CN103079573A - 用于由积雪草制备高纯度积雪草苷组合物的方法及其应用方法 - Google Patents

用于由积雪草制备高纯度积雪草苷组合物的方法及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了商业上可行的具有至少99%纯度的来源于植物积雪草的积雪草苷组合物及其制造方法。本发明进一步教导了用于口服给予治疗有效量的积雪草苷的方法和模型，用于口服给予治疗有效量的积雪草苷组合物用于治疗炎性肠病，如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病以及炎性肠病相关的并发症如痔疮、肛裂、瘘的模型。本发明进一步提供了用于口服给予治疗有效量的积雪草苷组合物用于治疗幽门螺杆菌的方法和模型。本发明进一步提供了用于口服给予治疗有效量的积雪草苷组合物用于预防结肠癌、胃病和胃癌的方法和模型。

Description

用于由积雪草制备高纯度积雪草苷组合物的方法及其应用方法
技术领域
本发明涉及来自积雪草（Centella Asiatica）的积雪草苷（积雪草皂苷，asiaticoside）提取物，并且更具体地涉及其在用于处理炎性肠病、治疗幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori）、预防胃病和胃癌中的应用。
背景技术
从积雪草中提取的积雪草苷是各公司商业上可获得的分析参照标准材料，诸如，例如，Yick-Vic公司已通过HPLC确定积雪草苷的纯度为92.8%，Tauto生物技术公司已通过HPLC确定积雪草苷的纯度为约97%，宝鸡（Baoji）草本植物生物技术公司的积雪草苷测定高于98%。然而，这些产品特别适合于用作参考标准在研究实验室中用于研究目的，而没有找到植物积雪草的提取物。这些积雪草苷产品在商业上不能用作药物组合物。
现有技术中适合用于由积雪草制备积雪草苷的方法要求纯度范围在50%-97%之间。例如，美国公开号2008/0194499教导了包括范围在15%-50%之间的积雪草苷组合物的药物五环萜类苷。而且，美国公开号2006/0177516公开了具有约40%积雪草苷组合物的萜烯混合物。此外，美国专利号6,417,349提供了具有4:6到6:4的范围以构成97%或更多提取物的积雪草提取物。此外，中国专利号CN1520824披露了用于纯度为92.8%的积雪草苷的提取和分离方法。然而，现有技术中没有一个尝试由积雪草专用地提取高纯度积雪草苷。
积雪草或积雪草苷的传统用途包括促进伤口愈合、治疗皮肤疾病（skin disease）、皮肤病（皮肤失调，skin disorder）和慢性炎性疾病。例如，中国专利号CN101129393披露了积雪草苷液体在伤口愈合中的应用。此外，美国公开号2009/0060985教导了积雪草都市提取物作为药品物质用于治疗皮肤病的应用。可以看到现有技术中有其中将积雪草苷或积雪草用于非传统用途的少数尝试。例如，美国公开号2008/0194499教导了萜类苷优选积雪草苷和羟基积雪草苷可选地连同赋形剂用于控制抑郁症的应用。此外，美国公开号2006/0177516提供了食品补充剂，其显示出积雪草苷用于治疗贫血症的应用。
然而，积雪草苷或积雪草用于处理与胃肠道相关的疾病诸如炎性肠病和幽门螺杆菌的应用，相对而言是未知的。可以看到现有技术中有其中将积雪草苷用于治疗肝病的少数尝试。例如，中国专利号CN1439376和CN1520824披露了积雪草苷用于预防和治疗肝纤维化的应用。此外，美国公开号2004/0097463披露了积雪草苷用于治疗与肝、结肠和胰腺相关的癌症的应用。此外，Cheng等人在2004年（“The healing effects of Centella extractand asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats”，Life Sciences，vol.74，pp.2237-2249）讨论了积雪草水提取物对大鼠中的乙酸诱导的胃溃疡的愈合作用。而且，Cheng等人在2000年（“Effects ofCentella asiaticaon ethanol induced gastric mucosal lesions in rats”，Life Sciences，vol.67，pp.2647-2653）教导了积雪草水提取物对乙醇诱导的胃粘膜病变的离体实验的预防作用。然而，现有技术所述的胃溃疡局限于化学制品或药物诱导的溃疡模型。此外，这些模型通过在胃部局部应用刺激物（乙酸）而造成特定的病变，这未必能处理结肠疾病如炎性肠病。此外，现有技术中声称积雪草苷产品用于治疗溃疡，但是没有说明积雪草苷用于预防溃疡的用途。
炎性肠病的特征是顽固的慢性炎症性病症如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病（Crohn's Disease），其表现出例如使人痛苦的症状，腹痛、腹泻、呕吐、便血（粪便带血）、食欲降低、体重减轻、发烧和各种相关并发症如肛裂、瘘（瘘管，fistulas）、直肠周脓肿、痔疮。溃疡性结肠炎和克罗恩氏病通常通过疾病活性指数评价，其包括排便次数、存在便血、内窥镜表现以及内科医师的整体评价。上面病症的持续会导致慢性炎症，随后变成发展为结肠癌的诱发因素。现有的用于治疗炎性肠病的方法包括减轻腹痛、腹泻、疲劳、贫血、营养不足、粘膜炎症、肠外表现、住院治疗、手术和并发症如脓肿、瘘、感染和恶性肿瘤。
