KR101632369B1 - 센텔라 아시아티카로부터 고순도 아시아티코사이드 조성물의 제조 방법 및 그 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 센텔라 아시아티카로부터 유래하는 적어도 99% 순도의 상업적으로 이용가능한 아시아티코사이드 조성물과 그 제조 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 궤양성 대장염, 크론병 및 치질, 치열, 누공과 같은 염증성 장 질환의 관련 합병증과 같은 염증성 장 질환의 치료를 위해 아시아티코사이드의 치료적 유효량을 경구 투여하는 방법 및 모델을 교시한다. 본 발명은 또한 헬리코박터 파일로리의 치료를 위해 치료적 유효량의 아시아티코사이드 조성물을 경구 투여하는 방법 및 모델을 제공한다. 본 발명은 또한 결장암, 위장 질환 및 위암종의 예방을 위해 아시아티코사이드 조성물의 치료적 유효량을 경구 투여하는 방법 및 모델을 제공한다.

Description

센텔라 아시아티카로부터 고순도 아시아티코사이드 조성물의 제조 방법 및 그 사용 방법{A METHOD FOR PREPARATION OF HIGHLY PURE ASIATICOSIDE COMPOSITION FROM CENTELLA ASIATICA AND A METHOD OF USE THEREOF}

본 발명은 센텔라 아시아티카로부터의 아시아티코사이드 추출물에 관한 것이며, 더 구체적으로는 염증성 장질환의 관리, 헬리코박터 파일로리의 치료, 위장 질환 및 위 암종의 예방에 대한 그 용도에 관한 것이다.

센텔라 아시아티카로부터의 추출된 아시아티코사이드는 HPLC에 의한 순도 92.8%의 아시아티코사이드를 제공하는 Yick-Vic Company, HPLC에 의한 순도 약 97%의 아시아티코사이드를 제공하는 Tauto Biotech Company, 98%를 넘는 아시아티코사이드를 제공하는 Baoji herbest Biothech Company 등에 의해 시판되는 분석 기준 물질이다. 그러나, 이들 제품은 연구소의 연구 목적용 기준 물질로서 사용되도록 특별하게 맞추어진 것이며, 식물 센텔라 아시아티카의 추출물이 아니다. 이들 아시아티코사이드 제품은 상업적으로 약학 조성물로서 사용 가능하지 않다.

종래 기술에서 센텔라 아시아티카로부터의 아시아티코사이드 제조를 위한 방법은 50% - 97% 범위의 순도를 보장한다. 예를 들면, 미국 특허 공개 제 2008/0194499호는 15 - 50% 범위의 아시아티코사이드 조성물을 포함하는 약학적 펜타시클릭 테르페노이드 글리코사이드를 교시한다. 또한, 미국 특허 공개 제 2006/0177516호는 약 40%의 아시아티코사이드 조성물을 갖는 테르펜 혼합물을 개시한다. 더욱이 미국 특허 6,417,349호는 97% 이상의 추출물로 구성되는 4:6 내지 6:4 범위를 갖는 센텔라 아시아티카 추출물을 제공한다. 또한 중국 특허 CN 0520824호는 순도 92.8%의 아시아티코사이드의 추출 및 분리 방법을 개시한다. 그러나 이들 종래 기술은 센텔라 아시아티카로부터 고순도의 배타적인 추출을 시도하지 않는다.

센텔라 아시아티카 또는 아시아티코사이드의 전통적인 용도는 상처 치료 촉진, 피부 질환 치료, 피부 이상 및 만성 염증성 질환의 치료를 포함한다. 예를 들면 중극 특허 CN 101129393호는 상처 치료에서의 아시아티코사이드 액의 용도에 대해 개시한다. 또한, 미국 특허 공개 2009/0060985호는 피부 이상의 치료에 대한 약물 재료로서 센텔라 아시아티카 어반 추출물의 용도에 대해 교시한다. 아시아티코사이드 또는 센텔라 아시아티카를 비전통적인 용도로 사용하는 몇 차례의 시도가 종래 있었다. 예를 들면 미국 특허 공개 2008/019449호는 우울증 관리에 대한 테르페노이드 글리코사이드, 바람직하게는 선택적으로 부형제와 함께 사용되는 아시아티코사이드 및 마데카소사이드의 용도를 교시한다. 또한 미국 특허 공개 2006/0177516호는 아시아티코사이드의 빈혈 치료로서의 용도를 나타내는 식품 보충제를 제공한다.

그러나 염증성 장 질환 및 헬리코박터 파일로리와 같은 위장관 관련 질병의 치료에 대한 아시아티코사이드 또는 센텔라 아시아티카의 용도에 대해서는 상대적으로 알려져 있지 않다. 이 기술 분야에서 아시아티코사이드가 간 질환의 치료에 사용되는 몇 가지 시도가 알려져 있다. 중국 특허 CN 1439376호 및 1520824호는 간 섬유화의 예방 및 치료에 대한 아시아티코사이드의 용도를 개시한다. 또한 미국 특허 공개 2004/0097463호는 간, 결장 및 췌장과 관련된 암의 치료에 대한 아시아티코사이드의 용도를 개시한다. 또한, Cheng et al., 2004, ("The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats" Life Sciences, vol. 74, pp. 2237-2249)는 래트에서 아세트산 유발된 위 궤양에 대한 센텔라 아시아티카 물 추출물의 치료 효과에 대해 논의하고 있다. 또한, Cheng et al., 2000 ("Effects of Centella asiatica on ethanol induced gastric mucosal lesions in rats", Life Sciences, vol. 67, pp. 2647-2653)은 에탄올 유발된 위점막 병변의 탈체 (ex-vivo) 실험에서 센텔라 아시아티카의 물 추출물의 예방 효과를 교시한다. 그러나, 종래 기술에서 언급된 위 궤양은 화학적으로 또는 약물 유발된 궤양 모델에 한정된다. 더욱이, 이들 모델에서는 특정하게 위에서 자극 (아세트산)의 국부 적용에 의해 병변을 만드는데 이것은 반드시 염증성 장 질환과 같은 결장 질환과 관련되는 것은 아니다. 더욱이, 종래 기술의 아시아티코사이드 제품은 궤양의 치료에 관한 것이지만, 궤양의 예방에 대한 아시아티코사이드의 용도를 특정하지는 못하고 있다.

염증성 장 질환은 궤양성 대장염, 크론병과 같은 치료가 곤란한 만성적 염증 질환을 특징으로 하며, 이들은 복부 통증, 설사, 구토, 혈변 배설 (대변 내 혈액), 식욕 감퇴, 체중 감소, 발열을 포함하는 고통스러운 증상과 예를 들면 혈변(fissures), 누공 (fistulas), 변실금(perirectal abscess), 치질과 같은 다양한 관련된 합병증을 나타낸다. 궤양성 대장염 및 크론병은 통상 질환 활동성 지표 (disease activity index)에 의해 평가되며, 질환 활동성 지표는 대변 빈도, 대변 내 혈액의 존재, 내시경적 외관 및 의사에 의한 전반적인 평가를 포함한다. 상기 질환의 지속은 만성 염증을 초래하고, 이어서 결장암 발병의 원인 요소가 된다. 염증성 장 질환의 현재의 치료 방법은 복부 통증, 설사, 피로, 빈혈, 영양 결핍, 점막 염증, 장외 증상, 입원, 수술 및 농양, 누공, 감염 및 악성 종양과 같은 합병증의 감소를 포함한다.

