JP6876724B2 - 塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物とその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、海辺の高塩地帯で生長して高濃度の塩分を含有する塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物、脱塩抽出物、冷水抽出塩代替物、及び脱塩栄養組成物の抗肥満の用途に関し、さらに詳細には塩ストレス（ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ）が高い高塩の極限の環境で生息する塩生植物から「温度変化による塩類の水に対する溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）差」の原理を用いた低温冷水抽出により塩化ナトリウム成分のみを選択的に除去することで、ナトリウム含有量は低く、カリウムなどの有用ミネラルと塩生植物固有の栄養成分及び生理活性物質の含有量は高くなった塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物、脱塩抽出物、冷水抽出塩代替物、及び脱塩栄養組成物の抗肥満用途に関する。

塩生植物（ｈａｌｏｐｈｙｔｅ）とは、海辺、塩田周囲など塩基がある所で海水を食べて育つ植物であり、土壌の塩分濃度が高いため一般の陸上植物が育たない地域で育つ。塩生植物は、塩ストレス（ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ）に打ち勝つ代謝活動をするため、生体内に多くの塩成分を含有し得、浸透圧が高いため海水を吸い込み得、生体内に高い塩を含有しており、摂取する時その味が非常に塩辛い。塩生植物は全世界にわたって干潟の高塩地域にその群落が形成されており、代表的にアッケシソウ（Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、マツナ（Ｓｕａｅｄａ ａｓｐａｒａｇｏｉｄｅｓ）、七面草（Ｓｕａｅｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ）などがある。

アッケシソウ（Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ）は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）に属する１年生性塩生植物であつて、一般作物は育ちにくい干潟や海辺の高塩地域で育ち、生息地は、韓国、欧州、北米など全世界的に広範囲に分布している。アッケシソウの茎は、節が多く多肉質で肥大化し、濃い緑色であり、高さ２０〜４０ｃｍまで伸びる。アッケシソウについては、中国の古い医書である「神農本草経」に、味が非常に塩辛いため鹹草、塩草と記載されており、また、とても貴重で神聖な草とも言われて神草と呼ばれた。アッケシソウは、北米では一般的に「Ｇｌａｓｓｗｏｒｔ」、欧州では「Ｓａｍｐｈｉｒｅ」、そして、日本では「アッケシソウ」あるいは「サンゴ草」と呼ばれる。アッケシソウは、塩分濃度が高い干潟で育つため浸透圧に耐えるために植物体内に高い濃度の塩分を貯蔵する。そのため、アッケシソウ粉末は、植物性塩の代替材として用いられている。最近の報告によれば、ナトリウム（Ｎａ）成分だけでなく、カルシウム（Ｃａ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、鉄（Ｆｅ）成分が他の植物に比べて高濃度で含有されており、必須アミノ酸、食物繊維、生理活性栄養素などが豊富であるため、抗血栓、抗糖尿、抗高脂血症、抗高血圧、メラニン形成の抑制機能、抗酸化作用など多様な生理的効能が報告されている。アッケシソウの塩味と多様な生理的効能のために民間療法に使われ、生活習慣病に効果を有する薬草として用いられていたものと伝えられている。韓国土種薬草研究会ではアッケシソウが循環器系と消火器系に効能があると報告しており、日本の大原山荘難病研究所では様々な癌、蓄膿症、関節炎、高血圧、低血圧、腰痛、肥満症、痔疾、糖尿病などに優れた効能を有すると報告している。日本の大和本草には「神草」または「福草」、「塩草」と呼ばれており、体内に蓄積されている毒素と宿便を無くし、癌・子宮筋腫・蓄膿症など多様な難病に卓越した治療効果を有していると記録されている。のみならず、アッケシソウは、血液循環改善及び血管強化並びに高血圧・低血圧を同時に治療して蓄膿症・腎臓炎・関節炎などに効果がある。また、アッケシソウには化膿性炎症を治療して多様な菌を除去する作用があるので、炎症と関節炎による水腫などの治療に用いられる。このほかにもアッケシソウは、慢性疲労の回復にも役立ち、頭をすっきりさせて精神集中を助ける。

マツナは、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）に属する１年生性塩生植物であり、学名は「Ｓｕａｅｄａ ｇｌａｕｃａ」である。マツナは、韓国、日本、中国など地の海辺の高塩地域に広く分布されている。マツナは、「Ｓｕａｅｄａ ａｓｐａｒａｇｏｉｄｅｓ」と同義語であり、葉が松葉のように細長いため韓国では一名「Ｇａｅｔｓｏｌｎａｍｕｌ」とも言われる。マツナは、食用が可能であるが、高塩分を含有するため摂取が制限的であるので、植物性塩の代替材程度に用いられている。マツナは、解熱作用があり、高血圧及び肝機能の回復に卓越であり、腸内に蓄積された宿便と老廃物とを分解して外に送り出す作用を有しており、便秘、肥満症などに用い得る。その外にもマツナにはポリフェノール化合物など生理活性物質が含有されており、抗酸化作用及び毛細血管の透過性を抑制するなど血管を丈夫にする効果と活性酸素消去能、脂質過酸化抑制効能もあるため、マツナの塩分を除去すれば、機能性食品としての開発可能性が高い。

七面草は、学名が「Ｓｕａｅｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ」であり、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）に属する１年生性塩生植物であり、アッケシソウと共に体内に塩分を多量含有しており、高い塩分濃度の土壌で生長できる耐塩性植物である。韓国と日本などの地に生息しており、高さが２０〜５０ｃｍであり、最初は緑色であるが、後に紫に変わる。七面草は、食用が可能であるが、高塩分を含有するため摂取が制限的であり、植物性塩の代替材程度に用いる。漢方では根を除いた植物体全体を薬剤に用いるが、解熱、高血圧、消化不良、便秘、肥満症などに作用するものとして知られている。天然ミネラルを多量含有しており、生物学的利用可能性が高いポリフェノール、フラボノイドと、サポニンのような２次代謝産物が豊富であるので、七面草の塩分を除去すれば、機能性素材としての高い活用可能性を有している。七面草は、抗酸化効果及び食後血糖を高める酵素であるα−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの阻害活性などの生理活性機能を有し、七面草に存在する成分研究としては塩ストレスに対応するｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｅ、及びその他成分（２’−ｈｙｄｒｏｘｙ−６，７−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ−ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ、ｌｏｌｉｏｌｉｄｅ、ｄｅｈｙｄｒｏ ｖｏｍｉｆｏｌｉｏｌ、及びｕｒｉｄｉｎｅ）などが報告されている。

一方、地球温暖化による頻繁な異常気象による穀物生産の鈍化及び中国、インドなど新興中進国の経済成長による動物性食品の爆発的需要による家畜飼料の増加、バイオ燃料生産による食糧資源の誤用などで世界の食料事情は悪化しつつある。気候変化及び水不足に対処するため、安定した食糧資源の確保のための未来核心技術の一つとして海水を活用した海水農業（Ｓｅａ Ｗａｔｅｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）がある。現在、全世界の慢性的な水不足地域では農業用水だけでなく、人間が飲む水も不足している実情である。したがって、淡水にのみ依存する現在の農業生産システムは、水不足による危険負担が大きいため、海水を活用する方案が必要である。地球上の水中の９７％は海水であり、この大変な量の海水を農業に用いれば、日照りと砂漠化を緩和させるだけでなく、新たな食糧資源を創出できる。このような点で、海水農業で栽培が可能な塩生植物は、水不足及び食糧不足の時代において栄養及び食糧難を解決する良い代案になる。

現在まで塩生植物は、主にサラダなどの料理の材料や植物性塩の代替材に用いられるものとして知られており、塩生植物の粉末や抽出物の機能性に関する多数の研究が報告されている。しかし、機能性食品や素材として開発されない理由は、高濃度の塩分を含有するため、塩代替材、塩味を有するソース及び醤油形態に利用すること以外にはその活用方式が非常に制限的であった。

韓国登録特許第１０−０７２４７０５号公報（鹹草抽出物を含む飲料用液状組成物）には、アッケシソウを含む塩生植物原料を抽出した後食品添加物などを混合して飲用するか、飲用液混合物を乾燥させるなどのアッケシソウを有効性分とする固形食品の製造方法と、製造された飲用食品を一定比率でこねることを特徴とする食品の製造方法などが開示されている。しかし、これらの製品は、脱塩されておらず塩化ナトリウムの含有量が高いため、添加量や摂取量に制限があり、有用性分を摂取するために塩生植物を多量摂取する場合、ナトリウムの過多摂取による高血圧や心血管系疾患などの発病の危険率が高まり、健康上の問題が生じ得る。

このような問題点を解決するために塩生植物内の塩分を除去する多くの脱塩方法が研究されているが、代表的なものを調べると、次のとおりである。

（１）韓国登録特許第１０−１２１８３５５号公報（赤色アッケシソウから天然食用色素であるベタシアニンの製造方法）には、赤色アッケシソウを抽出した後、これを電気透析により脱塩させ、脱塩された抽出溶液を乾燥して天然食用色素であるベタシアニンを製造する方法が開示されている。しかし、これは、赤く紅葉したアッケシソウから赤色素のみを得るためのものであり、アッケシソウが枯死する直前に葉緑体の破壊などの生理的変化により赤く紅葉したアッケシソウに限定し、電気透析時のナトリウム塩のほかに人体に有用なカリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄分などのミネラルと低分子の他の有用性成分が共に消失し得る。

