CN109045061A - 铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用。本发明的铁皮石斛多糖应用在制备抑制细胞炎症因子IL‑1β、TNF‑α、降解软骨细胞外基质的基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13基因表达的骨关节炎药物中，也可以应用在制备促进软骨细胞外基质II型胶原蛋白和聚蛋白聚糖表达的骨关节炎药物中。本发明首次发现铁皮石斛多糖在治疗骨关节炎和保护软骨方面的显著效果，本发明中铁皮石斛多糖具有抗炎抗氧化的作用，通过清除自由基、活性氧、活性氮，提高抗氧化酶活性来减少软骨细胞凋亡，缓解氧化应激对软骨的伤害。因此，铁皮石斛多糖作为有效成分，在制备治疗骨关节炎药物中具有重要的社会意义和经济意义。

Description

铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是老年人群最常见的退行性疾病之一，它渐进式侵害关节软骨、骨和滑膜组织，导致关节疼痛、畸形和功能障碍，从而影响患者的活动能力。由于OA发病机制的复杂性，目前对OA的治疗方法大多旨在于缓解OA症状，减轻痛苦，严重的中晚期OA患者最终只能选择关节置换手术。

研究发现，炎症和氧化应激与OA的发生和发展过程中紧密相关。与正常人相比，OA患者关节组织中的多种炎症介质，如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(interleukin(IL)-1,-8,-6,-15,-17,-18,-21,and-33)都明显增加。IL－1作为主要的促炎症分子，其家族中的IL－1β能抑制软骨细胞增殖和代谢，诱导软骨细胞去分化，分泌基质金属蛋白酶1，3，13(MMP1，3，13)等促进软骨基质降解。局部的炎症反应、衰老或/和机械负荷会导致氧化应激的产生，表现为活性氧(ROS)、超氧化物、过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、过氧化硝基的积累，同时伴随着抗氧化酶和ROS清除系统的表达异常。氧化应激会导致软骨畸形，不仅加速骨代谢，还会抑制软骨细胞、成骨细胞及前体细胞的分化修复能力。因此，调节体内氧化/还原稳态平衡，抑制促炎因子的表达，可以有效延缓OA的发病进程，起到保护关节软骨的作用。

铁皮石斛又称黑节草，属于兰科附生兰类，是一种珍稀的药用植物，具有养阴生津，润喉护嗓，温胃明目，补肾益力，延年益寿的功效。铁皮石斛多糖(Dendrobiumofficinale polysaccharides，DOPS)是其最主要的药用成分，主要由主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等单糖按一定比例组成。《中国药典》中记载，铁皮石斛多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多种功效。DOPS还具有抗氧化，抑制促炎因子产生，减轻炎症反应的作用。

现有治疗骨关节炎的药物并不多，其中包括软骨润滑剂、糖皮质激素、以及解热镇痛剂和非甾体类抗炎药物等。然而，传统药物治疗方式存在以下技术问题：现有技术提供的治疗骨关节炎药物均局限于对疼痛等症状的缓解，不可逆转早期骨关节炎疾病进程，且存在胃肠道反应、肾脏毒性等多种副作用，可能对患者造成其他潜在伤害。近年来，免疫抑制剂和小分子抑制剂也逐渐成为治疗骨关节炎新型药物。但免疫抑制剂实际为重组活性蛋白，制备方法复杂，得率低，后期储存条件要求高。而小分子抑制剂价格昂贵，对其他脏器的影响未知，生物安全性有待研究。

现有技术中公开了白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用。该技术利用免疫抑制因子-白介素37制备口服或注射剂型药物治疗骨关节炎，白介素37作为重组蛋白穿过细胞膜进入巨噬细胞浆并进入细胞核。可明显抑制骨关节炎的细胞炎性因子的表达。另外公开了二羟基苯甲酸内脂5Z-7在制备治疗骨关节炎药物中的应用。该技术采用的二羟基苯甲酸内酯5Z-7是一种小分子抑制剂，在关节腔内可通过靶向抑制TAK1的酶活性来抑制滑膜及软骨组织中由炎性细胞因子、基质降解产物等成分所介导的NF-κB、p38及JNK等免疫相关通路的活化，从而通过调控上述通路下游与骨关节炎相关的一系列基因表达，以达到减轻滑膜炎症反应、抑制软骨降解、改善关节腔内微环境等目的。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用。本发明首次发现铁皮石斛多糖在治疗骨关节炎和保护软骨方面的显著效果，因此，铁皮石斛多糖作为有效成分，在制备治疗骨关节炎药物中具有重要的社会意义和经济意义。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