염증성 장 질환의 치료는 설파살라진, 면역 억제제 및 코르티코스테로이드의 경구 투여를 포함한다. 통상, 설파살라진은 경증 내지 중간 정도의 궤양성 대장염 및 크론병 치료의 바람직한 일차 약제이다. 그러나, 약물 불내성, 손상된 엽산 흡수, 신장에 대한 역효과와 같은 부작용들로 인해 설파살라진은 염증성 장 질환의 치료에 바람직하지 않다. 또한, 결장에서 설파살라진의 이용가능성은 위에서의 흡수와 뒤이은 소변으로의 배출로 인해 제한된다. 급성 질환의 경우 궤양성 대장염 및 크론병은 코르티코스테로이드에 의한 치료를 요하지만, 이들 약물은 관해 (remission)을 예방할 수 없다. 코르티코스테로이드의 장기간의 사용은 피부의 얇아짐, 열상에 대한 민감도, 체중 증가, 혈압 상승, 당뇨 및 관련 역효과와 관련이 있다. 면역억제제는 궤양성 대장염 및 크론병의 장기간의 치료에 효과적이다. 이들 약물은 또한 골수 억제, 림프종 (신장 이식 환자의 경우), 피부 및 췌장암과 같은 심각한 역작용을 갖는다. 중증인 경우 염증성 장 질환은 장 절제, 협착 성형술 또는 일시적 또는 영구적 결장 조루술 또는 회장루 (ileostomy)과 같은 수술을 필요로 하는데, 이들은 전신 마취의 사용과 수술 후 회복의 합병증과 관련된다. 점막 손상에 의한 위장관 궤양은 염증성 장질환의 복합 합병증이다. 염증성 장 질환 및 관련된 염증 질환의 만성적 상태는 장기간의 치료를 필요로 한다. 염증성 장 질환의 현재의 치료 방법은 지속적 치료에 의한 역효과 및 질병 관해의 고위험이라는 한계를 갖는다.

헬리코박터 파일로리와 같은 병원성 박테리아에 의해 유발되는 염증은 염증성 장질환 증상의 악화를 촉진시킨다. 더욱이 스트레스, 음식 및 알콜 섭취와 같은 환경 요인은 헬리코박터 파일로리의 활동성을 강화시킨다. 세계보건기구(WHO)는 헬리코박터 파일로리를 위 암종을 증진시키는 그룹-Ⅰ발암물질로 분류하였다. 헬리코박터 파일로리 감염은 상피 세포를 손상시키는 만성 염증성 반응을 촉발시키며, 이것은 결국 위암종을 초래하는 위선 위축 (gastric atrophy)을 유발한다. 위 암종 또는 위암의 치료는 예를 들면 위 절제에 의한 암 조직의 수술 제거, 위의 부분/전체 제거, 방사선 및 화학 방사선과 같은 매우 치명적인 치료 방법을 포함한다. 그러나 이들 치료는 환자의 삶의 질을 저하시키는 큰 부작용을 갖는다. 또한 이들 치료는 암종의 재발 위험이 높기 때문에 완전한 회복을 보장하지 못한다. 감염된 위 점막으로부터 헬리코박터 파일로리의 시의적절한 진단 및 근절 (eradication)을 위한 치료는 위암의 위험을 크게 감소시킬 수 있다. 사용자는 헬리코박터 파일로리 감염에 의해 유발되는 위암종의 예방을 간접적으로 도울 수 있는 헬리코박터 파일로리 감염 제거의 효과적인 수단을 필요로 할 수 있다.

센텔라 아시아티카로부터의 아시아티코사이드의 추출을 위한 상업적으로 이용가능한 방법은 약학적 조성물로서 유효하게 사용될 정도로 매우 고순도일 것을 요구한다. 아시아티코사이드 조성물은 또한 헬리코박터 파일로리와 함께 염증성 장질환의 장기간의 치료에 유효한 보다 유익하고 유연한 방법을 제공하기 위해 필요하다. 아시아티코사이드 조성물은 또한 염증성 장 질환에 의해 유발되는 위장 질환 및 결장암의 예방을 위해 필요하다. 아시아티코사이드 조성물은 또한 위암종을 예방하는 헬리코박터 파일로리 감염의 효과적인 근절을 위해 필요하다.

본 발명의 주된 목적은 적어도 99% 순도를 갖는 센텔라 아시아티카로부터 유래하는 아시아티코사이드의 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 궤양성 대장염, 크론병과 같은 염증성 장질환의 치료를 위한, 수용가능한 약학적 부형제를 선택적으로 수반하는 아시아티코사이드의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비제한적으로 치질 및 치열 (anal fissure), 누공과 같은 염증성 장 질환의 관련 합병증의 치료를 위한, 수용가능한 약학적 부형제를 선택적으로 수반하는 아시아티코사이드의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 결장암을 예방하기 위한, 수용가능한 약학적 부형제를 선택적으로 수반하는 아시아티코사이드의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 수용가능한 약학적 부형제를 선택적으로 수반하는 아시아티코사이드의 약학적 조성물을 헬리코박터 파일로리의 치료를 위해 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 수용가능한 약학적 부형제를 선택적으로 수반하는 아시아티코사이드의 약학적 조성물을 위 질환 및 위암종의 예방을 위해 사용하는 것이다.

본 발명은 적어도 99%의 순도를 갖는 식물 재료 센텔라 아시아티카로부터 추출된 상업적으로 이용가능한 의약 등급의 아시아티코사이드 조성물을 개시한다.

본 발명은 인간과 동물의 생체 내 치료방법을 제공하며, 상기 치료 방법은 염증성 장 질환의 치료, 치질, 치열 및 누공의 치료, 결장 궤양 및 결장암의 예방, 헬리코박터 파일로리 근절 치료, 위 질환 예방 및 위암종 예방을 위해 사용되는 아시아티코사이드 조성물의 경구 투여를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 여기에 기재된 아시아티코사이드 화합물은 다음 구조를 갖는다.

아시아티코사이드:

본 명세서는 적어도 순도 99%의 아시아티코사이드를 얻기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

a) 아시아티코사이드의 분말 재료 물질을 제1용매로 처리하는 단계:

b) 처리된 분말 재료를 제2용매로 추출하여 추출물 또는 여과액을 얻는 단계:

c) 증류 및 제3용매에 추출물 또는 여과물을 녹여서 용액을 얻는 단계:

d) 상기 용액을 흡수재를 통과시키고 알콜 용매로 용출시켜 용매 용출물을 얻는 단계:

e) 용매 용출물을 진공 농축하여 아시아티코사이드 분말을 얻는 단계: 및

f) 상기 분말을 알콜에 용해시키고 결정화하여 적어도 순도 99%의 아시아티코사이드를 얻는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 약학적으로 수용가능한 부형체(들)과 함께 적어도 순도 99%의 아시아티코사이드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

a) 아시아티코사이드의 분말 재료 물질을 제1용매로 처리하는 단계:

b) 처리된 분말 재료를 제2용매로 추출하여 추출물 또는 여과물을 얻는 단계:

c) 증류 및 제3용매에 추출물 또는 여과물을 녹여서 용액을 얻는 단계:

d) 상기 용액을 흡수재를 통과시키고 알콜 용매로 용출시켜 용매 용출물을 얻는 단계:

e) 용매 용출물을 진공 농축하여 아시아티코사이드 분말을 얻는 단계:

f) 상기 분말을 알콜에 용해시키고 결정화하여 아시아티코사이드를 얻는 단계: 및

g) 아시아티코사이드에 약학적으로 수용가능한 부형제를 부가하여 적어도 순도 99%의 아시아티코사이드를 포함하는 약학 조성물을 얻은 단계를 포함한다.