（２）韓国公開特許第２００６−０１１００２３号公報には、鹹草を熱水またはエタノール抽出して得た抽出液粉末にでんぷんのりなどを混合して丸薬形態に製造する方法が開示されているが、熱水抽出物とエタノール抽出物内には鹹草内のすべての栄養成分を含むことができず、抽出物内に含有されている高濃度の塩分を脱塩させない問題がある。

（３）韓国登録特許第１０−１０９５６１９号公報（アッケシソウの低塩化方法及びその貯蔵方法）には、アッケシソウを０．５ｃｍ内外に切断し、０．１〜１．０％塩化ナトリウム溶液に混合撹拌して１０〜４０分間撹拌処理し、低塩化されたアッケシソウ抽出物を３５℃と５０℃とで貯蔵する方法が開示されている。しかし、これは、生草を切断した後に室温以上の高温で塩溶液に浸して長期間撹拌抽出するため、鹹草内の非水溶性食物繊維のほかに大部分の有機化合物が消失し、塩溶液による脱塩効果も大きくない問題がある。

（４）韓国登録特許第１０−１２８７０６５号公報（衛生性及び消化性が向上した鹹草粉末の製造方法）には、生鹹草を洗浄して搾汁した後、鹹草搾汁を９０〜１１０℃で５〜６０分殺菌し、搾汁液を５０℃〜７０℃に加温した後減圧して濃縮し、噴霧乾燥した粉末と残った搾汁残渣を酵素処理で分解した後、粉末化して混合する方法が開示されている。しかし、前記方法で製造された鹹草粉末には実質的な脱塩過程がないため、依然として高濃度の塩分が脱塩されないまま残存する。

そのほかに塩生植物以外の材料についても脱塩を研究したが、代表的なものを調べると、次のとおりである。

（１）韓国登録特許第１０−１２８９７６９号公報（脱塩乳の製造方法、脱塩乳）には、牛乳中に含まれている１価のミネラルを除去して脱塩乳を製造する方法であって、原料乳に含有されている１価のナトリウムを除去するため、牛乳を塩素型陰イオン交換樹脂に通過させて、膜分離法によって１価のミネラルを除去することを含む方法である。この方法は、非可溶性固形分がない液体状の試料にのみ適用が可能であり、陰イオン交換樹脂を通過した牛乳の酸性度が上がる問題と、陰イオン交換樹脂に吸着される非ミネラル性有機物質、例えば必須アミノ酸と、アルカロイドのようなイオン性を帯びる多様な種類の生理活性物質の消失を招く短所がある。

（２）電気透析法は、イオン成分を溶液から分離する工程であり、溶液中のイオン成分が電場にかけた電圧によって陽イオン交換樹脂膜と陰イオン交換樹脂膜とを選択的に通過して起きる物質伝達原理に理論的基礎を置いている方法である。また、逆浸透圧、限外濾過とともに最も多く用いる膜工程の一つとして電気的に荷電された膜を用いて脱塩を目的に主に用いられている。韓国登録特許第１０−０５６１１０３号公報（電気透析法による肝臓の低塩化方法）においては、電気透析前後の肝臓の塩度変化を見れば、２３．６７％から各々２０．４６％、１５．２％、１０．８１％までは減らしたが、電気透析による脱塩は、液状の試料を継続して循環させなければならないので、液体中の塩を完全に脱塩させることは不可能である。また、液体以外の試料は適用できない。

（３）電気透析法だけでなく限外濾過法もナトリウム塩のみを選択的に除去できず、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど有用なミネラルも同時に除去される短所がある。また、限外濾過は、試料内に存在する２００ｄａｌｔｏｎ以下の低分子有機化合物の消失並びに装備の維持及び管理に高コストが発生する短所がある。

（４）逆浸透は、半透過成膜（Ｓｅｍｉｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）で隔離された二つの溶液の間で溶媒が溶質の濃度が低い溶液から高い溶液の方に分離膜を通過して移動する現象をいう。このような移動の駆動力（ｄｒｉｖｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）は、溶質の濃度差によるｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌであり、溶媒の移動により溶質の濃度が高い溶液の方に作用する圧力を浸透圧という。逆に浸透圧より高い外部圧力をかければ溶媒は溶質の濃度が低い溶液の方に移動する。この現象を逆浸透と言う。逆浸透原理を用いて通常３０〜１００気圧の圧力勾配（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を、駆動力を適用して半透過成膜により各種塩や有機物質を分離することを逆浸透分離工程という。主に海水の淡水化、半導体産業用超純水の製造、各種産業用廃水処理などに応用されてきた。韓国公開特許第１０−２００５−０１２２４４７号公報では肝臓の濃縮及び低塩化のために逆浸透を用いた例があるが、単に溶質の濃度差勾配による脱塩であるので、溶液内にナトリウム塩のみを選択的に除去することはできず、他の有用性ミネラル、低分子性栄養素及び有機化合物が同時に除去されるので、塩生植物の脱塩技術として適用されることはできない。

（５）酒精を用いた塩蔵発酵食品の脱塩方法（韓国登録特許第１０−１１０２２５９号公報）においては、原料の０．５倍〜１０倍までの酒精を塩蔵発酵食品に添加して塩の溶解度を低下させて塩を析出させた後、物理的な方法により塩を除去したが、この方法では少しの塩は析出され得るが、塩の除去よりはアルコールの添加によるタンパク質の凝固変性沈殿と多糖類の溶解度減少による沈殿、特に多量の酸性多糖類と蛋白多糖類の沈殿が急激に起きるので、原料が有している栄養素の損失が非常に大きい。

これに、本発明者は、前記脱塩方法の問題点を解決するために、すなわち塩生植物内のカリウム、カルシウム、鉄分のような有用ミネラルと炭水化物、タンパク質のような栄養素とクロロフィル、ポリフェノール、フラボノイドのような有用生理活性物質の損失なしにナトリウム塩（ＮａＣｌ）成分のみを効果的に除去するために努力を重ねた結果、塩類の「温度変化による水に対する溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）差」（図１を参照）を用いた脱塩方法の考案に至った。すなわち、塩生植物乾燥粉末を低温で冷水（９℃以下）で短時間撹拌抽出時、実温水と熱水とで抽出時よりナトリウム塩を除いた有用ミネラルと有機可溶性成分の溶出は顕著に低く、ナトリウム塩の溶出は、大きな差はないことを確認し、脱塩された粉末は、脱塩前より特に食物繊維（ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ）の含有量とポリフェノール、フラボノイド、クロロフィルの含有量が顕著に増加することが確認ができた。そして、脱塩された塩生植物粉末の抽出物は、脱塩前より抗酸化、抗血栓、抗高血圧、抗糖尿活性などの機能性が顕著に増加することを確認した。また、塩生植物の脱塩過程中に得られる冷水撹拌抽出物は、既存のアッケシソウ塩とは異なり、塩化ナトリウム含有量が高くかつコクのあるすっきりとした塩味を出す１００％植物塩の代替物として活用できることを確認した。

肥満は、エネルギの過剰摂取、遺伝的感受性及び肉体的活動性の減少などによる一種の代謝性疾患であり、単に体重だけが増加するのではなく体内脂肪、すなわち体脂肪が増加する状態を言う。現代人の過度な栄養摂取による肥満は、深刻な社会経済的な健康問題の一つとして浮上しており、去る数世紀のあいだ主に先進国でその有病率が着実に増加してきたが、最近は韓国国内でも肥満人口が急激に増加している。また、肥満は、心血管系疾患、糖尿、非アルコール性肝炎、癌、痴呆、骨関節炎などのような代謝性疾患を誘発させる原因として知られているので、肥満は深刻な現代人の疾病に分類されている。また、肥満は、細胞内に酸化的ストレスを起こして脂肪組織でアディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌障害を招いて動脈硬化と糖尿などのような代謝症候群と虚血性心疾患なども招くものとして知られている。肥満を改善するための様々な予防や治療方法としては運動療法、食事療法、薬物療法及び手術など多様な方法があるが、肥満治療剤の化学合成物質は、肥満抑制効果は大きいが、副作用も多く現れると知られている。そのため、最近は安全でかつ副作用の危険性が少ない天然植物素材に対する関心が高まっており、特に脂肪の合成と脂肪細胞の分化を抑制するポリフェノール類と体内エネルギ代謝を活性化して体脂肪を減少する唐辛子のカプサイシンと脂肪の吸収を阻害して膨満感を与える植物食餌繊維質が代表的な抗肥満天然植物素材として知られてきた。

アッケシソウの抗肥満効能に関する先行研究は多数あるが、これら先行研究を整理すると、アッケシソウを水や含水エタノールを用いて抽出した抽出物と脱塩されていないアッケシソウ粉末を用いて実験し、試料に含まれている塩分の含有量によって（熱水抽出物の塩含有量：約５５〜６５％、含水エタノール抽出物の塩含有量約３０〜４０％、アッケシソウ粉末の塩含有量約３５〜４０％）高脂肪食餌で肥満を誘発させる肥満誘発対照群にアッケシソウ試料内に含有されている同量の塩を添加して実験を行った。これらの研究結果により得られたアッケシソウ試料の抗肥満効能は、原料内に含有された塩によって直接的な機能性原料として開発されず、抗肥満効能がある塩代替材として開発できることが提案されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， ２０１５， ９５：３１５０−３１５９）。

