的木瓜蛋白酶5g，70℃酶解6h，自然pH下，添加花生蛋白质量的3wt％的风味酶3g，70℃酶解6h，调控水解度至12.22，升温至100℃灭酶10min，冷却离心20min，取上清液，得到花生蛋白酶解液；
(2)取上述方法制备的花生蛋白酶解液，添加蛋白酶解液固形物含量的40wt％木糖，用6mol/L的NaOH调节溶液pH值为8.0后转移至烧瓶中，常压80℃下热反应60min后，在80℃下进行减压真空脱水反应处理10min，脱水至固形物含量20wt％，反应结束后冰水浴冷却，经喷雾干燥即得肽美拉德反应中间体粉末产品。
2.一种根据权利要求1制备方法制得的肽美拉德中间体。
3.根据权利要求2所述的肽美拉德中间体用于烟草加香的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肽美拉德中间体的添加量为烟丝重量的0.1wt‰-15wt‰。
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