炎性肠病的治疗由柳氮磺胺吡啶、免疫抑制剂和皮质类固醇的口服给予组成。通常，优选柳氮磺胺吡啶用于轻度至中度溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的第一线治疗。然而，副作用如药物不耐性、削弱叶酸摄取、肾脏的不良影响使得柳氮磺胺吡啶不期望用于炎性肠病治疗。此外，柳氮磺胺吡啶对于结肠的有效性是有限的，因为它被胃部吸收，随后在小便中排出。急性病症中的溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，需要用皮质类固醇治疗，但是这些药物不能预防缓解。长期使用皮质类固醇会造成皮肤变薄、对裂伤的敏感性、体重增加、血压升高、糖尿病及相关的有害病症。在溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的长期治疗中，免疫抑制剂是有效的。这些药物也有严重的副作用，如骨髓抑制、淋巴瘤（在肾移植病人中）、皮肤癌和胰腺炎。在严重情况下炎性肠病需要外科手术，如肠切除术、狭窄整形术或临时性或永久性的结肠造口术或回肠造口术，其涉及使用全身麻醉以及术后恢复的并发症。由粘膜损害的胃肠道溃疡是炎性肠病的相关并发症。炎性肠病和相关炎性疾病的慢性的特性需要长期的控制治疗。当前炎性肠病的治疗方法对于该疾病的持续性治疗和高危险性缓解具有有害副作用的局限性。
由病原菌如幽门螺杆菌诱导的炎症助长了炎性肠病症状的恶化。此外，环境因素如压力、食物和饮酒增强了幽门螺杆菌的活性。世界卫生组织（WHO）已经把幽门螺杆菌分类为促进胃癌的I组致癌物。幽门螺杆菌感染引发损害上皮细胞的慢性炎症反应，接着诱导胃萎缩，其最终导致胃癌。胃恶性肿瘤（胃癌，gastric carcinoma）或胃癌（gastric cancer）的治疗具有高度致命的治疗选择，诸如，例如，通过胃切除术手术切除癌性组织、部分/完全切除胃、化学疗法、放射疗法和化学放射疗法。然而，这些治疗具有极其严重的副作用，其导致患者生命质量下降。而且，由于存在较高的恶性肿瘤复发概率，所以这些治疗也不能保证完全恢复。为了从感染的胃粘膜中根除幽门螺杆菌，及时的诊断和治疗可能大大地降低胃癌的风险。使用者可以领会用于根除幽门螺杆菌感染的有效手段可以间接辅助预防幽门螺杆菌感染诱导的胃癌。
需要一种用于从积雪草提取积雪草苷的商业上可行的方法，积雪草苷要具有非常高的纯度以有效地用作药物组合物。进一步需要这样的积雪草苷组合物，其提供更有益（更容易处理，kinder）和更温和的方法，用于有效长期处理伴随幽门螺杆菌的炎性肠病。进一步需要积雪草苷组合物，其预防由于炎性肠病诱导的胃病和结肠癌。进一步需要积雪草苷组合物用于有效根除幽门螺杆菌感染，其预防胃癌。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种来源于积雪草的具有至少99%纯度的积雪草苷的药物组合物的制备方法或过程（方法，process）。
本发明的另一个目的是提供积雪草苷可选地连同可接受的药物赋形剂的药物组合物，用于治疗炎性肠病如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病。
本发明的又一个目的是提供积雪草苷可选地连同可接受的药物赋形剂的药物组合物，用于治疗炎性肠病相关的并发症，例如但不限于痔疮、肛裂、瘘。
本发明的又一个目的是提供积雪草苷可选地连同可接受的药物赋形剂的药物组合物，用于预防结肠癌。
本发明的又一个目的是使用积雪草苷可选地连同可接受的药物赋形剂的药物组合物，用于治疗幽门螺杆菌。
本发明的又一个目的是使用积雪草苷可选地连同可接受的药物赋形剂的药物组合物，用于预防胃病和胃癌。
发明综述
本发明披露了从植物材料积雪草提取的具有至少99%纯度的商业上可行的药物等级的积雪草苷组合物。本发明披露了在人和动物中的体内治疗方法，其中该治疗方法包括口服给予适合于治疗炎性肠病，治疗痔疮、肛裂和瘘，预防结肠溃疡和结肠癌，根除治疗幽门螺杆菌感染，预防胃病和预防胃癌的积雪草苷组合物。
具体实施方式
在本发明的范围内，本文所披露的积雪草苷化合物具有以下结构：
积雪草苷：
Figure BDA00002835328300051
在一个优选的实施方式中，本发明提供具有至少99%纯度的高纯度积雪草苷组合物及其制造方法。本发明的积雪草苷具有分子式C48H78O19。在这一个优选的实施方式中，积雪草苷由植物源积雪草获得，然而，应当理解，在本发明的其它可替换的实施方式中，积雪草苷可以由动物源获得。
特别地，本发明提供一种用于制备具有99%或以上积雪草苷的组合物的方法或过程（方法，process），其中，所述过程包括以下步骤：
a）将积雪草植物材料磨成粉状；
b）用第一溶剂处理磨成粉状的材料，以除去脂肪物质、叶绿素和其他色素（着色剂，colorant）；
c）用第二溶剂提取生物活性分子；
d）蒸馏提取物以除去溶剂并形成糊剂；
e）将蒸馏的糊剂溶解在第三溶剂中，以获得溶液；
f）用第三溶剂提取，以除去酸性杂质；
g）使纯化的提取物通过吸附剂，以得到澄清（clear）溶液；
h）用醇溶剂洗脱（eluting）树脂床，以获得溶剂洗脱液（溶剂洗脱物，solvent elute）；
i）将该溶剂洗脱液真空浓缩，以获得粉末；以及
j）用含水醇溶解该粉末并结晶，以获得具有至少99%HPLC纯度的积雪草苷组合物。