しかし、本発明で開発した塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、アッケシソウ内に含有された塩化ナトリウム成分のみを効果的に除去したので、先行研究の問題を克服できると判断し、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物を用いた肥満抑制効果を動物実験により確認しようとした。実験結果、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物において、抗肥満と体脂肪の減少効果が脱塩前の粉末より顕著に優れることを確認したので、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、肥満予防及び治療に効果的な機能性食品及び機能性飼料として開発できることを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、ナトリウム含有量は低く、不溶性食物繊維、炭水化物、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）、クロロフィル（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）など塩生植物固有の栄養成分及び機能性生理活性物質の含有量は高くなった塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物、脱塩抽出物及びこれらの製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、塩生植物の脱塩過程中に得られる塩生植物由来の冷水抽出塩代替物及びこれの製造方法を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物を含む抗肥満及び体脂肪減少用薬学組成物と機能性食品を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；（ｂ）撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する段階；及び（ｃ）脱塩された沈殿物を乾燥する段階を含む塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物の製造方法を提供する。

本発明はまた、乾燥重量でナトリウム含有量が０．０４〜６．８重量％であり、６１重量％以上の炭水化物を含むことを特徴とする塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物を提供する。

本発明はまた、（ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；（ｂ）撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する段階；（ｃ）脱塩された沈殿物を液状抽出して抽出物を回収する段階；及び（ｄ）回収した液状抽出物を乾燥する段階を含む塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物の製造方法を提供する。

本発明において、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物の製造方法は、脱塩された沈殿物の液状抽出段階の前に脱塩された沈殿物を乾燥する段階をさらに含むことを特徴とする。

本発明はまた、塩生植物の脱塩物から抽出され、乾燥重量で総塩含有量が１１．０重量％未満であり、不溶性食物繊維が３．２重量％未満であることを特徴とする塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物を提供する。

本発明において、前記塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、乾燥重量で０．１〜３．０重量％のカリウム（Ｋ）、０．１〜２．０重量％のカルシウム（Ｃａ）及び０．１〜１．５重量％のマグネシウム（Ｍｇ）を含むことを特徴とする。

本発明において、前記塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物は、乾燥重量で０．１〜１０．０重量％のポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）及び０．１〜７．０重量％のフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）を含むことを特徴とする。

本発明において、前記塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物は、乾燥重量で０．３〜１０．０重量％のクロロフィル（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）を含むことを特徴とする。

本発明において、前記塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、トランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする。

本発明はまた、（ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；（ｂ）撹拌物を遠心分離して上澄液を分離する段階；（ｃ）分離した上澄液を濃縮した後、活性炭を用いて精製する段階；及び（ｄ）精製濃縮液を噴霧乾燥する段階を含む塩生植物由来の冷水抽出塩代替物の製造方法を提供する。

本発明において、前記塩生植物由来の冷水抽出塩代替物は、総塩含有量が５０．０重量％以上であり、塩造成中のカリウムに対するナトリウムの重量比が１：１０．１〜１：１９．０であることを特徴とする。

本発明はまた、総塩含有量が５０．０重量％以上であり、塩造成中のカリウムに対するナトリウムの重量比が１：１０．１〜１：１９．０であることを特徴とする塩生植物由来の冷水抽出塩代替物を提供する。

本発明において、前記塩生植物由来の冷水抽出塩代替物は、０．１〜５０ｍｇ／ｇのグルタミン酸を含むことを特徴とする。

本発明はまた、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物または塩生植物由来のトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする抗肥満及び体脂肪減少用薬学組成物を提供する。

本発明はまた、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物または塩生植物由来のトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする抗肥満及び体脂肪減少用機能性食品を提供する。

本発明はまた、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物または塩生植物由来のトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする抗肥満及び体脂肪減少用飼料を提供する。

本発明による塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物または脱塩抽出物の製造方法は、「温度変化による塩類の水に対する溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）差」の原理を用いた冷水脱塩過程により塩生植物内のカリウム、カルシウム、マグネシウムのような有用ミネラルと炭水化物、タンパク質のような栄養素とクロロフィル、ポリフェノール、フラボノイドのような有用生理活性物質の損失なしに塩化ナトリウム成分のみを効果的に除去でき、除去された塩化ナトリウム溶液は、塩化ナトリウム含有量とグルタミン酸含有量が高いため、塩代替物として活用することができる。

本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する次の説明からさらに明確に理解されるであろう。
本発明の実施例による塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物、脱塩抽出物及び塩代替物の製造方法のフローチャートである。 「温度変化による塩類の水に対する溶解度（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」を示すグラフである。 本発明の一実施例によって行われた冷水脱塩前後のアッケシソウ粉末性状の写真である。 アッケシソウの脱塩前粉末、冷水脱塩された粉末及び熱水脱塩された粉末のクロロフィル含有量を比較した写真である。 本発明の一実施例による塩生植物の「脱塩前乾燥粉末の熱水抽出物」及び「冷水脱塩された乾燥粉末の熱水抽出物」の総ポリフェノール、総フラボノイド及び総タンパク質の含有量を比色定量した結果の写真である。 本発明の一実施例による塩生植物の「冷水脱塩前乾燥粉末の熱水抽出物」及び「冷水脱塩された乾燥粉末の熱水抽出物」の全糖及び酸性糖の含有量を比色定量した結果の写真である。 本発明の一実施例による塩生植物の「冷水脱塩前の熱水抽出物」及び「冷水脱塩後の熱水抽出物」の濃度による抗酸化活性を測定したグラフである。 本発明の一実施例による塩生植物の「冷水脱塩前の熱水抽出物」及び「冷水脱塩後の熱水抽出物」の濃度によるＡＣＥ阻害活性を測定したグラフである。 本発明の一実施例による塩生植物の「冷水脱塩前の熱水抽出物」及び「冷水脱塩後の熱水抽出物」の濃度によるα−グルコシダーゼ阻害活性を測定したグラフである。 高脂肪食餌誘発肥満ラットにおけるアッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）の体重減少効果を示すグラフである（ＮＣ：正常対照群、ＨＦＤ：高脂肪食餌肥満誘発対照群、ＨＦＤ＋ＳＰ２００：高脂肪食餌＋アッケシソウ粉末２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００：高脂肪食餌＋アッケシソウ脱塩粉末２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ＨＦＤ＋ＧＥ２００：高脂肪食餌＋ガルシニアカンボジア抽出物２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ｍｅａｎ±ＳＤ（ｎ＝１０），＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊：ｐ＜０．００１）。 高脂肪食餌誘発肥満ラットにおいて実験６週及び１２週目のアッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）の体重減少効果を示すグラフである（Ｇ１：正常対照群、Ｇ２：高脂肪食餌肥満誘発対照群、Ｇ３：高脂肪食餌＋アッケシソウ粉末２００ｍｇｋｇ^−１投与群、Ｇ４：高脂肪食餌＋アッケシソウ脱塩粉末２００ｍｇｋｇ^−１投与群、Ｇ５：高脂肪食餌＋ガルシニアカンボジア抽出物２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ｍｅａｎ±ＳＤ（ｎ＝１０），＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１，＃：ｐ＜０．０５，＃＃：ｐ＜０．０１）。 高脂肪食餌誘発肥満ラットにおいてアッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）の腹部脂肪（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｆａｔ）減少効果を示すグラフである（ＮＣ：正常対照群、ＨＦＤ：高脂肪食餌肥満誘発対照群、ＨＦＤ＋ＳＰ２００：高脂肪食餌＋アッケシソウ粉末２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００：高脂肪食餌＋アッケシソウ脱塩粉末２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ＨＦＤ＋ＧＥ２００：高脂肪食餌＋ガルシニアカンボジア抽出物２００ｍｇｋｇ^−１投与群、ＴＦＶ：全体腹部脂肪体積、ＶＦＶ：腹部内臓脂肪体積、ＳＦＶ：腹部皮下脂肪体積、ｍｅａｎ±ＳＤ（ｎ＝１０）．＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊：ｐ＜０．００１，＃：ｐ＜０．０５，＃＃：ｐ＜０．０１）。 アッケシソウ脱塩粉末含有指標成分であるトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）のＨＰＬＣ分析クロマトグラムである（Ａ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＤＳＰ−ＥＷ，Ｂ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ，Ｃ： Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＤＳＰ−ＥＷ；１：ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ，２：ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ，３：ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ，４：ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ−３−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）。 アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）から分離したトランス−フェルラ酸の３Ｔ３−Ｌ１培養細胞内の脂肪蓄積及び中性脂肪生成の抑制効果を示す写真とグラフである（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｔｅｓｔ．＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊：ｐ＜０．００１，＃：ｐ＜０．０５，＃＃：ｐ＜０．０１，＃＃＃：ｐ＜０．００１）。 アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）から分離したトランス−フェルラ酸を処理した３Ｔ３−Ｌ１培養細胞内ＳＲＥＢＰ１，ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ ａｎｄ ＦＡＳ遺伝子発現をＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲで分析した結果である（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｔｅｓｔ．＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊：ｐ＜０．００１，＃：ｐ＜０．０５，＃＃：ｐ＜０．０１，＃＃＃：ｐ＜０．００１）。

本発明では食物繊維、必須アミノ酸、植物性ミネラル、生理活性物質などを含有しているが、塩分含有量が高いため、活用が制限的な塩生植物乾燥粉末を「塩類の温度変化による水に対する溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）差の原理」を用いて低温で冷水で短時間の撹拌時、実温水と熱水とで抽出する時よりナトリウム塩を除いた有用ミネラルと有機可溶性成分の溶出を顕著に下げ、ナトリウム塩の溶出は室温と熱水抽出とを比較する時大きな差はないことを確認した。