본 명세서의 실시 형태에서, 아시아티코사이드의 재료 물질은 식물과 동물을 포함하는 군에서 선택된다.

본 명세서의 다른 실시 형태에서, 식물 재료는 센텔라 아시아티카이다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 추출은 약 8시간 내지 24시간의 시간 동안 약 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행된다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 제1용매는 지방족 화합물, 케톤, 알콜, 니트릴, 에스테르, 에테르 또는 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택되고, 바람직하게는 석유 에테르 또는 메틸 이소부틸 케톤이다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 제2용매는 메틸 알콜, 에틸 알콜, 프로필알콜, 이소프로필 알콜 및 부틸알콜을 포함하는 군에서 선택된 지방족 알콜 단독 또는 약 60 내지 약 99% 범위의 비율로 물과 조합된 것이다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 추출물은 순수에 용해된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 제3용매는 헥산, 메틸 이소부틸 케톤 및 석유 에테르 또는 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 흡수재는 수지 베드 (resin bed)이다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 알콜 용매는 메탄올 및 이소프로필 알콜로 또는 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택되며, C-1 내지 C-4 범위의 탄소원자를 갖는다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 상기 진공 농축은 약 50 내지 65℃ 범위의 온도에서 수행된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 수성 알콜은 에틸 알콜, 메틸 알콜, 이소프로필 알콜 및 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 결정화는 약 -15 내지 0℃ 범위의 온도에서 수행된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 조성물은 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 오일 서스펜션, 연고, 패치, 젤, 로션, 치약 (dentifrice), 캡슐, 에멀전, 크림, 스프레이, 드롭, 분산성 분말 또는 과립, 경질 또는 연질 젤 캡슐 내의 에멀전, 시럽, 일릭서, 파이토슈티칼 (phytoceutical), 뉴트라슈티칼 (nutraceutical) 및 식품재 또는 그들의 조합으로 제제화된다.

본 명세서는 또한 염증성 장 질환, 치질, 치열, 누공, 위 질환, 위암 및 헬리코박터 파일로리 감염 근절 및 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 질병의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상에게 아시아티코사이드의 투여량을 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서는 또한 결장암, 위장 질환, 위암종 및 약물의 궤양 형성에 대한 영향 또는 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택된 질병의 예방 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상에게 아시아티코사이드의 투여량을 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서의 실시 형태에서, 약학적으로 수용가능한 부형제는 과립화제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 감미제, 활택제, 부착방지제, 정전기방지제, 계면활성제, 산화방지제, 검, 코팅제, 착색제, 향미제, 가소제, 방부제, 현탁제, 유화제 및 구형화제 (spheronization agent) 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 대상은 인간을 포함하는 동물이다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서, 조성물은 약 1mg/kg 내지 약 360mg/kg 범위의 복용량으로 동물에 투여된다.

본 명세서의 또 다른 실시 형태에서 조성물은 약 1mg/kg 내지 약 60mg/kg 범위의 복용량으로 인간에게 투여된다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 99%의 순도를 갖는 아시아티코사이드의 고순도 조성물과 그 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 아시아티코사이드는 분자식 C₄₈H₇₈O₁₉ 을 갖는다. 바람직한 실시 형태 중 하나에서 아시아티코사이드는 식물 재료 센텔라 아시아티카로부터 얻지만, 본 발명의 다른 실시 형태에서 아시아티코사이드는 동물 재료로부터도 얻을 수 있다.

특히, 본 발명은 아시아티코사이드를 99% 이상 갖는 조성물의 제조 방법 또는 공정을 제공하는데, 상기 공정은:

a) 식물 재료인 센텔라 아시아티카를 분말화하는 단계;

b) 분말 재료를 제1용매로 처리하여 지방 성분, 클로로필 및 다른 착색제를 제거하는 단계;

c) 제2용매를 사용하여 생물 활성 분자를 추출하는 단계;

d) 추출물을 증류하여 용매를 제거하고 페이스트를 형성하는 단계;

e) 증류된 페이스트를 제3용매에 용해하여 용액을 얻는 단계;

f) 제3용매로 추출하여 산성 불순물을 제거하는 단계;

g) 정제된 추출물을 흡수재를 통과시켜 맑은 용액을 얻는 단계;

h) 알콜 용매로 수지 베드를 용출시켜 용매 용출액을 얻는 단계;

i) 용매 용출액을 진공 농축하여 분말을 얻는 단계; 및

j) 분말을 수성 알콜에 녹이고 결정화하여 적어도 HPLC 순도 99%를 갖는 아시아티코사이드 조성물을 얻는 단계를 포함한다.

99% 이상의 아시아티코사이드 조성물의 제조 방법 또는 공정의 상세한 내용은 이하에 설명된다.

본 발명에 의하면, 줄기를 포함하는 센텔라 아시아티카의 마른 잎은 40 메쉬 크기로 분말화된다. 분말화된 재료는 여과포를 구비한 용기의 상부와 저부에 다공판을 갖는 추출기 내에 채워진다.

다음 단계에서, 제1용매는 20 내지 30℃ 범위의 온도, 가장 바람직하게는 30℃에서, 8 시간 내지 24시간 동안, 가장 바람직하게는 12시간 동안 역류 방식으로 추출기 내에서 회전된다. 바람직한 실시 형태에서, 사용된 제1용매는 60 내지 80℃의 비등 범위를 갖는 석유 에테르이다. 그러나, 본 발명의 다른 실시 형태에서 제1용매는 지방족 화합물, 케톤, 알콜, 니트릴, 에스테르, 에테르 및 이들의 하나 이상의 혼합물을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 다음 단계에서, 클로로필 및 다른 리피드들이 추출물로부터 제거되고, 덩어리는 용매 제거 상태로 건조된다.

다음 단계에서, 건조된 덩어리는 제2용매를 사용하여 역류 방식으로 추출된다. 이 바람직한 실시 형태에서 제2용매는 직쇄 또는 분지쇄 알콜인 탄소원자 1 내지 4개를 갖는 지방족 알콜의 조합으로서 물과 함께 또는 물 없이 사용된다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 제2용매는 메틸 알콜, 에틸 알콜, 프로필 알콜, 이소프로필 알콜, 부틸 알콜로부터 선택될 수 있으며, 단독으로 사용되거나 60% 내지 99% 범위의 비율로 물과 함께 사용된다.

다음 단계에서 맑은 추출물을 감압 하에 증류하여 용매를 증발시키고 페이스트를 형성한다. 다음 단계에서, 상기 페이스트를 순수에 용해하고 불용물을 여과한다. 다음 단계에서, 맑은 수층을 반복 추출하고 제3용매로 세척하여 산성 물질을 제거하고 맑은 수성 추출물을 얻는다. 이 바람직한 실시 형태에서 제3용매는 메틸 이소부틸 케톤이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시 형태에서 상기 용매는 헥산 및 석유 에테르를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.