在下文中描述用于制备99%或以上的积雪草苷组合物的详细方法或过程：
根据本发明，将包括茎的干燥的积雪草叶子研磨成40目尺寸的粉。将磨成粉状的材料填充在提取器（extractor）中，所述提取器在装有滤布的容器的顶部和底部具有多孔板。
在下一步骤中，在范围为20°C至30°C之间（最优选在30°C）的温度下，在范围为8h至24h之间的时间段（最优选12h），使第一溶剂以逆流的方式循环通过该提取器。在这一个优选的实施方式中，所用的第一溶剂是具有60°C至80°C沸程（沸腾范围）的石油醚。然而，应当理解，在本发明的其他实施方式中，第一溶剂可以选自包括脂肪族化合物、酮类、醇类、亚硝酸盐/酯类（nitrites）、酯类、醚以及它们中的一种或多种的混合物的组。在下一步骤中，将叶绿素和其他脂类从该提取物中除去，并且使该物质干燥不含溶剂。
在下一步骤中，使用第二溶剂以逆流的方式提取该干燥的物质。在这一个优选的实施方式中，第二溶剂是具有从1至4个碳原子范围的脂肪醇，直链醇类和支链醇类两者的组合，与水或不与水组合。在本发明其他可替换的实施方式中，第二溶剂可以选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇，单独地或以60%至99%范围的比率与水组合。
在下一步骤中，在减压下蒸馏澄清的提取物，以蒸发溶剂并且形成糊剂。在下一步骤中，将该糊剂溶解在软化水中并且滤除不溶物。在下一步骤中，用第三溶剂反复提取澄清水层并且洗涤，以除去酸性物质，并且获得澄清的含水提取物。在这一个优选的实施方式中，第三溶剂是甲基异丁基酮。在本发明的又一个实施方式中，该溶剂可以选自包括己烷和石油醚的组。
在下一步骤中，该澄清的含水提取物层适合于通过吸附等级树脂的床并且用5体积或以上（优选8体积）的去离子水冲洗以从该床中除去所有颜色和污染物。
在下一步骤中，用具有C-1至C-4碳原子范围的醇溶剂，优选甲醇或异丙醇或所述醇的混合物，洗脱经水冲洗的床。收集洗脱的溶剂，反复冲洗该床，以除去该床中所有的积雪草苷类（积雪草皂苷类，centellosaponins）。
在下一步骤中，在低温（优选50°C至65°C之间）下将该溶剂洗脱液在真空下浓缩成粉末。将该粉末再溶解在含水醇中，以形成溶液。在这一个优选的实施方式中，该含水醇是甲醇。然而，应理解，含水醇可以选自乙醇、丙醇或异丙醇的组-单独地或以50%至99%范围比率的醇与水组合。
在下一步骤中，将该溶液冷却至低于0°C，优选-15°C或更低，以使积雪草苷结晶。在下一步骤中，滤出所获得的纯积雪草苷晶体，并且用冷水洗涤直到不含盐，并且在真空下干燥以得到自由流动性粉末，可以使用用于测定的HPLC分析自由流动性粉末的纯度。
最优选的方法总结如下：
a）将包括茎的干燥的积雪草（Centella asiaica）叶子研磨成40目尺寸的粉。
b）将磨成粉状的材料填充在提取器中，所述提取器在具有滤布的容器的顶部和底部具有多孔板。
c）在范围为20°C至30°C之间（优选在30°C）的温度下，在范围为8h至24h之间的时间段（优选12h），使具有60°C至80°C沸程的石油醚，以逆流的方式循环（流通，circulate）。
d）将得到的由叶绿素和其他脂类组成的提取物除去，使该物质干燥不含溶剂。
e）使用脂肪醇溶剂的组合，以逆流的方式再次提取干燥的物质，该脂肪醇溶剂的组合是具有从1至4个碳原子范围的直链醇类和支链醇类，与水或不与水组合。所述醇类可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇，单独地或以所述醇的60%至99%范围的比率与水组合。
f）通过在减压下蒸馏而蒸发溶剂，以将该澄清提取物制成糊剂。
g）将该糊剂溶解在软化水中，并且用甲基异丁基酮反复洗涤。
h）然后使该澄清的含水提取物通过吸附等级树脂的床，并且用5体积或以上（优选8体积）的去离子水冲洗以从该床中除去所有颜色和污染物。
i）用具有C-1至C-4范围碳原子的醇溶剂，优选甲醇或异丙醇或所述醇的混合物，洗脱该经水冲洗的床。
j）收集洗脱的溶剂，反复冲洗该床，以除去该床中所有的积雪草苷类（积雪草皂苷类，centellosaponins）。
k）在低温（优选50°C至65°C之间）下将该溶剂洗脱液在真空下浓缩成粉末。
1）将该粉末再溶解在含水醇中，其中所用的醇是乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇的组合或以醇的50%至99%范围的比率与水组合，将其冷却至低于0°C（优选-15°C或以下），以使积雪草苷结晶。
m）滤出由此形成的纯积雪草苷，并且用冷水洗涤直到不含盐，并且在真空下干燥以得到自由流动性粉末。
n）按照下述方式利用用于测定的HPLC分析由此分离的材料的纯度以及杂质。
用于分析的HPLC方法如下：
Figure BDA00002835328300101
在本发明的又一个实施方式中，积雪草苷组合物可选地连同可接受的药物赋形剂一起使用，该可接受的药物赋形剂选自诸如但不限于成粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶（gum）、涂布剂（coating agent）、着色剂、调味剂、涂布剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂和滚圆剂（spheronization agent）的组。