本発明では、塩生植物に冷水、実温水及び熱水を各々添加して撹拌した後、遠心分離して上澄液を除去し、脱塩された抽出物を回収した後に乾燥して塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物を製造した。その結果、冷水で抽出時有機物の抽出を最小化し、かつ塩を効果的に除去できることを確認できた。

したがって、本発明は一観点において、（ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；（ｂ）撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する段階；及び（ｃ）脱塩された沈殿物を乾燥する段階を含む塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物の製造方法及び乾燥重量でナトリウム含有量が０．０４〜６．８重量％であり、６１重量％以上の炭水化物を含むことを特徴とする塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物に関するものである。

本発明において、前記塩生植物（ｈａｌｏｐｈｙｔｅ）とは、海辺、塩田周囲など塩基がある所で海水を食べて育つ植物であり、アッケシソウ（Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ ＳＰＰ．）、マツナ（Ｓｕａｅｄａ ａｓｐａｒａｇｏｉｄｅｓ）、七面草（Ｓｕａｅｄａ ｊａｐｏｎｉｃａ）などを例示できるが、これに限定されない。

前記塩生植物乾燥物は、洗浄により不純物を除去した塩生植物を乾燥したものであり、乾燥物そのものを用いることもできるが、より効率的な抽出のために粉末化したものを用いることが好ましい。

図１に示すように塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物を製造するためには、まず、塩生植物乾燥物を９℃以下、好ましくは０．１〜４℃の水に混合して撹拌する。前記水は、水道水、蒸留水など無塩水（ｎｏｎ−ｓａｌｉｎｅ ｗａｔｅｒ）を使用することが好ましい。仮に、撹拌温度が約１０℃以上である場合、０．１〜９℃条件に比べてナトリウム塩の溶出程度における大きな変化はないが、その他有機可溶性成分とカリウムなどミネラルの溶出が増大して脱塩乾燥物内の栄養素損失は大きくなる。

この時、塩生植物乾燥物は、溶媒１Ｌ当たり４０〜７０ｇを抽出させることが好ましい。仮に４０ｇ未満である場合は、溶媒量が過度に多くなり遠心分離処理量が増えて工程上非効率的であり、７０ｇを超える場合は、撹拌が効果的に行われない場合もある。

前記撹拌は１〜５分間行うことが好ましい。前記撹拌時間が１分未満である場合は、塩生植物の脱塩効果が低下し、５分を超える場合は、ナトリウム塩溶出のほかに可溶性有機成分の溶出が増加する問題がある。

撹拌後、撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する。

本発明において、沈殿物分離方法は、上澄液と沈殿物とを分離できるものであれば、特に制限なしに通常の方法で行ってもよい。例えば、遠心分離方式以外の濾過方式を用いて沈殿物を回収し得る。

本発明は、必要に応じて脱塩された沈殿物を対象に撹拌をさらに行い、残存する少量の塩分含有量をさらに下げることもできる。

最終的に脱塩された沈殿物を回収し、乾燥して塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物を製造し得る。

本発明による塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物の製造方法は、有用生理活性物質の損失なしに塩化ナトリウム成分のみを効果的に除去できるので、これによって製造された塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、ナトリウム含有量が０．０４〜６．８重量％であり、６１重量％以上の炭水化物と０．１〜３．０重量％のカリウム（Ｋ）、０．１〜２．０重量％のカルシウム（Ｃａ）、０．１〜１．５重量％マグネシウム（Ｍｇ）、０．１〜１０．０重量％のポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、０．１〜７．０重量％のフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）、０．３〜１０．０重量％のクロロフィル（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）を含み得る。

また、本発明では冷水で脱塩した塩生植物の脱塩された沈殿物または脱塩沈殿物の乾燥粉末を水またはエタノールで抽出したとき、脱塩されていない塩生植物の抽出物より塩含有量が顕著に減少し、機能性成分及び栄養素の含有量が顕著に増加した抽出物が得られることが確認できた。

したがって、本発明は他の観点において、（ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；（ｂ）撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する段階；（ｃ）脱塩された沈殿物を液状抽出して抽出物を回収する段階；及び（ｄ）回収した液状抽出物を乾燥する段階を含む塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物の製造方法及び塩生植物の脱塩物から抽出され、乾燥重量で総塩含有量が１１．０重量％未満であり、不溶性食物繊維が３．２重量％未満であることを特徴とする塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物を提供する。

塩生植物から脱塩された沈殿物を回収する方法は、前述したとおりであるが、生理活性機能性成分の溶出は、脱塩された沈殿物を水で抽出するか、脱塩された沈殿物を乾燥した後にメタノール、エタノール、ブタノール、エチルアセテート、アセトン、ジエチルエーテルなどの有機溶媒で抽出することで抽出物を回収し得る。このように有機溶媒で液状抽出を実施する場合、脱塩された沈殿物の液状抽出段階前に脱塩された沈殿物を乾燥する段階をさらに行うことが好ましい。

脱塩された塩生植物沈殿物の有機溶媒液状抽出は、室温や有機溶媒の揮発温度近くの還流抽出を用い得る。この時、脱塩された沈殿物は、抽出溶媒１Ｌ当たり４０〜７５ｇを抽出することが好ましい。仮に４０ｇ未満である場合は抽出溶媒のコスト増加の問題があり、７５ｇを超える場合は、抽出効率が低下する問題がある。このように液状抽出をさらに行う場合、抽出物の収率が高まる長所がある。

本発明によって製造された塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物は、総塩含有量が１１．０重量％であり、不溶性食物繊維が３．２重量％未満であることを特徴としており、０．１〜１０．０重量％のポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、０．１〜７．０重量％のフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）、０．３〜１０．０重量％のクロロフィル（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）を含み得る。

したがって、本発明の塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物は、生体内の抗酸化作用、抗血栓、抗高血圧、抗糖尿など多様な生理活性を有しており、食品、化粧品、医薬品などの原料として用い得る。

また、本発明の塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、有効性分としてトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）を含有して脂肪細胞の分化を抑制し、脂肪合成関連遺伝子の抑制能を有しており、脱塩前粉末より食物繊維を多量含有しており、抗肥満及び体脂肪減少能に優れる。

したがって、本発明はまた他の観点において、前記機能性が強化して脱塩された塩生植物乾燥物を含むことを特徴とする抗肥満及び体脂肪減少用薬学組成物と機能性食品及び飼料に関するものである。

一方、本発明では塩生植物乾燥粉末の冷水撹拌後、脱塩沈殿物を分離して残った上澄液は、塩化ナトリウムの含有量が高く、カリウム含有量が低くかつグルタミン酸含有量が高いため、すっきりとした塩味とコクを出す塩生植物由来の冷水抽出塩としての活用ができることを確認した。

したがって、本発明はまた他の観点において、（ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；（ｂ）撹拌物を遠心分離して上澄液を分離する段階；（ｃ）分離した上澄液を濃縮した後、活性炭を用いて精製する段階；及び（ｄ）精製濃縮液を噴霧乾燥する段階を含む塩生植物由来の冷水抽出塩代替物の製造方法及びこれから製造された総塩含有量が５０．０重量％以上であり、塩造成中のカリウムに対するナトリウムの重量比が１：１０．１〜１：１９．０であることを特徴とする塩生植物由来の冷水抽出塩代替物に関するものである。

脱塩沈殿物を回収して残った冷水撹拌上澄液は、塩度（ｓａｌｉｎｉｔｙ）１５％〜１９％、総固形分含有量２０％以上で濃縮できるので、濃縮液の総固形分含有量に対して３〜５％の活性炭を用いて精製して噴霧乾燥することにより塩生植物由来の冷水抽出塩に製造できるが、精製時に使用される活性炭の濃度を用いて有機物の含有量と塩の色度を調節できる。
前記冷水撹拌上澄液の濃縮は、上澄液を濃縮できるものであれば、特に制限されないが、真空濃縮を用いることが好ましい。

（実施例）
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためであり、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されるものとして解析されないことは当業界における通常の知識を有する者に自明である。

実施例１：冷水抽出によるアッケシソウ脱塩効果の測定
アッケシソウ乾燥粉末１００ｇにそれぞれ２Ｌの冷水（４℃及び９℃）、実温水（２０℃）、熱水（１００℃）を添加して抽出し、低温及び室温は、各々４℃及び９℃、２０℃の温度条件で撹拌（３００ｒｐｍ）し、熱水抽出は１００℃還流冷却器を用いた。

脱塩効果を極大化できる最適条件を見つけるために５分間隔で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）を行い、上澄液を減圧濾過（０．４５μｍ）した後、塩度（ＡＴＡＧＯ ＥＳ−４２１，ＡＴＡＧＯ Ｃｏ．ＬＴＤ．Ｊａｐａｎ）及びブリックス（ＡＴＡＧＯ ＰＡＬ−１，ＡＴＡＧＯ Ｃｏ．ＬＴＤ．Ｊａｐａｎ）を測定した。また、上澄液を減圧濃縮した後に凍結乾燥（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−２２００，ＥＴＥＬＡ、Ｊａｐａｎ）して総固形分含有量を測定し、総固形分に対して塩及び塩除外固形分の含有量とともに表１に示した。