다음 단계에서, 맑은 수성 추출층이 흡수재급 수지 베드를 통과하도록 하고 5 부피 또는 바람직하게는 8 부피의 탈이온수로 세척하여 모든 염료와 불순물을 베드로부터 제거한다.

다음 단계에서, 상기 물 세척된 베드를 탄소원자 C-1 내지 C-4를 갖는 알콜 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 이소프로필 알콜 또는 상기 알콜의 혼합물로 용출한다. 용출된 용매를 수집하고 상기 베드를 반복 세척하여 모든 센텔로사포닌을 베드에서 제거한다.

다음 단계에서, 용매 용출물을 바람직하게는 50 내지 65℃의 저온에서 진공 하에 분말로 농축한다. 상기 분말을 수성 알콜에 재용해하여 용액을 형성한다. 이 바람직한 실시 형태에서 사용된 수성 알콜은 메틸 알콜이다. 그러나, 수성 알콜은 에틸 알콜, 프로필 알콜 또는 이소프로필 알콜로부터 선택될 수 있고, 단독으로 또는 알콜의 50 내지 99% 범위의 비율로 물과 조합하여 사용할 수 있다.

다음 단계에서, 상기 용액을 0℃ 미만, 바람직하게는 -15℃ 이하로 냉각하여 아시아티코사이드를 결정화한다. 다음 단계에서, 얻어진 순수한 아시아티코사이드 결정을 여과하고 염이 제거될 때까지 차가운 물로 세척한다. 그 다음 진공 하에 건조하여 분석을 위해 HPLC를 사용하여 순도를 분석할 수 있는 자유 유동 분말 (free flow powder)을 얻는다.

가장 바람직한 공정의 요약은 다음과 같다.

a) 줄기를 포함하는 센텔라 아시아티카의 마른 잎을 40메쉬 크기로 분말화한다.

b) 분말화된 재료를 여과포를 구비한 용기의 상부와 저부에 다공판을 갖는 추출기에 채운다.

c) 60 내지 80℃의 비등 범위를 갖는 석유 에테르를 20 내지 30℃, 바람직하게는 30℃에서 8시간 내지 24시간, 바람직하게는 12시간 동안 역류 방식으로 순환시킨다.

d) 얻어진 클로로필 및 다른 리피드들로 이루어진 추출물을 제거하고, 덩어리를 용매가 없이 건조시킨다.

e) 건조된 덩어리를, 직쇄 및 분지쇄 알콜인 탄소원자 1 내지 4개를 갖는 지방족 알콜 용매의 조합을, 물과 함께 또는 단독으로 사용하여 역류 방식으로 다시 추출한다. 상기 알콜은 단독 또는 알콜의 60 내지 99% 범위의 비율로 물과 함께 사용되는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 알콜일 수 있다.

f) 맑은 추출물을 감압 하에 증류하여 용매를 증발시킴으로써 페이스트를 만든다.

g) 상기 페이스트를 순수에 용해시키고 메틸 이소부틸 케톤으로 반복 세척한다.

h) 맑은 수 추출물을 흡수재 등급 수지 베드를 통과시키고 5 부피 또는 더욱 바람직하게는 8 부피의 탈이온화수로 세정하여 모든 염료 및 불순물을 세거한다.

i) 물로 세척한 베드를 탄소원자 C-1 내지 C-4를 가지는 알콜 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 이소프로필 알콜 또는 상기 알콜의 혼합물로 용출한다.

j) 용출된 용매를 수집하고 상기 베드를 반복 세척하여 베드에서 모든 센텔로사포닌을 제거한다.

k) 용매 용출물을 바람직하게는 50 내지 65℃의 저온에서 감압 하에 분말로 농축한다.

l) 상기 분말을 수용성 알콜에 재용해시키며, 사용된 알콜은 에틸, 메틸, 프로필 또는 이소프로필 단독 또는 알콜의 50 내지 99% 범위의 물과 함께 사용된다. 그리고 0℃ 미만, 바람직하게는 -15℃ 이하로 냉각하여 아시아티코사이드를 결정화한다.

m) 형성된 순수한 아시아티코사이드를 여과하고 염이 제거될 때까지 차가운 물로 세정하고, 진공 하에 건조하여 자유 유동 분말을 얻는다.

n) 분리된 재료를 HPLC를 사용하여 다음 방식으로 그 순도 및 불순물을 분석한다.

분석을 위한 HPLC 방법은 다음과 같다.

본 발명의 다른 실시 형태에서, 아시아티코사이드 조성물은 선택적으로, 과립화제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 감미제, 활택제, 부착방지제, 정전기방지제, 계면활성제, 산화방지제, 검, 코팅제, 착색제, 향미제, 코팅제, 가소제, 방부제, 현탁제, 유화제 및 구형화제 (spheronization agent)의 군으로 비제한적으로 선택되는 약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 아시아티코사이드 조성물은 예를 들면 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 오일 서스펜션, 연고, 패치, 젤, 로션, 치약, 캡슐, 에멀전, 크림, 스프레이, 드롭, 분산가능한 분말 또는 과립, 경질 또는 연질 젤 캡슐 내의 에멀전, 시럽, 일릭서, 피토슈틸칼 (phytoceuticals), 뉴트라슈티칼 (nutraceuticals) 및 식재료로부터 선택되는 다양한 투여 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 다른 실시의 형태에서, 조성물은 분말 또는 액체일 수 있으며, 최소한의 부작용을 갖고, 상기 조성물은 동물에 대해 1 - 360 mg/kg의 범위로 투여되고, 인간에 대해 1 - 60 mg/kg의 범위로 투여된다. 상기 아시아티코사이드 조성물은 병소의 치료에 효과적인 치료적 또는 예방적 복용으로서 투여된다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 부가적으로 궤양성 대장염 (이하, UC), 크론병 (이하, CD) 및 치질, 치열, 누공의 관련 부작용과 같은 염증성 장 질환 (이하 IBD)의 생체 내 치료 및 상기 질환에 의해 유발되는 결장암의 생체 내 예방 방법을 제공한다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 또한 헬리코박터 파일로리 (이하, H.Pylori)의 생체 내 치료 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 NSAID 유발된 궤양에서 H.Pylori 근절의 생체 내 방법을 제공한다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 또한 위장 질환 및 위장 암종의 예방 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 맥락에서, 항염증 활성을 확인하기 위해 수행된 시험, 치료 활성, 사용 방법 및 아시아티코사이드 조성물 (이하에서 시험 약물)의 확립된 작용 방식이 이하에서 상세하게 설명된다.

a) 약동학 연구에서 시험 약물이 투여되고, 혈액에서의 생체이용가능성 및 소변 및 대변으로 분비가 분석되었다. 아시아티코사이드는 혈액으로 흡수되지 않고, 변하지 않은 형태로 대변으로 완전하게 배출되는 것이 관찰되었다. 시험 약물의 이와 같은 특성으로 인해 IBD 및 관련 질병의 치료에 대해 추가 연구가 행해졌다.

b) 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 유발된 IBD 모델에서, TNBS 투여 후 10일 동안 치료 후 시험 약물은 결장 중량 및 결장 중량/길이 비율을 상당히 감소시켰다. 또한, 증가된 체중, 감소된 궤양 지수 및 결장에서의 미엘로페록시다제 (myeloperoxidase) 활성 감소가 보였다. 또한, 시험 약물 투여 3일 후 직장 출혈도 상당히 감소했다.