其中，所述铁皮石斛多糖应用在制备抑制细胞炎症因子IL-1β和TNF-α基因表达的骨关节炎药物中。

其中，所述铁皮石斛多糖应用在制备抑制降解软骨细胞外基质的基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13基因表达的骨关节炎药物中。

其中，所述铁皮石斛多糖应用在制备促进软骨细胞外基质II型胶原蛋白和聚蛋白聚糖表达的骨关节炎药物中。

本发明所述一种治疗骨关节炎药物中的药物组合物，所述药物组合物为铁皮石斛多糖与缓冲剂、甜味剂、防腐剂多种成分组成的注射液制剂。

进一步地，所述药物组合物为铁皮石斛多糖、柠檬酸、苯甲酸钠溶于注射用水中。

其中，所述注射用水为生理盐水或磷酸盐缓冲液PBS。

本发明所述的骨关节炎为软骨组织损伤导致的骨关节炎。

首次发现铁皮石斛多糖在治疗骨关节炎和保护软骨方面的显著效果。通过平衡氧化还原稳态减少软骨细胞凋亡，缓解氧化应激对软骨的伤害。减少促炎因子的生成，保护软骨细胞外基质，缓解软骨退化，能明显起到保护软骨的作用。

本发明铁皮石斛多糖通过平衡氧化还原稳态减少软骨细胞凋亡，缓解氧化应激对软骨的伤害。减少促炎因子的生成，保护软骨细胞外基质，缓解软骨退化，能明显起到保护软骨的作用。

本发明使用的铁皮石斛多糖在中药和保健品领域长期应用，生物安全性高。同时，铁皮石斛多糖的提取方法成熟，早已实现集约化生产，储存运输条件要求不高，大大降低铁皮石斛多糖作为药物的成本。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明中铁皮石斛多糖具有抗炎抗氧化的作用，通过清除自由基、活性氧、活性氮，提高抗氧化酶活性来减少软骨细胞凋亡，缓解氧化应激对软骨的伤害。同时，铁皮石斛多糖可能减少促炎因子IL-1β、TNF-α的生成，抑制基质金属蛋白酶MMP-1,3,13的表达，缓解软骨退化，起到保护软骨的作用。

本发明提供了铁皮石斛多糖作为治疗骨关节炎药物的给药剂量和频次，采用注射制剂进行关节腔注射，提高铁皮石斛多糖在体内的利用率，发挥最大疗效。

附图说明

图1为检测铁皮石斛多糖对细胞活性的影响的关系图；

图2为铁皮石斛多糖对细胞炎症因子IL-1β基因和TNF-α基因表达的影响的关系图；

图3为铁皮石斛多糖对基质金属蛋白酶MMP1、基质金属蛋白酶MMP3、基质金属蛋白酶MMP13基因表达的影响的关系图；

图4为铁皮石斛多糖对基质金属蛋白酶MMP1、3、13蛋白表达的影响的关系图；

图5为铁皮石斛多糖对软骨细胞外基质二型胶原蛋白和聚蛋白聚糖表达的影响的关系图；

图6为铁皮石斛多糖对软骨细胞中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)的影响关系图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