在本发明的又一个实施方式中，积雪草苷组合物可以被配制成选自诸如以下的组中的各种剂型，例如，片剂、含片（troche）、锭剂（lozenge）、水性或油性悬液、软膏剂、贴片（patch）、凝胶剂、洗剂、洁齿剂、胶囊剂、乳剂、乳膏剂、喷雾剂、滴剂、可分散性粉剂或粒剂、处于硬或软胶囊中的乳剂、糖浆剂、酏剂、植物性物质（phytoceuticals）、营养制品（nutraceuticals）和食品。
在本发明的又一个实施方式中，组合物是粉末或液体并且具有最小的副作用，其中，该组合物在动物中的剂量范围是1-360mg/kg，在人类中为1-60mg/kg。该积雪草苷组合物适合于以治疗或预防剂量给药，用于有效治疗患病部位。
在该优选的实施方式中，本发明另外提供了治疗炎性肠病（在下文中为IBD），如溃疡性结肠炎（在下文中为UC）、克罗恩氏病（在下文中为CD）和痔疮、肛裂、瘘的相关并发症，并且预防由上面的病症诱导的结肠癌的体内方法。
在优选的实施方式中，本发明还提供了治疗幽门螺杆菌（下文中为幽门螺杆菌（H.Pylori））的体内方法。此外，本发明还提供了根除NSAID诱导的溃疡中的幽门螺杆菌的体内方法。
在优选的实施方式中，本发明还提供了预防胃病和胃癌的体内方法。
因此，在本发明的范围内，进行这些测试以确定抗发炎活性、治愈活性，在下文中详细描述积雪草苷组合物（在下文中为试验药（test drug））的使用方法和作用模型的建立：
a）在药物代谢动力学研究中，给予试验药并分析其在血液中的生物可利用率和在尿液和粪便中的排泄。观察到积雪草苷没有被吸收到血液中，而是完全以未变的形式随粪便物排泄。试验药的这种特性促进了用于治疗IBD和相关疾病的进一步研究。
b）在三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的IBD模型中，在TNBS给药后，治疗10天后，试验药显著降低了结肠重量以及结肠重量/长度比。此外，也看到体重增加、结肠中的溃疡指数和髓过氧化物酶活性降低。此外，试验药给予第三天后，直肠出血也显著减少。
c）在乙酸诱导的IBD模型中，治疗10天后，试验药显著降低了结肠重量、结肠长度、结肠宽度、结肠重量/长度比和结肠的宏观评分。试验药也显示出降低的溃疡指数和髓过氧化物酶活性的显著降低。
d）测试幽门螺杆菌感染的具有非甾体抗炎药（在下文中为NSAID）诱导的溃疡的大鼠的体内模型，用于试验药可能的抗幽门螺杆菌和抗溃疡活性。该试验药显示出溃疡面积中剂量依赖性和时间依赖性的减少，连同幽门螺杆菌感染的完全根除。
e）在应激诱导的溃疡（应激性溃疡，stress induced ulcer）的模型中，将组胺给予大鼠以诱导溃疡病症，并且通过用试验药对动物预先治疗，证实了该试验药在预防应激诱导的溃疡中的作用。发现该试验药在预防组胺诱导的溃疡中是有效的。
f）在醇诱导的溃疡模型中，将乙醇给予预先用试验药治疗的大鼠，以诱导溃疡病症。该试验药显示出对乙醇诱导的溃疡的预防效果。
借助以下实施例进一步详细阐述本发明。然而，应理解，这些实施例不应当被解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例-1
用锤磨机将10千克积雪草叶研磨成40目尺寸的粉。在30°C下，在8小时的时间段内，用50升石油醚在固定床逆流提取器中反复提取该磨成粉状的材料。通过使空气流通到该床中来干燥所提取的不含叶绿素和脂肪类的物质。在30°C下，用75升异丙醇提取该干燥的物质8小时。将提取后的澄清滤液在真空下浓缩以得到糊剂。将该糊剂溶解在25升软化水中并滤除不溶物。用甲基异丁基酮反复提取和洗涤澄清水层，以除去所有酸性物质。利用TLC监控该操作中酸性成分的缺失，其中TLC的流动相由比率为4:1:5的正丁醇：乙酸乙酯：水的顶部混合物层组成。使澄清的层通过具有包含250ml
Figure BDA00002835328300121
XAD-4的垂直柱的吸附色谱柱，并且用水冲洗以除去所有粘附的颜色和颗粒。接着进行洗脱循环，其中用甲醇洗脱该柱，并在真空下浓缩该溶剂洗脱液以得到500g的粉末。将该粉末溶解在2500ml由80%甲醇和20%水组成的含水醇中，以得到澄清溶液。将该溶液冷却至-15°C，以得到积雪草苷晶体。将该物质过滤、水洗并在80°C下干燥。产物为具有99.6%HPLC纯度的158g积雪草苷。
实施例-2
用锤磨机将10千克积雪草叶研磨成40目尺寸的粉。在30°C下，在8小时的时间段内，用50升石油醚在固定床逆流提取器中反复提取磨成粉状的材料。通过使空气流通到该床中来干燥所提取的不含叶绿素和脂肪类的物质。在30°C下，用75升80%的含水乙醇提取该干燥的物质8小时。将提取后的澄清滤液在真空下浓缩以得到糊剂。将该糊剂溶解在25升软化水中并滤除不溶物。用甲基异丁基酮反复提取和洗涤澄清水层，以除去所有酸性物质。利用TLC监控该操作中酸性成分的缺失，其中TLC的流动相由具有比率为4:1:5的正丁醇：乙酸乙酯：水的顶部混合物层组成。使澄清的层通过具有包含250ml
Figure BDA00002835328300131
XAD-4的垂直柱的吸附色谱柱，并且用水冲洗以除去所有粘附的颜色和颗粒。接着进行洗脱循环，其中用甲醇洗脱该柱，并在真空下浓缩所获得的溶剂洗脱液，以得到500g的粉末。将该粉末溶解在2500ml由80%甲醇和20%水组成的含水醇中，以获得澄清溶液。将该溶液冷却至-15°C，以得到积雪草苷晶体。将该物质过滤、水洗并在80°C下干燥。获得的产物为具有99.2%HPLC纯度的150g积雪草苷。