表１から温度変化による時間別塩の溶出程度は、ほとんど差がないことを確認した。参照までに図２は「温度の変化による塩類の水に対する溶解度（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」に関するものであり、ＮａＣｌの溶解度は、水の温度変化と無関係の結果と一致する。

１００ｇのアッケシソウ乾燥粉末を４℃、９℃、２０℃、１００℃の水（２Ｌ）で抽出した時、抽出３０分の場合、すべての温度において溶出される塩の量は、ほとんど同一（２８．５ｇ、２８．６ｇ、２８．７ｇ、２８．９ｇ）であることから３０分以内にアッケシソウに含有された塩はすべて溶出されたものと見ることができる。

しかし、塩を除いた可溶性有機固形分は、温度差による溶出の効果が非常に大きいため、抽出３０分を基準において室温（２０℃）抽出は、冷水抽出（４℃）の２．４７倍、熱水抽出（１００℃）は、冷水抽出（４℃）より３．２８倍高かった。

本発明では理想的な脱塩効果の指標として可溶性固形分含有量（Ｂｒｉｘ％）／塩度（％）指数を測定した。すなわちブリックス／塩度比が低いほど脱塩による有機固形分の損失が少ないと判断でき、すべての温度区間において時間が経つほど前記指数が徐々に増加することがわかった。

また、Ｂｒｉｘ／塩度指数の差は、０．１℃〜９℃で冷水抽出する場合は１．２６〜１．３６以下で指数値が低く、差が緩慢であったが、２０℃以上で抽出する場合は１．５〜２．０２であって、指数が１．５以上で高く、抽出温度に応じて徐々に増加したので、脱塩を目的とする抽出時には９℃以下でなるべく短時間内に実施することが好ましいことがわかった。すなわち、４℃以下の冷水で４分以内に抽出する場合、有機物の抽出を最小化しながら塩を効果的に除去できることが確認できた。

実施例２：脱塩されたアッケシソウ、マツナ及び七面草由来の脱塩栄養組成物の製造
アッケシソウ、マツナ、七面草の塩生植物を対象に脱塩栄養組成物を製造した。韓国国内で自生する絶対塩生植物として知られているアッケシソウ、マツナ及び七面草の生草を各々水道水で洗浄して凍結乾燥して粉末化した。実施例１の結果において、４℃以下の冷水で４分以内に抽出する場合、有機物の抽出を最小化し、かつ塩を効果的に除去できることが確認できたので、乾燥粉末それぞれ１００ｇに冷水（４℃）２Ｌを加え、４℃で４分間撹拌後遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）して塩分含有量が高くなった上澄液を除去して脱塩された沈殿物を回収した。次に、回収したそれぞれの沈殿物を同様の方法により１回さらに脱塩を行い、残存ナトリウム塩を最小化し、回収した沈殿物を凍結乾燥して塩生植物の脱塩栄養組成物（脱塩粉末）を回収した。

実験例１：塩生植物の脱塩栄養組成物の成分分析
脱塩前塩生植物乾燥粉末（アッケシソウ、マツナ及び七面草）、実施例２で製造されたアッケシソウ、マツナ、七面草の脱塩栄養組成物（脱塩粉末）のナトリウム、栄養成分及び機能性成分を各々測定して表２に示した。カロリー、炭水化物、タンパク質の分析は、韓国食品公典上の一般試験法を用いて行い（韓国機能性食品工業協会）、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄分、カルシウムは、硝酸を使用した酸分解を用いる湿式分析法を行った後、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて分析した。

そのほかにポリフェノール、フラボノイド及びクロロフィルの分析方法は次のとおりある。

１−１：総ポリフェノール含有量の分析
総ポリフェノール含有量は、Ｆｏｌｉｎ−Ｄａｖｉｓ方法を修正して９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅで行った。脱塩前後の塩生植物粉末を７０％メタノールで抽出し、乾燥させた試料を多様な濃度で蒸留水に溶かした試料液２０μＬに２５０μＬの２％炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）を混合し、１５μＬの５０％Ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）溶液を加えて室温で３０分放置した後７２５ｎｍで吸光度をマイクロリーダー（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、ｘ−Ｍａｒｋ、ＵＳＡ）で測定した。標準試薬として０〜５００μｇ／ｍＬのタンニン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）溶液を試料の代わり反応させて得た検量曲線から抽出試料に含有されている総ポリフェノール含有量を計算した。

１−２：総フラボノイド含有量の分析
総フラボノイド含有量は、Ａｂｄｅｌ−Ｈａｍｅｅｄ方法を修正して９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅで行った。脱塩前後の塩生植物粉末を７０％メタノールで抽出し、乾燥させた試料を多様な濃度の蒸留水に溶かした試料液３０μＬに９０％ジエチレングリコール（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）２００μＬを添加し、再び１Ｎ ＮａＯＨ ５μＬを入れて３７℃で１時間反応後、４２０ｎｍで吸光度をマイクロリーダー（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、ｘ−Ｍａｒｋ、ＵＳＡ）を用いて測定した。標準試薬としては０〜５００μｇ／ｍＬのｒｕｔｉｎ（ＳｉｇｍａＣｏ．，ＵＳＡ）を用いて試料の代わり反応させて得た検量曲線から抽出試料に含有されている総フラボノイド含有量を計算した。

１−３：総クロロフィルの分析
脱塩前後の塩生植物粉末１ｇを８０％アセトン（５０ｍＬ）で室温で色がなくなるまで抽出して上澄液を分離し、６４５ｎｍと６６３ｎｍとでそれぞれの吸光度（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、ｘ−Ｍａｒｋ、ＵＳＡ）を測定した後、次の算式によってｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ、ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｂ、ｔｏｔａｌ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌの含有量を求めた。
chlorophyll a (mg/mL) = 12.72OD663 - 2.58OD645
chlorophyll b (mg/mL) = 25.88OD645 - 5.50OD663
Total chlorophyll (mg/mL) = 7.22OD663 + 20.3OD645

表２から脱塩後の塩生植物は、脱塩前より炭水化物及び粗タンパクの含有量が増加しており、脱塩の主な成分はナトリウム（Ｎａ）であり、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄などのミネラルは、ナトリウムが抜けた分だけその含有量が高くなったことが確認できた。

また、塩生植物由来の有用生理活性を期待できるクロロフィル、ポリフェノール、フラボノイド類の化合物が大幅に増加して脱塩された塩生植物粉末は、有用生理活性物質が増加した機能性栄養組成物として活用できることが確認できた。

参照までに図３は、冷水脱塩前後のアッケシソウ粉末を同量（５ｇ）で重量を計り、性状を示す写真であり、塩生植物乾燥粉末を短時間冷水抽出する場合、脱塩時クロロフィルの成分はほとんど溶出されずに残存しており、脱塩によって粉末が軽くなって体積が増加した結果を示す。

また、図４は、アッケシソウの脱塩前粉末、冷水脱塩された粉末及び熱水脱塩された粉末のクロロフィル含有量を比べた写真である。クロロフィルは光合成植物組織である葉緑体に多量に入っている緑色色素であり、タンパク質に弱く結合されている。化学的にポルフィリン（テトラピロール）核中央にマグネシウム（Ｍｇ）が入っており、酸基に長鎖の炭化水素が連結されている疎水性化合物である（Ｒｕｄｉｇｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｓｃｈｏｃｈ， Ｓ．，「Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓ」， Ｉｎ： Ｐｌａｎｔ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ， １９８８． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）。したがって、脱塩前の乾燥粉末より冷水脱塩された粉末内には冷水に溶出されずにそのまま残存するクロロフィルの含有量がさらに高いと判断される。

クロロフィルは、健康機能食品告示型機能性原料に登録されている抗酸化及び免疫増進機能性物質であるので、冷水脱塩された塩生植物粉末は、機能性が強化した栄養組成物として活用できる。しかし、クロロフィルは、熱に不安定であるため、容易に分解されるので、熱水で脱塩された粉末の場合、クロロフィルの含有量は顕著に低くなる。

実施例３：塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物（熱水抽出物、エタノール抽出物）の製造
実施例２で製造された塩生植物（アッケシソウ、マツナ、七面草）由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物（脱塩粉末）それぞれ１００ｇに蒸留水２Ｌを加え、１００℃で２時間還流冷却抽出を行った後、遠心分離、減圧濾過及び減圧濃縮した後、凍結乾燥して塩生植物由来の機能性が強化した脱塩熱水抽出物を回収した。

また、実施例２で製造された塩生植物（アッケシソウ、マツナ、七面草）の脱塩栄養組成物（脱塩粉末）それぞれ１００ｇに９５％エタノール２Ｌを加えて７５±１℃で２時間還流冷却抽出を行い、放冷した後遠心分離してその上澄液を減圧濾過及び減圧濃縮した後、凍結乾燥して塩生植物由来の機能性が強化した脱塩エタノール抽出物を回収した。

比較例１：脱塩前塩生植物の熱水抽出物及びエタノール抽出物の製造
実施例２で製造された塩生植物（アッケシソウ、マツナ、七面草）由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物（脱塩粉末）の代わりに脱塩されていない塩生植物（アッケシソウ、マツナ、七面草）を使用したことを除いては実施例３と同様の方法により熱水抽出物及びエタノール抽出物を製造した。