铁皮石斛多糖提取

生物活性成分铁皮石斛多糖，提取自铁皮石斛。铁皮石斛去叶取茎，80℃烘箱烘干，研磨成粉末，准确称取1.00g干品粗粉，用滤纸和脱脂纱布包好，用石油醚(60-90℃)在索氏提取器中85℃水浴回流脱脂1.5h，再用80％乙醇95℃水浴回流3h，取出滤纸包置于60℃烘箱中烘干，然后用细口瓶将滤纸中样品冲洗到150ml圆底烧瓶中，加入100ml去离子水，沸水中提取2次，3h/次，趁热过滤，收集滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至50ml后，加入少量活性炭进行脱色，过滤，滤液加4倍体积95％乙醇混合，静置过夜，离心去上清，50ml去离子水溶解沉淀，重复醇提1次。过滤沉淀，用95％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，60℃烘干，得到提取物为铁皮石斛多糖。

实施例2

铁皮石斛多糖制剂制备：

称取0.68g铁皮石斛多糖，2g柠檬酸以及0.8g苯甲酸钠混匀，将混合物溶于100ml注射用水，注射用水为生理盐水，也可以替换成磷酸盐缓冲液PBS(pH7.2)，搅拌混匀，过滤杂质，在无菌条件下分装到安培瓶中。

实施例3

小鼠内侧半月板不稳术(DMM)模型建立：

将8周龄C57L/B6小鼠用于实验，水合氯醛腹腔麻醉后常规备皮消毒膝关节，取右髌旁内侧切口显露膝关节，切开关节囊，打开关节腔，将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲膝关节，显露前交叉韧带，直视下用小尖刀剪断内侧半月板，尽量切去内侧半月板，术中不损伤软骨面，彻底止血，将髌骨复位，逐层缝合切口。假手术组作为对照组，术后不做任何固定措施，每日肌注青霉素，连续3d。3d后观察小鼠膝关节部位是否发生感染，未感染小鼠继续进行下一步药物注射。

造模结束后，铁皮石斛多糖制剂开始给药：

将未感染小鼠注射实施例2得到的铁皮石斛多糖制剂，药物的给药剂量为0～300mg/kg/day，给药频次为每日两次、每日一次或两日一次。小鼠关节腔注射方法：异氟烷气体麻醉小鼠，双膝备皮，75％乙醇消毒后，左手紧握住小鼠右下肢，屈曲60°，右手执针以髌骨下方髌腱外缘为进针点，稍向内下进针，穿过关节囊后既感到有落空感，此时注入相应体积的铁皮石斛多糖注射液，抽出针头即可。

实施例4

采用实施例3的方法，铁皮石斛多糖制剂糖的给药剂量为：0、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml；给药频次为：每日2次、每日1次、两日1次；给药方式和剂型为：注射液—关节腔注射。详细组合参见表1所示。

表1

组合	频次	剂量(mg/ml)	剂型—给药方式
				1	每日2次	生理盐水	注射液—关节腔注射
2	每日1次	生理盐水	注射液—关节腔注射
				3	两日1次	生理盐水	注射液—关节腔注射
4	每日2次	100	注射液—关节腔注射
				5	每日1次	100	注射液—关节腔注射
6	两日1次	100	注射液—关节腔注射
				7	每日2次	200	注射液—关节腔注射
8	每日1次	200	注射液—关节腔注射
				9	两日1次	200	注射液—关节腔注射
10	每日2次	300	注射液—关节腔注射
				11	每日1次	300	注射液—关节腔注射
12	两日1次	300	注射液—关节腔注射

连续给药8周处死实验动物，获取膝关节标本，切片行组织学染色，免疫组织化学染色评估软骨退变情况，发现健康的膝关节软骨表面光滑，结构完整，软骨细胞分布均匀；退变软骨表面出现裂隙，软骨细胞大量簇聚且数量减少。

本实施例明确了铁皮石斛多糖可以治疗DMM模型小鼠的骨关节炎，保护软骨。

实施例5

(1)CCK8法检测铁皮石斛多糖细胞毒性。

提取并培养原代软骨细胞，将H₂O₂设置7个浓度梯度(0，50，100，150，200，250，300μM)，依次加入96孔培养板的每孔细胞中，处理6h后CCK8试剂盒检测细胞活性。铁皮石斛按0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL的浓度梯度溶于PBS缓冲液(pH 7.2)，分别加入100μMH₂O₂预处理2h的细胞中，4h后CCK8试剂盒检测细胞活性。