实施例-3
用锤磨机将10千克积雪草叶研磨成40目尺寸的粉。在30°C下，在8小时的时间段内，用50升石油醚在固定床逆流提取器中反复提取磨成粉状的材料。通过使空气流通到该床中来干燥所提取的不含叶绿素和脂肪类的物质。在30°C下，用75升甲醇提取该干燥的物质8小时。将提取后所获得的澄清滤液在真空下浓缩以得到糊剂。将该糊剂溶解在25升软化水中并滤除不溶物。用甲基异丁基酮反复提取和洗涤澄清水层，以除去酸性物质。利用TLC监控该操作的酸性成分的缺失。使澄清的层通过具有包含250ml
Figure BDA00002835328300132
XAD-4的垂直柱的吸附色谱柱，并且用水冲洗以除去所有粘附的颜色和颗粒。接着进行洗脱循环，其中用甲醇洗脱该柱，以获得溶剂洗脱液。在真空下浓缩该溶剂洗脱液，以得到500g粉末。将该粉末溶解在2500ml由80%甲醇和20%水组成的含水醇中，以获得澄清溶液。将该溶液冷却至-15°C，以得到积雪草苷晶体。将该物质过滤、水洗并在80°C下干燥。获得的产物为具有99.8%HPLC纯度的145g积雪草苷。
实施例-4
用锤磨机将10千克积雪草叶研磨成40目尺寸的粉。在30°C下，在8小时的时间段内，用50升石油醚在固定床逆流提取器中反复提取磨成粉状的材料。通过使空气流通到该床中来干燥所提取的不含叶绿素和脂肪类的物质。在30°C下，用75升包含80%异丙醇和20%水的异丙醇提取该干燥的物质8小时。将提取后的澄清滤液在真空下浓缩以得到糊剂。将该糊剂溶解在25升软化水中并滤除不溶物。用甲基异丁基酮反复提取和洗涤澄清水层，以除去所有酸性物质。利用TLC监控该操作的酸性成分的缺失。使澄清的层通过具有包含250ml
Figure BDA00002835328300141
XAD-4垂直柱的吸附色谱柱，并且用水洗涤以除去所有的粘附的颜色和颗粒。接着进行洗脱循环，其中用甲醇洗脱该柱，并在真空下浓缩所获得的溶剂洗脱液，以得到500g的粉末。将该粉末溶解在2500ml由80%甲醇和20%水组成的含水醇中，以获得澄清溶液。将该澄清溶液冷却至-15°C，以得到积雪草苷晶体。将该积雪草苷物质过滤、水洗并在80°C下干燥。产物为具有99.6%HPLC纯度的158g积雪草苷。
实施例-5：
用锤磨机将10千克积雪草叶研磨成40目尺寸的粉。在30°C下，在8小时的时间段内，用50升石油醚在固定床逆流提取器中反复提取磨成粉状的材料。通过使空气流通到该床中来干燥所提取的不含叶绿素和脂肪类的物质。在30°C下，用75升包含30%水的70%的异丙醇提取该干燥的物质8小时。将提取后的澄清滤液在真空下浓缩以得到糊剂。将该糊剂溶解在25升软化水中并滤除不溶物。用甲基异丁基酮反复提取和洗涤澄清水层，以除去所有酸性物质。利用TLC监控该操作的酸性成分的缺失。使澄清的层通过具有包含250mlXAD-4的垂直柱的吸附色谱柱，并且用水冲洗以除去所有的粘附的颜色和颗粒。接着进行洗脱循环，其中用甲醇洗脱该柱，并在真空下浓缩所获得的溶剂洗脱液，以得到500g的粉末。将该粉末溶解在2500ml由80%甲醇和20%水组成的含水醇中，以获得澄清溶液。将该澄清溶液冷却至-15°C，以得到积雪草苷晶体。将该物质过滤、水洗并在80°C下干燥。获得的产物为具有99.8%HPLC纯度的157g的积雪草苷。
实施例-6：试验药在作用点的利用率
以健康的大鼠研究试验药的药物动力学参数，以测定该试验药的生物可利用率。
步骤：在该研究中，动物在实验前一晚禁食，并单独给予250mg/kg口服剂量的试验药。定量给药后，收集0、0.25、0.50、1、2、3、4、5和6小时的血样。在4°C下，通过以7000rpm离心血液15min来获得血浆，将该血浆保持在-20°C直到进行分析。将动物保持在代谢笼中，收集尿液和粪便。开展反相高压液相层析（HPLC）法来检测血浆、尿液和粪便中的试验药。测定0-4h、4-8h和8-24h通过尿液和粪便排出的试验药。
观察：观察到，即使是以250mg/kg的高剂量，也没有药物被系统地吸收到血液中。这通过尿液中不存在积雪草苷被再次证实。观察到试验药以不变的形式通过胃肠道并通过粪便物彻底排泄。此外，观察到试验药没有被吸收到血液中，这显著提高了积雪草苷组合物在患病部位处的生物可利用率。在本文中所进行的实验中，观察到从粪便物中回收约81.42%的药物。因此，证实了对于该试验药在治疗IBD和相关疾病中的潜能。
实施例-7：试验药对大鼠的TNBS诱导结肠炎的作用
三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎是用于IBD的标准动物模型之一。在该模型中，TNBS的单独结肠内给药损害结肠上皮并诱导拖延的慢性炎症。结肠的透壁肉芽肿性炎症类似于克罗恩氏病中表现的组织病理学特征。
步骤：在该研究中，雄性威斯塔大鼠（韦斯大鼠，Wistar rat）（280-291g）禁食48h，并将其麻醉。将直径3mm的插管插入肛门中至8cm的深度，将溶解在0.25ml30%的乙醇溶液中的25mg TNBS注入每个大鼠中。将大鼠尾部朝上放置1min。1天后，口服给予试验药，每日一次持续10天。维持只接受盐水但无TNBS的健康对照组。在第11天，通过颈脱位法杀死每组的大鼠，将结肠分离用于物理检验。将结肠样品保存在10%的中性福尔马林溶液中用于组织病理学鉴定。