実験例２：熱水及びエタノール抽出物の成分調査
比較例１及び実施例３で製造された試料を対象に全糖（炭水化物）は、ｐｈｅｎｏｌ−ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ法を修正して（Ｋｗｅｏｎ ｅｔ． ａｌ， １９９６． Ａｇｒｉｃ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３９． １５〜１６４）適用し、酸性糖は、ｍ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｄｉｐｈｅｎｙｌ法（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ．ａｌ．１９７３．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４．４８４〜４８９）を用いて定量した。総ポリフェノール、総フラボノイド及び総クロロフィルの含有量は、実験例１と同様の方法により３回繰り返し実験を行った。脱塩前後の塩生植物熱水及びエタノール抽出物の成分分析結果は、表３及び表４に示した。

表３において、比較例１の脱塩されていないアッケシソウ、マツナ及び七面草の熱水抽出物は、５５．８〜６２．０％の総塩と２５．８〜３３．３％の炭水化物、１．６〜２．１％の不溶性食物繊維（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ）で構成されていることが明らかに示された。また、酸性糖含有量は、１１．６〜１７．８％で分析されて一般植物より比較的酸性糖含有量が高く含有されていることがわかり、これは、酸性多糖類の構成糖としてグルクロン酸とガラクツロン酸が主に存在することを意味する。

実施例３の冷水脱塩された乾燥粉末の熱水抽出物は、比較例１（脱塩前乾燥粉末の熱水抽出物）と比較すると、総塩含有量が約９０％以上顕著に減少し、全糖含有量（５１．０〜６３．０％）と特に総酸性糖含有量（２２．２〜３２．８％）が顕著に増加されたことが確認できた。多糖類のうち特に酸性多糖類が免疫強化、抗凝固及び抗血栓、抗癌活性に優れるものとして多く報告されているので、冷水脱塩により得られる塩生植物粉末の熱水抽出物は、高濃度で存在する酸性多糖類によって機能性が強化した優れた栄養組成物として活用できる。また、比較例１（脱塩前乾燥粉末の熱水抽出物）と比較時５０〜１００％以上増加された総ポリフェノール（〜４０．８ｍｇ／ｇ）、総フラボノイド（〜３１．０ｍｇ／ｇ）及び総タンパク質（〜１５．９重量％）を含有している。

表４において、比較例１の脱塩されていないアッケシソウ、マツナ及び七面草のエタノール抽出物は、相当な含有量（３０．６〜３５．４％）の総塩と１６．３〜１８％の炭水化物、０．１４〜０．１８％の不溶性食物繊維（ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ）で構成されていることが示された。総中性糖含有量は、６．５〜１０．３％であり、総酸性糖含有量は、５．９〜８．８％で分析されて熱水抽出物（表３）よりは糖類の含有量が低い水準であることが示された。

実施例３の冷水脱塩された乾燥粉末のエタノール抽出物は、比較例１（脱塩前乾燥粉末のエタノール抽出物）と比較すれば、総塩含有量は、約９０％以上顕著に減少し、総中性糖と総酸性糖の含有量は、顕著に増加していることが確認できた。特に、エタノール抽出物には熱水抽出物と比較してポリフェノール、フラボノイド及びクロロフィルの含有量が多量含有されており、比較例１（脱塩前乾燥粉末のエタノール抽出物）と比較して顕著に増加した総ポリフェノール（７６．７〜９０．８ｍｇ／ｇ）、総フラボノイド（５２．６〜６６．４ｍｇ／ｇ）及び総クロロフィル（８５．３〜９８．２ｍｇ／ｇ）を含有していることを確認した。

したがって、本発明の塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物と脱塩抽出物の製造方法は、「温度変化による塩類の水に対する溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）差」を用いた冷水脱塩により塩分（ＮａＣｌ）は効果的に除去し、かつ有用植物機能性化合物は溶出されず、相対的にその含有量を顕著に増加させることができるので、本発明の塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物と脱塩抽出物は、機能性が強化した優れた栄養素材として活用できることがわかった。

実験例３：塩生植物熱水抽出物の薬理活性の確認
比較例１及び実施例３で製造された脱塩前後の塩生植物熱水抽出物（試料）の抗酸化、抗血栓、ＡＣＥ阻害及びα−グルコシダーゼ活性を３回繰り返し実験を行い、その結果を表５及び図７〜９に示した。

３−１：抗酸化活性
抗酸化活性は、Ｂｌｏｉｓの方法（Ｃｈｅｎ， ｅｔ． ａｌ．， １９９９． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４７． ２２２６−２２２８）に従い１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ、ＳｉｇｍａＣｏ．，ＵＳＡ）を用いて測定した。

すなわち、ＤＰＰＨ４ｍｇをエタノール５０ｍＬに溶かしてＤＰＰＨ溶液を作った後９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに１８０μＬを加えて試料を（２５、５０及び１００μｇ／ｍＬ）の濃度で添加し、５秒間混合した後２０分間室温で反応させ、５１７ｎｍで試料を加えない対照群に対する吸光度の減少を遊離ラジカル消去活性（％）で示した。５０％の遊離ラジカルを消去するのに必要な物質の濃度をＩＣ_５０値で示し得、この値が低いほど抗酸化活性が強いことを意味する。

人体細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）と代謝過程中に生成される遊離ラジカルが過度に増加された場合は、生体内の各部位に酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）を誘発させて細胞内の恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持し難くし、多様な疾病、すなわち癌を始めとする脳卒中、パーキンソン病などの脳疾患と心臓疾患、虚血、動脈硬化、皮膚疾患、消化器疾患、炎症、リウマチ、自己免疫疾患などの各種疾病及び老化を起こすことが知られている。したがって、活性酸素を除去させるか、遊離ラジカル生成を抑制させる抗酸化成物質は、細胞内の酸化ストレスによる各種疾患発生の予防、疾患治療及び皮膚老化抑制の目的に用いることができる。

アッケシソウを始めとした塩生植物において既に様々な種類のポリフェノール及びフラボノイド系抗酸化成化合物が分離報告されている。図７において、実施例３で製造された試料（冷水脱塩後の熱水抽出物）は、比較例１で製造された試料（冷水脱塩前の熱水抽出物）より強力な抗酸化活性（アッケシソウ冷水脱塩前の熱水抽出物１００μｇ／ｍＬ、３４．７％阻害→冷水脱塩後７９．１７％阻害により約２．３倍増加）を示すことが確認できた。これは、前記表３及び図５で冷水脱塩前後の塩生植物粉末の熱水抽出物に存在する総ポリフェノール及び総フラボノイドの含有量の変化と密接な相関性を示す結果である。

３−２：抗血栓活性
抗血栓活性評価の一環として血液凝固阻害活性を従来報告された方法に従い評価し（Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｋｏｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎ ３５． ５２−６１； Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｊ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １４． ５０９−５１３； 類など２０１０． Ｊ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０． ９２２−９２８）、プロトロンビン時間とａＰＴＴを測定した。血漿は、市販のｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍａ（ＭＤＰａｃｉｆｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ， Ｈｕａｙｕａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｒｅａ， Ｃｈｉｎａ）を用いた。プロトロンビン時間とａＰＴＴ測定法は、次のとおりである。

３−２−１：プロトロンビン時間（ＰＴ：ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ）
標準血漿（ＭＤ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｃｈｉｎａ）３０μＬと多様な濃度（２．５及び５．０ｍｇ／ｍＬ）の試料液５μＬをＧｅｎｉｕｓ Ｓｅｍｉ−ａｕｔｏ Ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ ＣＡ ５１−５２（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）のチューブに添加して３７℃で３分間加温後、４０μＬのＰＴ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄｉａｇｏｎ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を添加して血漿が凝固する時までの時間を４回繰り返した実験の平均値で示す。陽性対照群としては、アスピリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を使用し、溶媒対照区としては、試料の代わりＤＭＳＯを使用した。ＤＭＳＯの場合、１８．１秒の凝固時間を示し、プロトロンビン阻害活性は、試料添加時の凝固時間を溶媒対照区の凝固時間で割った値（Ｔｓ／Ｔｃ）であり、表５に示した。

３−２−２：ａＰＴＴ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ）
血漿３０μＬと多様な濃度（２．５及び５．０ｍｇ／ｍＬ）の試料抽出液５μＬをＧｅｎｉｕｓ Ｓｅｍｉ−ａｕｔｏ Ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ ＣＡ ５１−５２（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）のチューブに添加して３７℃で３分間加温後、２０μＬのａＰＴＴ ｒｅａｇｅｎｔｔ（Ｄｉａｇｏｎ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を添加し、再び３７℃で３分間処理した。その後２０μＬ ＣａＣｌ_２（３５ｍＭ）を添加した後血漿が凝固する時までの時間を測定した。溶媒対照区としては、試料の代わりＤＭＳＯを用い、この場合の凝固時間は５８．０秒であった。ａＰＴＴの結果は、４回繰り返した実験の平均値で示し、血液凝固因子の阻害活性は、試料添加時のａＰＴＴ時間を溶媒対照区のａＰＴＴ時間で割った値（Ｔｓ／Ｔｃ）であり、表５に示した。