c) 아세트산 유발된 IBD 모델에서, 투여 10일 후 시험 약물은 결장 무게, 결장 길이, 결장 폭, 결장 무게/길이 비율 및 결장의 거시적 지수를 상당히 감소시켰다. 시험 약물은 또한 감소된 궤양 지수 및 미엘로페록시다제 활성에서의 상당한 감소를 나타냈다.

d) 비스테로이드성 항염증 약물 (non steroidal anti inflammatory drug, 이하 NSAID) 유발된 궤양을 갖는 H. Pylori 감염 래트의 인-비보 모델이 시험 약물의 잠재적인 항-H. Pylori 및 항궤양 활성에 대해 시험되었다. 시험 약물은 H. Pylori 감염의 완전한 근절과 함께 궤양 면적에서 복용량 의존 및 시간 의존적 감소를 나타냈다.

e) 스트레스 유발된 궤양 모델에서, 히스타민이 래트에 투여되어 궤양성 질병을 유발하였다. 시험 약물로 동물을 미리 처리함으로써 스트레스 유발된 궤양의 예방에서의 시험 약물의 효과를 확인하였다. 시험 약물은 히스타민 유발된 궤양의 예방에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

f) 알콜 유발된 궤양 모델에서, 에탄올이 시험 약물로 미리 처리된 래트에 투여되어 궤양성 질환을 유발하였다. 시험 약물은 에탄올 유발된 궤양에 대해 예방 효과를 나타냈다.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

실시예-1

10kg의 센텔라 아시아티카 잎을 해머밀을 사용하여 40메쉬 크기로 분말화하였다. 분말화된 재료는 30℃에서 8시간 동안 고정 베드 역류 추출기 내에서 50리터의 석유 에테르로 반복적으로 추출되었다. 클로로필과 지방이 제거된 추출된 덩어리는 베드 내에서 순환류에 의해 건조되었다. 건조된 덩어리는 30℃에서 8시간 동안 75리터의 이소프로필 알콜로 추출되었다. 추출 후의 맑은 추출물을 진공 하에 농축하여 페이스트를 얻었다. 페이스트를 25리터의 순수에 녹이고 여과하여 불용물을 제거하였다. 맑은 수층을 반복하여 추출하고 메틸 이소부틸 케톤으로 세정하여 모든 산성 물질을 제거하였다. 이 조작은 TLC를 사용하여 산성 성분의 부재에 대해 모니터되었고, TLC 이동상은 n-부탄올:에틸 아세테이트: 물의 4:1:5의 혼합물의 최상층으로 이루어진다. 맑은 층을 Amberlite ^®XAD-4 250 ml를 함유하는 수직 컬럼을 갖는 흡수재 크로파토그래피 컬럼을 통과시키고 물로 세정하여 모든 흡수 안료 및 입자를 제거하였다. 이후에 용출 사이클을 수행하였으며, 여기서 컬럼을 메틸 알콜로 용출하고 용매 용출물을 진공 하에 농축하여 500 gms 분말을 얻었다. 이 분말을 80%의 메틸 알콜 및 20%의 물을 포함하는 수성 알콜 2500 ml에 녹여서 맑은 용액을 얻었다. 이 용액을 -15℃로 냉각하여 아시아티코사이드 결정을 얻었다. 덩어리를 여과하고 물로 세정하고 80℃에서 건조하였다. HPLC 순도 99.6%를 갖는 아시아티코사이드 158 gms를 얻었다.

실시예-2

10kg의 센텔라 아시아티카 잎을 해머 밀을 사용하여 40메쉬 크기로 분말화하였다. 분말화된 재료를 30℃에서 8시간 동안 고정베드 역류 추출기에서 50리터의 석유 에테르로 반복하여 추출하였다. 추출된 클로로필과 지방이 제거된 덩어리를 베드 내에서 순환류에 의해 건조시켰다. 건조된 덩어리를 30℃에서 8시간 동안 80%의 수성 에틸 알콜 75리터로 추출하였다. 추출 후 맑은 여과물을 진공 하에 농축하여 페이스트를 얻었다. 이 페이스트를 순수 25리터에 용해시키고 여과하여 불용물을 제거하였다. 맑은 수층을 반복 추출하고 메틸 이소부틸 케톤으로 세정하여 모든 산성 물질을 제거하였다. 이 조작은 TLC를 사용하여 산성 성분의 부재에 대해 모니터되었으며, 여기서 TLC 이동상은 n-부탄올:에틸 아세테이트: 물의 4:1:5 비율의 혼합물의 최상층으로 이루어졌다. 맑은 층을 Amberlite ^®XAD-4 250 ml를 함유하는 수직 컬럼을 갖는 흡수재 크로파토그래피 컬럼을 통과시키고 물로 세정하여 모든 흡수 안료 및 입자를 제거하였다. 이후에 용출 사이클을 수행하였으며, 여기서 컬럼을 메틸 알콜로 용출하고 용매 용출물을 진공 하에 농축하여 500 gms 분말을 얻었다. 이 분말을 80%의 메틸 알콜 및 20%의 물을 포함하는 수성 알콜 2500 ml에 녹여서 맑은 용액을 얻었다. 이 용액을 -15℃로 냉각하여 아시아티코사이드 결정을 얻었다. 덩어리를 여과하고 물로 세정하고 80℃에서 건조하였다. HPLC 순도 99.2%를 갖는 아시아티코사이드 150 gms를 얻었다.

실시예-3

10kg의 센텔라 아시아티카 잎을 해머 밀을 사용하여 40메쉬 크기로 분말화하였다. 분말화된 재료를 30℃에서 8시간 동안 고정 베드 역류 추출기에서 50리터의 석유 에테르로 반복하여 추출하였다. 추출된 클로로필과 지방이 제거된 덩어리를 베드 내에서 순환류에 의해 건조시켰다. 건조된 덩어리를 30℃에서 8시간 동안 메틸 알콜 75리터로 추출하였다. 추출 후 맑은 여과물을 진공 하에 농축하여 페이스트를 얻었다. 이 페이스트를 순수 25리터에 용해시키고 여과하여 불용물을 제거하였다. 맑은 수층을 반복 추출하고 메틸 이소부틸 케톤으로 세정하여 모든 산성 물질을 제거하였다. 산 성분의 부재를 위한 조작은 TLC를 사용하여 모니터되었다. 맑은 층을 Amberlite ^®XAD-4 250 ml를 함유하는 수직 컬럼을 갖는 흡수재 크로파토그래피 컬럼을 통과시키고 물로 세정하여 모든 흡수 안료 및 입자를 제거하였다. 이후에 용출 사이클을 수행하였으며, 여기서 컬럼을 메틸 알콜로 용출하고 용매 용출물을 진공 하에 농축하여 500 gms 분말을 얻었다. 이 분말을 80%의 메틸 알콜 및 20%의 물을 포함하는 수성 알콜 2500 ml에 녹여서 맑은 용액을 얻었다. 이 용액을 -15℃로 냉각하여 아시아티코사이드 결정을 얻었다. 덩어리를 여과하고 물로 세정하고 80℃에서 건조하였다. HPLC 순도 99.8%를 갖는 아시아티코사이드 145 gms를 얻었다.