观察：在所进行的实验中，通过每日一次以50mg/kg（口服（p.o.））的试验药剂量治疗10天，TNBS诱导的IBD病症如增加的结肠重量、结肠重量与长度的比率和髓过氧化物酶活性显著地逆转。从显微评分和结肠溃疡指数的降低看出，该试验药也治愈了由TNBS产生的病变。通过试验药逆转髓过氧化物酶活性证实了试验药在治愈IBD中发现的结肠病变中的潜力。
表1：10天治疗之后试验药对大鼠中TNBS诱导的IBD的结肠重量和长度的作用
n=6；对于每一个参数，利用单因素方差分析（One Way ANOVA）接着进行Dunnett检验分析数据。与健康对照组相比，###P<0.001；与TNBS对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001。
表2：10天治疗之后试验药对大鼠中TNBS诱导的IBD的结肠显微评分的作用
Figure BDA00002835328300171
n=6；对于每一个参数，利用Kruskal Wallis接着进行Dunns多重比较检验分析数据。与健康对照组相比，###P<0.001；与TNBS对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
表3：10天治疗之后试验药对大鼠中TNBS诱导的IBD的体重的作用
Figure BDA00002835328300172
n=6；利用双因素方差分析（Two WayANOVA）接着进行Bonferroni后检验分析数据。与健康对照组相比，#P<0.05，###P<0.001；每天与TNBS对照组相比，***P<0.001。ns-与健康对照相比，不显著；ns1-与TNBS诱导的大鼠相比，不显著。
试验药对TNBS诱导的IBD的作用强有力地显示了试验药在治疗和处理（控制）IBD中的治疗价值。
实施例8：试验药在大鼠中对乙酸诱导的结肠炎的作用
乙酸诱导的结肠炎是具有与人类急性肠炎类似的炎症介质的IBD模型。
步骤：在该模型中，初始损伤（initialinjury）是上皮坏死和浮肿，取决于乙酸的浓度和暴露于乙酸的长度，其可变地延伸至粘膜固有层、粘膜下层或外部肌肉层中。在诱导结肠炎之前的72h开始每日一次以50mg/g（口服）的剂量给予雄性威斯塔大鼠（280-291g）试验药。大鼠禁食24h，将其麻醉并将直径3mm的插管插入肛门中至8cm的深度，用30s将2ml3%乙酸滴入结肠中。在24h之后，通过颈脱位法杀死动物，将结肠分离，测定结肠炎的参数。
观察：用该试验药对大鼠预治疗3天对乙酸诱导的结肠炎症状具有显著地逆转作用。乙酸诱导的病症如增加的结肠重量和结肠重量与长度比的逆转显示试验药对结肠炎的有益效果。这些作用进一步通过结肠组织中宏观病变评分和髓过氧化物酶活性的降低而证实。
表4：预治疗3天以后试验药对大鼠中乙酸诱导的结肠炎的结肠参数的作用
Figure BDA00002835328300181
n=6；对于每一个参数，利用单因素方差分析接着进行Dunnett检验分析数据。与健康对照组相比，###P<0.001；与乙酸对照组相比，***P<0.001。
表5：预治疗3天以后试验药对大鼠中乙酸诱导的结肠炎的结肠显微评分的作用
n=6；对于每一个参数，利用Kruskal Wallis接着进行Dunns多重比较检验分析数据。与健康对照组相比，###P<0.001；与乙酸对照组相比，**P<0.01和***P<0.001。
试验药对乙酸诱导的结肠炎的作用强有力地表明试验药在处理IBD中的治疗价值。
实施例9：试验药对幽门螺杆菌感染的胃病的作用
在大鼠的NSAID诱导的溃疡中，长期给药9周后测试试验药对根除幽门螺杆菌的作用。通过聚合酶链反应（PCR）和快速尿素酶试验（RUT）监测幽门螺杆菌感染以验证该长期治疗。
步骤：雄性威斯塔大鼠（200-230g）禁食24h，并连续3天以30mg/kg（口服）的剂量给予萘普生（Naproxen）。在24h后，连续3天给予活的幽门螺杆菌的布鲁氏杆菌属肉汤溶液（ATCC26695，MS-5菌株，108CFU）（1ml/动物）。在1周后，将试验药以每日两次120mg/kg（口服）或每日一次240mg/kg（口服）或每日一次360mg/kg（口服）的剂量给药。9周的治疗完成时将这些动物杀死。将被杀死的动物胃部分离，用盐水洗涤胃粘膜，将幽门切割用于RUT。将粘膜打碎用于髓过氧化物酶测定，通过PCR、凝胶电泳对两种非突变基因16SrRNA和hrgA扩增DNA。
观察：在4周、6周和9周的治疗之后，通过RUT和两种幽门螺杆菌基因的PCR扩增监测大鼠胃部中的感染状况。观察到，在第3周，以360mg/kg（口服）剂量的试验药显示出快速抗菌作用，随后在9周内根除了幽门螺杆菌感染。然而，以每日两次120mg/kg（口服）和每日一次240mg/kg（口服）的较低剂量给予该试验药对于根除幽门螺杆菌没有效果。试验药的作用强有力地表明以大剂量在根除幽门螺杆菌感染中的治疗价值，也为其在用于治疗幽门螺杆菌相关的胃病和胃癌的治疗潜力提供了药理学置信度。
实施例10：试验药对药物诱发的胃病的预防效果
由NSAIDS药物如萘普生诱导的胃病变可以在胃肠道中加重炎症反应。在萘普生诱导的溃疡的动物模型中研究了试验药在预防药物诱导的胃病变中的潜力。
步骤：用剂量为30mg/kg（口服）或60mg/kg（口服）或120mg/kg（口服）的试验药预先处理雄性威斯塔大鼠（220-230g），然后给予30mg/kg（口服）剂量的萘普生。与没有经受用该试验药预先处理的萘普生对照组比较形成的溃疡和溃疡面积。