人体の構成成分である血液は、酸素、栄養分、老廃物の運搬機能と緩衝作用、体温維持、浸透圧調節及びイオン平衡維持、水分の一定維持、液性調節作用、血圧の維持及び調節、生体防御など多様な重要機能を有している。正常な血液循環は、体内における血液凝固反応系と血栓溶解反応系とが相互補完して調節されて血液循環を容易にし、そのうち血液凝固反応系の機作は、血管壁に血小板が粘着、凝集して血小板血栓を形成した後、血液凝固系が活性化されて血小板凝集塊を中心にフィブリン血栓が形成されるものとして知られている。トロンビンの活性阻害物質は、過多な血液凝固異常により発生する多様な血栓性疾患に非常に有用な予防及び治療剤として使用できる。一方、内因性血栓生成経路にはＸＩＩ因子、ＸＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子の順次活性化によってプロトロンビンの活性化が最終的にトロンビンを活性化するものと知られており、血液凝固因子の特異的阻害も重要な血栓性疾患治療剤開発のターゲットになっている。

表５に示すように、比較例１で製造されたアッケシソウ試料（冷水脱塩前の熱水抽出物）は、５ｍｇ／ｍＬ濃度で対照群に対してプロトロンビン阻害活性を１．０８倍、ａＰＴＴ阻害活性を１．２１倍増加させたが、実施例３で製造されたアッケシソウ試料（冷水脱塩後の熱水抽出物）は、同一濃度で各々１．８５倍、２．２２倍増加した優れた抗血栓活性を示した。

３−３：ＡＣＥ阻害活性
ＣｕｓｈｍａｎとＣｈｅｕｎｇの方法を一部変形し、次のようにＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ ＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ）阻害活性を測定した。試料５０μＬにＲａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ ａｃｅｏｎｅ ｐｏｗｄｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｇを１０ｍＬの０．３Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ ほう酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）溶液に溶解したＡＣＥ上澄液２５μＬ（２．５ｕｎｉｔ）と０．３Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ ほう酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．３）５０μＬ、多様な濃度（０．２５、０．５及び１．０ｍｇ／ｍＬ）の試料溶液２５μＬを混合して３７℃温度下で１０分間プレインキュベーション（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた。

ここに基質としてＨｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ溶液５０μＬを加えた後、再び３７℃温度下で３０分間反応させた後、１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）１００μＬを加えて反応を停止させた。ここにエチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）１ｍＬを加えて１分間ポルボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、３，０００Ｇで１５分間遠心分離後、分離したエチルアセテート上層液（抽出物）０．８ｍＬを得た。この上層液をフード内で加温させて完全に揮発させた後、同一条件のほう酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬを加えて溶解させて２２８ｎｍで吸光度を測定してＡＣＥ阻害活性を計算し、その結果を図８に示した。陽性対照群としてカプトプリル（Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）０〜１μｇ／ｍＬを使用した。

アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ｉ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ＡＣＥ）は、デカペプチド（ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）であるアンジオテンシンＩからジペプチド（ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を切断することによって、血管収縮作用を有するアンジオテンシンＩＩに転換させる役割を果たす。アンジオテンシン変換酵素によって生成されたアンジオテンシンＩＩの増加は、強い血圧相乗作用と抗利尿ホルモンであるアルドステロンの分泌を促進し、水とナトリウムの排泄を抑制して循環血液量を増加させることで高血圧を起こす。また、アンジオテンシン変換酵素は、血管弛緩作用をするブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）を分解して不活性化させることで、結果的に血圧上昇を誘発する役割をする。したがって、アンジオテンシン変換酵素の活性を抑制することで、血管収縮を防いで血圧降下効果を示し得るので、ＡＣＥ阻害活性を示す化合物は、高血圧治療剤または予防物質として開発できることを意味する。

図８に示すように、比較例１で製造された塩生植物試料（冷水脱塩前の熱水抽出物）は、１ｍｇ／ｍＬの処理濃度においていずれも３０％以下の低いＡＣＥ阻害活性を示すが、実施例３で製造された塩生植物試料（冷水脱塩後の熱水抽出物）は、同一濃度においていずれも顕著に増加したＡＣＥ阻害活性（アッケシソウ６５．３％、マツナ５９．７％、七面草５６．９％）を示す。これは、塩生植物の粉末を冷水で短時間脱塩させる場合、ＡＣＥ阻害活性物質は、そのまま残存して高い割合で存在することを意味し、その結果、抗高血圧機能性が強化した栄養組成物として用い得ることを示唆する。

３−４：α−グルコシダーゼ（α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）阻害活性
小腸粘膜のｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒに分布している炭水化物消化酵素であるｍａｌｔａｓｅ、ｓｕｃｒａｓｅ、ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅは、α−グルコシダーゼ（α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）であり、この酵素の過度な活性を阻害することで、二糖類、多糖類が単糖類に分解される過程を抑制して食後の過度な血糖上昇を遅らせる効果を示す。したがって、この酵素の活性阻害は、抗糖尿効能を測定する道具として使われる。

酵素活性測定は、Ｏｖｅの方法（Ｏｖｅ， Ｎ．； Ｃｏｗｅｌｌ， Ｇ．Ｍ．； Ｔｒａｎｕｍ−Ｊｅｎｓｅｒ， Ｊ． Ｈａｎｓｅｎ， Ｏ．； Ｗｅｌｉｎｄｅｒ， Ｋ．Ｇ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：１２３０６−１２３０９， １９８６）を一部修正して実験した。
酵素反応は、９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに多様な濃度（０．２５，０．５及び１．０ｍｇ／ｍＬ）で調剤された２０μＬ試料液、２０μＬのα−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）（２Ｕｉｎｔ／ｍＬ）及び１８０μＬの１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７）を３７℃で１０分間プレインキュベーション後、３０μＬの２０ｍＭ ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ基質溶液を加えて３７℃で３０分間反応させた。α−グルコシダーゼ抑制活性は、９６−反応液（１８０μＬ）にグルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ）を加えて生成される過酸化水素をｏ−ジアニシジン（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）と反応させて生成される色素物質を５４０ｎｍで比色定量して試料を添加しない対照群と比較して計算した。陽性対照群としてアカルボース（Ａｒｃａｂｏｓｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）０〜１０μｇ／ｍＬを使用した。
Inhibiton of α-Glucosidase Activity (%) = (1-As/Ac) × 100 (%)
Ac: 540 nm absorbance of control
As: 540 nm absorbance of sample

哺乳類のα−グルコシダーゼは、小腸粘膜絨毛内に存在する消化酵素であって、体内に入ったオリゴ糖類、多糖類形態の炭水化物の単糖類への加水分解を促進し、糖が体内に吸収するようにする。α−グルコシダーゼの作用が増加して分解されたブドウ糖が増加すれば、血糖数値が高くなって高血糖状態を招く。α−グルコシダーゼ抑制剤は、小腸内で炭水化物の消化を遅らせ、食後の血糖数値の増加を弱化させて、高血糖によるインシュリン分泌を遅らせることに効果的である。

商業的に利用可能なα−グルコシダーゼ抑制剤としては、アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）などがあり、これらは第２型糖尿病の治療に使用されており、アッケシソウ抽出物から単離された抗酸化性フラボノイド配糖体であるｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅが抗糖尿効果があると報告されている。

図８に示すように、比較例１で製造された塩生植物試料（冷水脱塩前の熱水抽出物）は、約１５．２〜４０．２％の阻害活性を示したが、実施例３で製造された試料（冷水脱塩後の熱水抽出物）は、１ｍｇ／ｍＬの処理濃度でアッケシソウ７０．８％、マツナ７６．３％、七面草６５．２％の阻害率で顕著に増加したα−グルコシダーゼ阻害活性を示した。これは、塩生植物の粉末を冷水で短時間脱塩させる場合、主にフラボノイド配糖体とサポニン形態で存在する可能性が高いα−グルコシダーゼ阻害活性物質は、そのまま残存して高い割合で存在することを意味し、その結果、抗糖尿機能性が強化した栄養組成物として用い得ることを示唆する。

実施例４：塩生植物由来の冷水抽出塩代替物の製造
塩生植物乾燥粉末（アッケシソウ、マツナ、七面草）それぞれ１００ｇに冷水（４℃）２Ｌを加え、４分間撹拌（３００ｒｐｍ）後遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）して塩分の含有量が高くなった上澄液を分離して脱塩された沈殿物を回収した。次に、回収したそれぞれの沈殿物を同様の方法により１回さらに脱塩を行い、脱塩された沈殿物を回収して残った冷水撹拌上澄液を最初に得られた上澄液と混合した後、９０℃で塩度（ｓａｌｉｎｉｔｙ）が１８〜１９％、総固形分含有量が２６〜２８％程度水準まで真空濃縮した。次に、濃縮液の総固形分含有量に対して５％の活性炭を用いて精製し、噴霧乾燥（ＥＹＥＬＡ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ ＳＤ１−１０００，Ｊａｐａｎ）して塩生植物由来の冷水抽出塩代替物を得た。得られた塩生植物由来の冷水抽出塩代替物の総塩含有量、陽イオン及びグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）の含有量を測定し、その結果を表６に示した（韓国食品工業協会研究所の分析）。