실시예-4

10kg의 센텔라 아시아티카 잎을 해머 밀을 사용하여 40메쉬 크기로 분말화하였다. 분말화된 재료를 30℃에서 8시간 동안 고정 베드 역류 추출기에서 50리터의 석유 에테르로 반복하여 추출하였다. 추출된 클로로필과 지방이 제거된 덩어리를 베드 내에서 순환류에 의해 건조시켰다. 건조된 덩어리를 30℃에서 8시간 동안 80% 이소프로필 알콜 및 20% 물을 함유하는 이소프로필 알콜 75리터로 추출하였다. 추출 후 맑은 여과물을 진공 하에 농축하여 페이스트를 얻었다. 이 페이스트를 순수 25리터에 용해시키고 여과하여 불용물을 제거하였다. 맑은 수층을 반복 추출하고 메틸 이소부틸 케톤으로 세정하여 모든 산성 물질을 제거하였다. 이 조작은 TLC를 사용하여 산성 성분의 부재에 대해 모니터되다. 맑은 층을 Amberlite ^®XAD-4 250 ml를 함유하는 수직 컬럼을 갖는 흡수재 크로파토그래피 컬럼을 통과시키고 물로 세정하여 모든 흡수 안료 및 입자를 제거하였다. 이후에 용출 사이클을 수행하였으며, 여기서 컬럼을 메틸 알콜로 용출하고 용매 용출물을 진공 하에 농축하여 500 gms 분말을 얻었다. 이 분말을 80%의 메틸 알콜 및 20%의 물을 포함하는 수성 알콜 2500 ml에 녹여서 맑은 용액을 얻었다. 이 용액을 -15℃로 냉각하여 아시아티코사이드 결정을 얻었다. 덩어리를 여과하고 물로 세정하고 80℃에서 건조하였다. HPLC 순도 99.6%를 갖는 아시아티코사이드 158 gms를 얻었다.

실시예-5

10kg의 센텔라 아시아티카 잎을 해머 밀을 사용하여 40메쉬 크기로 분말화하였다. 분말화된 재료를 30℃에서 8시간 동안 고정 베드 역류 추출기에서 50리터의 석유 에테르로 반복하여 추출하였다. 추출된 클로로필과 지방이 제거된 덩어리를 베드 내에서 순환류에 의해 건조시켰다. 건조된 덩어리를 30℃에서 8시간 동안 30%의 물을 함유하는 70% 이소프로필 알콜 75리터로 추출하였다. 추출 후 맑은 여과물을 진공 하에 농축하여 페이스트를 얻었다. 이 페이스트를 순수 25리터에 용해시키고 여과하여 불용물을 제거하였다. 맑은 수층을 반복 추출하고 메틸 이소부틸 케톤으로 세정하여 모든 산성 물질을 제거하였다. 이 조작은 TLC를 사용하여 산성 성분의 부재에 대해 모니터되다. 맑은 층을 Amberlite ^®XAD-4 250 ml를 함유하는 수직 컬럼을 갖는 흡수재 크로파토그래피 컬럼을 통과시키고 물로 세정하여 모든 흡수 안료 및 입자를 제거하였다. 이후에 용출 사이클을 수행하였으며, 여기서 컬럼을 메틸 알콜로 용출하고 용매 용출물을 진공 하에 농축하여 500 gms 분말을 얻었다. 이 분말을 80%의 메틸 알콜 및 20%의 물을 포함하는 수성 알콜 2500 ml에 녹여서 맑은 용액을 얻었다. 이 용액을 -15℃로 냉각하여 아시아티코사이드 결정을 얻었다. 덩어리를 여과하고 물로 세정하고 80℃에서 건조하였다. HPLC 순도 99.8%를 갖는 아시아티코사이드 157 gms를 얻었다.

실시예-6: 작용 위치에서 시험 약물의 이용가능성

시험 약물의 생물학적 이용가능성을 판단하기 위해 시험 약물의 약동학적 파라미터가 건강한 래트에 대해 연구되었다.

방법:이 연구에서 동물은 실험 전에 하룻밤 동안 금식시켰으며, 시험 약물 250 mg/kg을 일 회 경구 투여하였다. 혈액 샘플을 복용 후 0, 0.25, 0.50, 1, 2, 3, 4, 5 및 6시간에서 수집하였다. 4℃에서 15분 동안 7000 rpm으로 원심분리하여 혈장을 얻었고, 분석이 수행될 때까지 -20℃에서 보관하였다. 동물들은 소변과 대변의 수집을 위해 대사 케이지에 수용되었다. 혈장, 소변 및 대변에서 시험 약물을 검출하기 위해 역상 HPLC 법을 사용하였다. 소변과 대변에 의한 시험 약물의 제거는 0 - 4시간, 4 - 8시간 및 8 - 24시간에서 측정되었다.

관측: 250 mg/kg의 고복용량에서도 혈액 시스템으로의 약물 흡수는 관측되지 않았다. 이것은 소변에서 아시아티코사이드의 부재에 의해 재확인되었다. 시험 약물이 위장관을 변화하지 않은 형태로 통과하여 대변으로 완전히 배출되는 것이 관측되었다. 또한 시험 약물이 혈액으로 흡수되지 않아서 질병 부위에서 아시아티코사이드의 생체이용율을 실질적으로 증가시키는 것이 관측되었다. 이 맥락에서 수행된 실험에서, 약물의 약 81.42%가 대변에서 발견되었다. 따라서 IBD 및 관련 질환의 치료에서 시험 약물이 잠재력이 있음이 확인되었다.

실시예-7: 래트의 TNBS 유발된 대장염에서 시험 약물의 효과

트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 유발된 대장염은 IBD에 대해 사용되는 표준 동물 모델 중 하나이다. 이 모델에서, TNBS의 결장 내 단일 투여는 결장 상피를 손상시키고 지속적인 만성 염증을 유발한다. 결장의 전층 육아종성 염증 (transmural granulomatous inflammation)은 크론병에서 나타나는 조직병리학적 특징과 유사하다.

방법: 이 연구에서, 수컷 위스터 래트 (280-291 g)를 48시간 동안 금식시키고, 마취하였다. 지름 3mm의 캐뉼라를 항문 안으로 8cm 깊이로 삽입하고, 30% 에탄올 용액 0.25ml에 용해된 TNBS 25mg을 각각의 래트에 주입하였다. 래트들은 1분 동안 꼬리를 치켜든 자세로 유지되었다. 1일 후, 시험 약물을 10일 동안 하루에 한번씩 경구 투여하였다. 건강한 대조군은 소금물만을 투여받고 TNBS는 투여하지 않은 채 유지되었다. 11일 째에, 래트의 각 그룹을 경추탈구에 의해 사망시키고, 결장을 물리적 시험을 위해 분리하였다. 결장 샘플은 조직병리학적 평가를 위해 10%의 중성 포르말린 용액 내에 보존하였다.

관측: 수행된 실험에서 하루에 한 번 50 mg/kg (p.o)의 복용량으로 10일간의 시험 약물의 처치에 의해 증가된 결장 무게, 결장 무게와 길이 비율 및 미엘로페록시다제 활성과 같은 TNBS 유발된 IBD 증상이 현저하게 역전되었다. 시험 약물은 또한 미소 점수와 결정 궤양 지수에서의 감소로부터 알 수 있는 바와 같이 TNBS에 의해 형성된 병소를 치료하였다. 시험 약물에 의한 미엘로페록시다제 활성의 반전은 IBD에서 보이는 결장 병소의 치료에 대한 그 잠재성을 확인시켰다.