观察：观察到，用该试验药预先处理以剂量依赖性的方式预防溃疡形成。发现120mg/kg的最高剂量在保护抵抗萘普生的致溃疡作用中最有效。因此，该试验显示出对于药物致溃疡作用的潜在的预防效果。
表6：试验药对大鼠中的萘普生诱导的胃病的预防效果
Figure BDA00002835328300201
n=6；利用单因素方差分析接着进行Dunnett多重比较检验来分析数据，ns-不显著；与萘普生对照组相比，**P<0.01，***P<0.001。
实施例11：试验药对应激诱导的胃病（Stress Induced Gastric Disease）的预防作用
应激诱导的胃病变是可以导致或加重胃肠道中炎症反应的病症。在组胺诱导的溃疡的动物模型中研究了试验药在预防应激诱导的胃病变中的潜力。
步骤：用剂量为30mg/kg（口服）或60mg/kg（口服）或120mg/kg（口服）的试验药预先处理雄性威斯塔大鼠（220-230g），然后给予300mg/kg（腹腔注射（i.p.））剂量的组胺。与没有经受用该试验药预先处理的对照组比较形成的溃疡和溃疡面积。
观察：观察到，用该试验药预先处理以剂量依赖性的方式预防溃疡形成。120mg/kg的最高剂量在保护抵抗组胺的致溃疡作用中是最有效的。因此，证实了该试验药对应激诱导的溃疡具有潜在的预防效果。
表7：试验药对大鼠中组胺诱导的胃病的预防效果
Figure BDA00002835328300211
n=6；利用单因素方差分析接着进行Dunnett多重比较检验来分析数据。与组胺对照组相比，*P<0.05，***P<0.001。
实施例12：试验药对大鼠中醇诱导的胃病的预防作用：
饮酒是另一个导致胃病变的主要因素。因此，研究了该试验药在预防动物中乙醇诱导的溃疡中的潜力。
步骤：用剂量为30mg/kg（口服）或60mg/kg（口服）或120mg/kg（口服）的试验药预先处理雄性威斯塔大鼠，然后给予8ml/kg（口服）剂量的乙醇。与没有经受用该试验药预先处理的对照组比较形成的溃疡和溃疡面积。在该研究中，对照组中平均溃疡面积测量为174.4mm2±5.814mm2，表明了乙醇的致溃疡作用。
观察：观察到，用该试验药预先处理以剂量依赖性的方式预防溃疡形成。120mg/kg的最高剂量在保护抵抗乙醇的致溃疡作用中是最有效的。因此，证实了该试验药对饮酒诱导的溃疡的显著预防效果。
表8：试验药对大鼠中乙醇诱导的胃病的预防效果
n=6；利用单因素方差分析接着进行Dunnett多重比较检验来分析数据。与乙醇对照组相比，*P<0.05，***P<0.001。
实施例13：试验药在人类中治疗IBD中的作用
进行了预期性研究以评价该试验药在患有IBD的病人中的功效。
步骤：在该研究中，每天两次以300mg的剂量将该试验药给予患有炎性肠病的慢性症状的三个病人，持续6个月的时间段。其后，基于病人在研究期间开始和结束时所报告获得的结果分析该试验药的功效。
观察：观察到，所有病人体验到IBD相关症状如腹痛、腹泻、直肠出血、发烧、恶心和呕吐的减轻。进一步观察到，取决于腹泻药物和与肠运动有关的疼痛，根据进洗手间次数的降低可以看出在肠对照中存在显著的改善。进一步观察到，没有发生关节疼痛、皮肤病或眼睛相关的并发症。进一步观察到该试验药有良好耐药力，并且在IBD的治疗中显示出功效。
表9：试验药在人中治疗IBD持续6个月的效果
症状的严重等级（0-无；1-轻度；2-中度；3-严重）
实施例14：试验药在治疗人类痔疮中的效果
进行了预期性不受控制的试点研究以评价该试验药对患有痔疮的病人的功效。
步骤：每天两次以300mg的剂量将该试验药给予患有直肠出血、排便期间疼痛、和直肠刺激的慢性痔疮症状的五个病人，持续15天。基于病人在研究周期开始和结束时所报告获得的结果分析该试验药的功效。
观察：观察到，该试验药具有立即减轻痔疮和肛裂症状的功效。进一步观察到，在用该试验药治疗的第3天，所有病人都消除直肠出血。进一步观察到，治疗期结束时与排便相关的疼痛和刺激显著减轻。
表10：试验药在治疗人的痔疮15天中的效果
Figure BDA00002835328300231
Figure BDA00002835328300232
评价等级（0-无至5-严重）
已经以说明性的方式描述本发明，并且应理解所用的术语旨在说明而不是限制的特性。
并不旨在详尽的或将本发明限于所披露的精确的形式。根据上述教导可能有很多修改和验证。旨在本发明的范围并不是由该详细的说明书限定，而是由所附至此的权利要求书限定。还要理解，所附权利要求书旨在覆盖本文所描述的本发明的全部一般的和特殊的特征。

Claims (34)

1.一种从植物材料积雪草中提取的具有至少99%纯度的药物等级积雪草苷组合物，所述积雪草苷组合物具有分子式C48H78O19，所述积雪草苷组合物适合用于治疗以下幽门螺杆菌、胃病、胃癌、炎性肠病以及与炎性肠病相关的并发症中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的积雪草苷组合物，其中，所述提取适合于在约20°C至30°C的温度范围和约8h至24h的时间段下进行。
3.根据权利要求1所述的积雪草苷组合物，其中，所述提取适合于通过第一溶剂进行，以除去脂肪物质、叶绿素以及其他色素。
4.根据权利要求1所述的积雪草苷组合物，其中，所述提取适合于通过第二溶剂进行，以提取生物活性分子并获得基本上澄清的提取物或滤液。