实验结果请参见图1，软骨细胞在100mM过氧化氢处理后，0.2mg/mL,0.4mg/mL,0.6mg/mL，0.8mg/mL的铁皮石斛多糖可以增强细胞活性，说明铁皮石斛多糖对细胞无毒害作用，并且可以缓解过氧化氢对于细胞的氧化刺激，生物安全性高。

(2)铁皮石斛多糖对软骨细胞自由基的清除。

检测活性氧(ROS)的生成。收集细胞上清液，10mM浓度的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)37℃下暗中孵育20min。去除DCFH-DA，PBS清洗两次，将细胞浸于无血清培养基，荧光显微镜在激发波长470-490nm，吸收波长510nm下检测荧光强度。收集细胞上清液，用试剂盒检测细胞产生的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)的量。

实验结果请参见图6，铁皮石斛多糖可以有效增强软骨细胞的总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，抑制氧化产物丙二醛(MDA)的产生，说明铁皮石斛多糖具有抗氧化作用。

(3)铁皮石斛多糖抑制软骨细胞炎症因子表达，防止软骨降解。

铁皮石斛多糖按0.2mg/mL,0.4mg/mL,0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL的浓度梯度溶于无血清DMEM/F12 1:1培养基中，分别加入200μM H₂O₂预处理2h的细胞中，平行处理细胞2份，待12、24、48小时后，分别提取每组细胞RNA，用试剂盒将RNA逆转录成cDNA，同时用RIPA裂解液提取每组细胞蛋白。荧光定量PCR检测促炎细胞因子IL-1β、TNF-α，软骨分解代谢相关基因MMP1、MMP3、MMP13，以及软骨细胞外基质II型胶原蛋白，蛋白多糖的基因表达。通过Western Blot检测蛋白样品中上述炎症因子，软骨分解代谢蛋白以及细胞外基质蛋白的表达量。

如图2所示，通过荧光定量PCR检测促炎细胞因子IL-1β、TNF-α，对于细胞炎症因子IL-1β和TNF-α，铁皮石斛多糖显著抑制两种基因的表达，说明铁皮石斛多糖具有良好的抗炎作用。

如图3所示，对于降解软骨细胞外基质的基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)，铁皮石斛多糖显著抑制该基因的表达，说明铁皮石斛多糖可以保护软骨细胞外基质不被降解。

如图4所示，通过蛋白免疫印迹实验检测MMP1、MMP3、MMP13的蛋白表达水平，表明铁皮石斛抑制氧化应激环境下三种蛋白的产生，抑制软骨细胞外基质的降解。图3中MMP1、3、13的基因表达属于转录水平，图4中MMP1,3,13是蛋白表达，属于翻译水平，它们在转录的下游，直接发挥作用，降解软骨细胞外基质。

如图5所示，蛋白免疫印迹实验检测软骨细胞外基质二型胶原(Col2)和聚蛋白聚糖的蛋白表达水平，表明铁皮石斛多糖使软骨细胞在氧化应激下产生大量细胞外基质，保持软骨结构和功能的完整，起到保护软骨的作用。

Claims (7)

1.一种铁皮石斛多糖在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铁皮石斛多糖应用在制备抑制细胞炎症因子IL-1β和TNF-α基因表达的骨关节炎药物中。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铁皮石斛多糖应用在制备抑制降解软骨细胞外基质的基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13基因表达的骨关节炎药物中。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铁皮石斛多糖应用在制备促进软骨细胞外基质II型胶原蛋白和聚蛋白聚糖表达的骨关节炎药物中。

5.一种治疗骨关节炎药物中的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为铁皮石斛多糖与缓冲剂、甜味剂、防腐剂多种成分组成的注射液制剂。

6.根据权利要求5所述的所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物优选为铁皮石斛多糖、柠檬酸、苯甲酸钠溶于注射用水中。

7.根据权利要求6所述的所述的药物组合物，其特征在于，所述注射用水为生理盐水或磷酸盐缓冲液PBS。