TNBS 유발된 IBD에 대한 시험 약물의 효과는 IBD의 치료 및 관리에서 시험 약물의 치료적 가치를 강하게 나타내었다.

실시예-8: 래트의 아세트산 유발된 대장염에 대한 시험 약물의 효과

아세트산 유발된 대장염은 인간의 급성 장염의 염증 매개물질과 유사성을 갖는 IBD 모델이다.

방법: 이 모델에서, 초기 손상은 상피 괴사 및 부종이며, 이들은 아세트산에 노출된 농도와 길이에 따라 가변적으로 점막 고유판, 점막하 조직 또는 외부 근육층에까지 확대될 수 있다. 수컷 위스터 래트 (280-291g)에 대해 대장염 유발 72시간 전부터 시작하여 시험 약물을 하루에 한 번 50 mg/kg (p.o.)의 복용량으로 투여하였다. 래트를 24시간 금식시킨 후 마취하고 지름 3mm의 캐뉼러를 깊이 8cm로 항문에 삽입하여 30초 간 직장 내로 3%의 아세트산 2ml를 주입하였다. 24시간 후, 동물들을 경추 탈구로 사망시키고, 직장을 분리하여 대장염의 파라미터들을 측정하였다.

관측: 3일간의 래트에 대한 시험 약물의 사전 치료는 아세트산 유발된 대장염 증상에 대해 상당한 역전 효과를 나타내었다. 결장 무게 및 결장 무게와 길이 비율의 증가와 같은 아세트산 유발된 증상의 역전은 대장염에 대한 시험 약물의 유리한 효과를 나타낸다. 이들 효과는 거시적 병변 지수 (macroscopic lesion score )와 결장 조직에서 미엘로페록시다제 활성의 감소에 의해 다시 확인되었다.

아세트산 유발된 대장염에 대한 시험 약물의 효과는 시험 약물의 IBD의 관리에 대한 치료적 가치를 강하게 나타낸다.

실시예-9:H. Pylori 감염된 위 질환에 대한 시험 약물의 효과

H. Pylori의 근절에 대한 시험 약물의 효과가 9주간의 지속적인 투여 후 NSAID 유발된 궤양에 대해 시험되었다. H. Pylori 감염은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 신속 요소효소 검사 (Rapid Urease Test, RUT)에 의해 모니터되어 지속적인 치료를 확인하였다.

방법: 수컷 위스터 래트 (200-230g)를 24시간 금식시키고, 3일간 연속하여 30 mg/kg (p.o.)의 복용량으로 나프록센을 투여하였다. 24시간 후, 살아있는 H.pylori (ATCC 26695, MS-5 균주 , 10⁸ CFU) 의 브루셀라 배지 용액을 연속하여 3일간 투여하였다 (1ml/동물). 1주일 후, 시험 약물을 하루에 두 번 120 mg/kg (p.o.), 또는 하루에 한 번 240 mg/kg (p.o.), 또는 하루에 한 번 360 mg/kg (p.o.) 의 복용량으로 투여하였다. 동물들은 9주간의 치료가 끝난 후 사망시켰다. 사망한 동물의 위를 분리하고, 위 점막을 소금물로 세척하고 RUT를 위해 유문을 절개하였다. 미엘로페록시다제 측정을 위해 점막이 수집되고, DNA는 PCR로 증폭되어 두 개의 비돌연변이 유전자 16S rRNA 및 hrgA를 겔 전기영동하였다.

관측: 감염 상태는 치료 4, 6 및 9주 후에 두 개의 H. pylori 유전자의 RUT 및 PCR증폭에 의해 래트의 위에서 모니터되었다. 360 mg/kg (p.o.)의 복용량에서 시험 약물은 3주 째에 신속한 항박테리아 작용을 나타냈고, 9주 째에는 H. pylori 감염을 근절하였다. 그러나, 하루에 두 번 120 mg/kg (p.o.) 또는 하루에 한 번 240 mg/kg (p.o.)의 낮은 복용량에서의 시험 약물 투여는 H. pylori 근절에 효과적이지 않았다. 시험 약물의 효과는 높은 복용량에서 H. pylori 감염 근절에서 치료적 효과를 강하게 나타내고, 또한 H. pylori 관련된 위 질환 및 위암종의 치료에 대한 치료적 잠재력에 대한 약리학적 확신을 제공한다.

실시예-10: 약물 유발된 위장 질환에 대한 시험 약물의 예방 효과

나프록센과 같은 NSAIDS 약물에 의해 유발된 위 병변은 위장관에서 염증 반응을 악화시킬 수 있다. 약물 유발된 위 병변의 예방에 대한 시험 약물의 잠재성이 나프록센 유발된 궤양의 동물 모델에서 연구되었다.

방법: 수컷 위스터 래트 (220-230g)를 30 mg/kg (p.o.), 60 mg/kg (p.o.) 또는 120 mg/kg (p.o.)의 복용량의 시험 약물로 미리 치료하고, 30 mg/kg (p.o.)의 복용량으로 나프록센을 투여하였다. 궤양의 형성과 궤양 면적이 시험 약물에 의해 미리 치료되지 않은 나프록센 대조군과 비교되었다.

관측: 시험 약물에 의한 사전 치료는 복용량 의존적 방식으로 궤양 형성을 방지하는 것이 관측되었다. 120 mg/kg 의 가장 높은 복용량이 나프록센의 궤양 형성 작용을 예방하는데 가장 효과적이라는 것이 발견되었다. 따라서 시험은 약물의 궤양 형성 작용에 대한 잠재적인 예방 효과를 나타낸다.

실시예-11: 스트레스 유발된 위장 질환에 대한 시험 약물의 예방 효과

스트레스 유발된 위 병변은 위장관에서 염증 반응의 원인이 되거나 악화시킬 수 있는 증상이다. 스트레스 유발된 위 병변의 예방에 대한 시험 약물의 잠재성이 히스타민 유발된 궤양의 동물 모델에서 연구되었다.

방법: 수컷 위스터 래트 (220-230g)를 30 mg/kg (p.o.), 60 mg/kg (p.o.) 또는 120 mg/kg (p.o.)의 복용량의 시험 약물로 사전 치료하고, 히스타민을 300 mg/kg (i.p.)의 복용량으로 투여하였다. 궤양의 형성과 궤양 면적이 시험 약물로 미리 치료받지 않은 대조군과 비교되었다.

관측: 시험 약물에 의한 사전 치료가 복용량 의존적 방식으로 궤양 형성을 예방하는 것이 관측되었다. 120 mg/kg (p.o.)의 가장 높은 복용량이 히스타민의 궤양 형성 작용을 예방하는데 가장 효과적이었다. 따라서, 시험 약물은 스트레스 유발된 궤양에 대해 잠재적인 예방 효과를 갖는다는 것이 확인되었다.

실시예-12: 래트에서 알콜 유발된 위장 질환에 대한 시험 약물의 예방 효과

알콜의 섭취는 위장 병변을 초래하는 또 다른 주된 원인이다. 따라서 동물에서 에탄올 유발된 궤양의 방지에 대한 시험 약물의 잠재성이 연구되었다.