5.根据权利要求3所述的积雪草苷组合物，其中，所述第一溶剂选自脂肪族化合物、酮类、醇类、亚硝酸盐/酯类、酯类、醚类以及它们中一种或多种的混合物的组。
6.根据权利要求3所述的积雪草苷组合物，其中，所述第一溶剂是石油醚或甲基异丁基酮。
7.根据权利要求4所述的积雪草苷组合物，其中，所述第二溶剂是单独或以60%至99%范围的比率与水组合的选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇的脂肪醇。
8.根据权利要求4所述的积雪草苷组合物，其中，所述基本上澄清的提取物适合于在减压下蒸馏以形成糊剂。
9.根据权利要求8所述的积雪草苷组合物，其中，所述糊剂适合于溶解在软化水中，以获得基本上澄清的水层。
10.根据权利要求9所述的积雪草苷组合物，其中，所述基本上澄清的水层适合于用第三溶剂提取，以除去酸性物质。
11.根据权利要求10所述的积雪草苷组合物，其中，所述第三溶剂是甲基异丁基酮。
12.根据权利要求9所述的积雪草苷组合物，其中，所述基本上澄清的水层适合于经受树脂床处理，接着用醇溶剂洗脱，以获得溶剂洗脱液。
13.根据权利要求12所述的积雪草苷组合物，其中，所述溶剂洗脱液适合于在约50°C-60°C的温度范围下在真空下浓缩。
14.根据权利要求12所述的积雪草苷组合物，其中，浓缩的所述溶剂洗脱液适合于再溶解在含水醇中，接着进行冷却结晶。
15.根据权利要求14所述的积雪草苷组合物，其中，所述冷却结晶适合于在约0°C至-15°C的温度范围下进行。
16.一种配制用于在人类和动物中治疗的剂型，包括治疗有效量的根据权利要求1所述的积雪草苷组合物的口服给予。
17.根据权利要求16所述的积雪草苷组合物，其中，所述剂型适合于选自片剂、含片、锭剂、水性或油性悬液、软膏剂、贴片、凝胶剂、洗剂、洁齿剂、胶囊剂、乳剂、乳膏剂、喷雾剂、滴剂、可分散性粉剂或粒剂、处于硬或软胶囊中的乳剂、糖浆剂、酏剂、植物性物质、营养制品和食品的组。
18.根据权利要求16所述的积雪草苷组合物，其中，所述剂型适合于连同药物等级的赋形剂一起口服给予，所述药物等级的赋形剂选自成粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、涂布剂、着色剂、调味剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂和滚圆剂的组。
19.根据权利要求16所述的积雪草苷组合物，其中，动物中的剂量范围基本上是1-360mg/kg。
20.根据权利要求16所述的积雪草苷组合物，其中，人类中的剂量范围基本上是1-60mg/kg。
21.一种在人类和动物中的体内治疗方法，所述方法包括以下步骤：
口服给予有效量的至少99%纯度的积雪草苷组合物作为用于有效治疗患病部位的治疗或预防剂量。
22.根据权利要求21所述的治疗方法，其中，所述方法适合于治疗以下炎性肠病、痔、肛裂、瘘中的一种或多种，以及根除幽门螺杆菌感染。
23.根据权利要求21所述的治疗方法，其中，所述方法适合于预防以下结肠溃疡、结肠癌、胃病和胃癌中的一种或多种。
24.根据权利要求22所述的治疗方法，其中，所述炎性肠病是以下三硝基苯磺酸诱导的炎性肠病、乙酸诱导的炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病中的一种或多种。
25.根据权利要求23所述的治疗方法，其中，所述胃病是以下应激诱导的溃疡、组胺诱导的溃疡和乙醇诱导的溃疡中的一种或多种。
26.根据权利要求22所述的治疗方法，其中，所述幽门螺杆菌感染是通过溃疡面积中的剂量依赖性和时间依赖性降低确定的非甾体抗炎药诱导的幽门螺杆菌感染。
27.根据权利要求23所述的治疗方法，其中，通过根除幽门螺杆菌感染预防所述胃癌。
28.根据权利要求21所述的治疗方法，其中，所述积雪草苷组合物适合于促进针对药物致溃疡作用的预防作用。
29.一种来自植物材料积雪草的至少99%纯度的积雪草苷组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a）在提取器中用第一溶剂提取磨成粉状的积雪草植物材料；
b）用第二溶剂提取生物活性分子，以获得澄清的提取物或滤液；
c）蒸馏并用第三溶剂提取所述澄清的提取物，以获得澄清的水层；
d）通过树脂床处理所述澄清的水层，接着用醇溶剂洗脱，以获得溶剂洗脱液；
e）在真空下浓缩所述溶剂洗脱液，接着将所述溶剂洗脱液再溶解在含水醇中，以形成溶液；以及
f）将所述溶液冷却结晶，以获得至少99%纯度的积雪草苷组合物。
30.根据权利要求29所述的制备方法，其中，所述提取适合于在约20°C至30°C的温度范围和约8h至24h的时间段下进行。
31.根据权利要求29所述的制备方法，其中，所述溶剂洗脱液适合于在约50°C-60°C的温度范围下在真空下浓缩。
32.根据权利要求29所述的制备方法，其中，所述冷却结晶适合于在约0°C至-15°C的温度范围下进行。
33.根据权利要求29所述的制备方法，其中，冷却结晶之后获得的所述积雪草苷组合物适合于过滤并用冷水洗涤。
34.根据权利要求33所述的制备方法，其中，过滤之后获得的积雪草苷晶体适合于在高温下干燥以形成具有至少99%HPLC纯度的积雪草苷组合物的自由流动性粉末。
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