방법: 수컷 위스터 래트를 30 mg/kg (p.o.), 60 mg/kg (p.o.) 또는 120 mg/kg (p.o.) 의 복용량의 시험 약물로 미리 처치하고, 8 ml/kg (p.o.)의 복용량으로 에탄올을 투여하였다. 궤양의 형성과 궤양 면적이 시험 약물로 미리 처리되지 않은 대조군과 비교되었다. 이 연구에서 평균 궤양 면적은 대조군에서 174.4 mm² ±5.814 mm² 로 측정되었으며, 이는 에탄올의 궤양 형성 효과를 나타낸다.

관측: 시험 약물에 의한 사전 처리가 복용량 의존적 방식으로 궤양 형성을 방지하였음이 관측되었다. 120 mg/kg (p.o.) 의 가장 높은 복용량이 에탄올의 궤양 형성 작용을 방지하는데 가장 효과적이었다. 따라서 알콜 섭취에 의해 유발되는 궤양에 대한 시험 약물의 예방 효과가 확인되었다.

실시예-13: 인간의 IBD의 치료에 대한 시험 약물의 효과

IBD 환자에 대한 시험 약물의 효과를 평가하기 위한 전향적 연구 (prospective study) 가 수행되었다.

방법: 이 연구에서, 염증성 장 질환의 만성 증상을 앓고 있는 세 명의 환자에게 6개월 동안 하루에 두 번 300mg의 복용량으로 시험 약물을 투여하였다. 그 후, 시험 약물의 효과는 연구 기간의 시작과 종료 시 얻은 환자의 보고 결과를 기초로 분석되었다.

관측: 모든 환자가 복부 통증, 설사, 직장 출혈, 발열, 메스꺼움과 구토와 같은 IBD 관련 증상의 완화를 경험하였다. 또한 화장실 방문 빈도의 감소, 설사약 의존 및 장 운동과 관련된 통증 감소로 알 수 있는 장 조절에서 유의한 개선이 관측되었다. 또한 관절 통증, 피부 질환 또는 눈 관련 합병증의 발생이 없다는 것도 관측되었다. 또한 시험 약물은 잘 수용되고 IBD 치료에서 효과를 갖는다는 것이 관측되었다.

실시예-14: 인간의 치질 치료에 대한 시험 약물의 효과

치질을 갖고 있는 환자에 대한 시험 약물의 효과를 평가하기 위한 비제어된 전향적 파일럿 연구가 수행되었다.

방법: 이 연구에서, 직장 출혈, 배변 시 통증 및 직장 염증의 만성 치질 증상을 갖는 다섯 명의 환자에게 15일 동안 하루에 두 번 300mg의 복용량으로 시험 약물을 투여하였다. 시험 약물의 효과는 연구 기간의 시작과 종료 시에 취한 환자의 보고 결과를 기초로 분석되었다.

관측: 시험 약물은 치질 및 치열의 증상에 대한 즉각적 완화를 제공하는데 효과가 있었다. 또한 모든 환자들에게서 시험 약물에 의한 치료 3일째에 직장 출혈의 완화가 관측되었다. 또한 치료 기간 종료 시에 장 운동과 관련된 고통과 염증의 유의한 완화가 관측되었다.

본 발명은 예시적인 방법으로 설명되었고, 사용된 용어는 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것이 아니라는 점이 이해되어야 한다.

기재된 정확한 형태로 발명을 제한하지 않음을 밝힌다. 많은 변형과 개조가 교시 내용에 따라 가능하다. 본 발명의 범위는 이 상세한 설명에 의해 제한되지 않으며, 여기 첨부된 특허청구범위에 의해 정해진다. 또한 다음의 청구항들은 여기 설명된 본 발명의 일반적이고 특정한 특징을 모두 포함하고자 하는 의도임이 이해되어야 한다.

Claims (13)

1. 적어도 99% (w/w) 순도의 아시아티코사이드를 얻기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
   a) 분말화된 센텔라 아시아티카 재료를 석유 에테르로 처리하는 단계;
   b) 처리된 분말화된 재료를 메틸 알콜, 에틸 알콜, 프로필 알콜, 이소프로필 알콜 및 부틸 알콜을 포함하는 군에서 선택되는 지방족 알콜 단독 또는 지방족 알콜과 물과의 조합으로 추출하여 추출물 또는 여과물을 얻는 단계;
   c) 추출물 또는 여과물을 증류하고 메틸 이소부틸 케톤에 용해시켜 용액을 얻는 단계;
   d) 용액이 레진 베드를 통과하게 하고 메탄올 및 이소프로필 알콜 또는 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 알콜 용매로 용출시켜 용매 용출액을 얻는 단계;
   e) 용매 용출액을 진공 농축하여 아시아티코사이드 분말을 얻는 단계; 및
   f) 분말을 메틸 알콜, 에틸 알콜, 프로필 알콜, 이소프로필 알콜 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알콜에 용해시키고 결정화하여 적어도 순도 99% (w/w)의 아시아티코사이드를 얻는 단계를 포함하는 것인 방법.
2. 적어도 99% (w/w) 순도의 아시아티코사이드와 약학적으로 수용가능한 부형제(들)을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
   a) 분말화된 센텔라 아시아티카 재료를 석유 에테르로 처리하는 단계;
   b) 처리된 분말화된 재료를 메틸 알콜, 에틸 알콜, 프로필 알콜, 이소프로필 알콜 및 부틸 알콜을 포함하는 군에서 선택되는 지방족 알콜 단독 또는 지방족 알콜과 물과의 조합으로 추출하여 추출물 또는 여과물을 얻는 단계;
   c) 추출물 또는 여과물을 증류하고 메틸 이소부틸 케톤에 용해시켜 용액을 얻는 단계;
   d) 용액이 레진 베드를 통과하게 하고 메탄올 및 이소프로필 알콜 또는 그들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 알콜 용매에 용출시켜 용매 용출물을 얻는 단계;
   e) 용매 용출물을 진공 농축하여 아시아티코사이드 분말을 얻는 단계;
   f) 메틸 알콜, 에틸 알콜, 프로필 알콜, 이소프로필 알콜 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알콜에 분말을 용해시키고 결정화하여 아시아티코사이드를 얻는 단계; 및
   g) 아시아티코사이드에 약학적으로 수용가능한 부형제(들)을 부가하여 적어도 99% (w/w) 순도의 아시아티코사이드를 포함하는 약학 조성물을 얻는 단계를 포함하는 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출은 8시간 내지 24시간의 시간 동안 20 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 물에 대해 상기 지방족 알콜은 60 % (v/v) 내지 99% (v/v) 범위의 비율인 것인 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출물은 순수에 용해되는 것인 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 진공 농축은 50℃ 내지 65℃에서 수행되는 것인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결정화는 -15℃ 내지 0℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
8. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 오일 서스펜션, 연고, 패치, 젤, 로션, 치약, 캡슐, 에멀전, 크림, 스프레이, 드롭, 분산가능한 분말 또는 과립, 경질 또는 연질 젤 캡슐 내의 에멀전, 시럽, 일릭서, 피토슈티칼, 뉴트라슈티칼 및 식재료 또는 그들의 조합으로 제제화되는 것인 방법.
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