製造された冷水抽出塩代替物は、アッケシソウ熱水抽出塩（韓国登録特許第１０−０７８４２２９号公報）と比較して有機物含有量は低いが、塩化ナトリウム及びグルタミン酸の含有量が高く、コクのあるすっきりとした味を出す特徴を示し、特に陽イオン中のナトリウム（Ｎａ）とカリウム（Ｋ）との割合が１０：１以上で高い特徴を示した。これは、短時間の冷水撹拌により塩類の溶解度において水温度に影響を受けないナトリウムのみ容易に溶出され、残りの陽イオンは、脱塩粉末内にそのまま残存していることがわかる（表２を参照）。また、グルタミン酸の含有量が既存の熱水抽出塩より顕著に高いことが確認できる。これはグルタミン酸が水に非常によく溶ける酸性水溶性アミノ酸であるので、短時間の冷水撹拌条件でも他のアミノ酸を含む有機物とは異なって容易に溶出されただけでなく、精製過程中の活性炭に吸着されない極性を有する化合物であることがわかった。したがって、本発明により塩生植物の塩化ナトリウム成分のみが効果的に除去され、機能性に優れる塩生植物の脱塩栄養組成物を獲得すると同時に脱塩残余物からコクのあるすっきりとした塩味の純植物性塩を製造でき、塩生植物を１００％活用する画期的な方法であるといえる。

実験例４：塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物の抗肥満効果の確認
表２において塩生植物が脱塩により脱塩栄養組成物（脱塩粉末）内に総炭水化物の含有量が約１．８５倍〜２．０６倍増加することを確認したが、この炭水化物を分析した結果、アッケシソウ、マツナ、七面草粉末の炭水化物は、大部分約９５％以上が食物繊維（ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ）で構成されていることを確認した。表７に塩生植物粉末内の食物繊維含有量の脱塩前後を比較して示す。食物繊維の含有量は、可溶性及び不溶性食物繊維をすべて含む含有量である（韓国食品工業協会研究所の分析）。

したがって、本発明では食物繊維とポリフェノール及びフラボノイドが豊富な脱塩されたアッケシソウ脱塩栄養組成物（脱塩粉末）の抗肥満効能を検討した。

実験例４−１．高脂肪食餌で誘導されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ肥満モデルにおけるアッケシソウ脱塩栄養組成物の体重減少効果の確認

冷水撹拌脱塩によりナトリウム含有量は９５％以上除去され、食物繊維、ポリフェノール及びフラボノイドが豊富なアッケシソウ脱塩粉末（脱塩栄養組成物）の抗肥満効能を確認するために高脂肪食餌で誘導されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ肥満モデルにおいて実施例２で製造されたアッケシソウ脱塩粉末（Ｄｅｓａｌｔｅｄ Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ Ｐｏｗｄｅｒ、ＤＳＰ）と、比較群として脱塩されていないアッケシソウ粉末（Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ Ｐｏｗｄｅｒ、ＳＰ）と、陽性対照群として現在市販の天然抗肥満素材であるガルシニアカンボジア根抽出物（Ｇａｒｃｉｎｉａ Ｅｘｔｒａｃｔｓ、ＧＥ）を使用した。実験ラットは、グループ当たり１０匹で構成された五個のグループに分け、次のように構成した。（Ｇ１：正常対照群、Ｇ２：高脂肪食餌投与−肥満誘発対照群、Ｇ３：アッケシソウ粉末（ＳＰ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｇ４：アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｇ５：陽性対照群、ガルシニアカンボジア抽出物（ＧＥ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群）。

図１０で１２週間の五個のクループのラットの平均体重変化を示し、図１１は、試験６週目及び１２週目の体重の統計学的分析結果を示すグラフである。

図１０において高脂肪食餌が投与された誘発対照群のラットは、実験３及び４週目から体重水準が正常対照群に比べて高いことが観察され、試験６週目に誘発対照群の体重水準は、正常対照群に比べて有意に高いことが示され（ｐ＜０．０５）、アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群の体重水準は、肥満誘発対照群に比べて有意に低いことが観察された（ｐ＜０．０５）。しかし、試験６週目に脱塩されていないアッケシソウ粉末（ＳＰ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群の体重水準は、正常対照群に比べて有意に高いことが示された（ｐ＜０．０５）。これは、アッケシソウ脱塩粉末の抗肥満効果が脱塩されていない粉末より顕著に優れることを意味する。

試験試料を投与した後８、９及び１０週目に肥満誘発対照群は、正常対照群に比べて体重が顕著に増加し（ｐ＜０．００１）、アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）投与群において肥満誘発群に比べて体重が継続して有意に低いことが示され（ｐ＜０．００１）、陽性対照群であるガルシニア抽出物（ＧＥ）においても体重が有意に低く観察された（ｐ＜０．０５）。しかし、アッケシソウ非脱塩粉末（ＳＰ）の場合、肥満を誘発しない正常対照群と比較して体重が有意に高く示され（ｐ＜０．０１）、肥満誘発群よりは体重が減少する傾向を示した。試験試料を投与した後１１及び１２週目に誘発対照群、アッケシソウ非脱塩粉末（ＳＰ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群及び陽性対照群の体重水準は、正常対照群に比べて有意に高いことが示されたが（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）、アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）２００ｍｇ／ｋｇ投与群及び陽性対照群の体重水準は、誘発対照群に対して有意に低いことが各々観察された（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）。したがって、高脂肪食餌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙｒａｔ肥満モデルにおいて、試験試料の体重減少効果を総合的に比較すると、アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）が最も優れた体重減少効果を示し、陽性対照群として使用されたガルシニアカンボジア抽出物（ＧＥ）より統計学的に有意に高い体重減少効果（ｐ＜０．００１）を示すことが確認できた。しかし、脱塩されていないアッケシソウ粉末（ＳＰ）は、肥満誘発群で若干の体重減少を示したが、その効果は、脱塩粉末（ＤＳＰ）に比べて顕著に低い水準であった。これは、脱塩されていないアッケシソウは、脱塩粉末に比べて食物繊維と脂肪合成阻害ポリフェノール及びフラボノイドの含有量が低いだけでなく、塩化ナトリウム含有量が高いため、肥満誘発因子として作用した可能性が大きいといえる。したがって、塩化ナトリウムが除去され、食物繊維と機能性化合物とが増加したアッケシソウ脱塩粉末は、肥満抑制にも効果的な機能性素材であるといえる。

実験例４−２．高脂肪食餌で誘導されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙｒａｔ肥満モデルにおけるアッケシソウ脱塩栄養組成物の体脂肪減少効果の確認
４−２−１．血液生化学的検査及び体脂肪
血液生化学的検査は、肥満誘発１２週目にすべての動物の頸静脈から約１ｍＬの血液を採取した後、ｃｌｏｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒが入っているｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅに注入して、約１５〜２０分間室温に放置して凝固させた後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た血清を血液生化学分析機（７０２０ Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）で次の項目を検査した。検査項目は、Ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＡＬＴ）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｍｉｎａｓｅ（ＡＳＴ）、Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＴＣ）、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）、Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ）、Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＬ）及びＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｉｎｄｅｘ（ＡＩ）であった（表８）。

表８の結果において、試験試料投与１２週目にＡＳＴを測定した結果、誘発対照群（ＨＦＤ）とアッケシソウ非脱塩粉末投与群（ＨＦＤ＋ＳＰ２００）は、正常対照群（ＮＣ）に比べて有意に高いことが示され（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５）、アッケシソウ脱塩栄養組成物（脱塩粉末）２００ｍｇ／ｋｇ投与群（ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００）は、誘発対照群に比べて有意に低いことが観察された（ｐ＜０．０１）。ＴＧ及びＴＣを測定した結果、誘発対照群、アッケシソウ非脱塩粉末（ＨＦＤ＋ＳＰ２００）及び陽性対照群（ＨＦＤ＋ＧＥ２００）は、正常対照群に比べて有意に高いことが示され（ｐ＜０．００１，ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５）、アッケシソウ脱塩粉末２００ｍｇ／ｋｇ投与群（ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００）及び陽性対照群（ＨＦＤ＋ＧＥ２００）は、誘発対照群に比べて有意に低いことが観察された（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）。ＬＤＬを測定した結果、誘発対照群（ＨＦＤ）とアッケシソウ非脱塩粉末投与群（ＨＦＤ＋ＳＰ２００）及び陽性対照群（ＨＦＤ＋ＧＥ２００）は、正常対照群（ＮＣ）に比べて有意に高いことが示された（ｐ＜０．００１，ｐ＜０．０１）。このような傾向は、他の項目であるＶＬＤＬとＡＬＴにおいても同様の様相を示した。すなわち、高脂肪食餌で肥満が誘発されたグループでは顕著に増加する血液内中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）と脂肪肝に由来する血中ＡＬＴ、ＡＳＴ含有量がアッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）の投与により明らかに減少することが示された。これは、陽性対照群として使用されたガルシニアカンボジア抽出物（ＧＥ）より比較優位にあることである。このような血中脂肪と血中ＡＬＴ及びＡＳＴの減少効果は、アッケシソウ非脱塩粉末（ＳＰ）投与群においても示されたが、その程度は、アッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）よりは顕著に低い水準であることがわかった。

４−２−２．Ｍｉｃｒｏ−ＣＴを用いた腹部脂肪量の測定
肥満誘発後１２週目の剖検前にすべての動物の腹部脂肪量を測定するためにＭｉｃｒｏ−ＣＴ（ｖｉｖａＣＴ ８０，ＳＣＡＮＣＯ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）撮影を行った（図１２Ａ）。腹部脂肪の測定部位は、２番目の腰推起始部から５番目の腰推終止部までの空間に存在する腹部脂肪（Ｌ２−Ｌ５）を分析した。試験物質を投与した後１２週目に全体腹部脂肪体積を測定した結果、高脂肪食餌肥満誘発対照群（ＨＦＤ）とアッケシソウ非脱塩粉末投与群（ＨＦＤ＋ＳＰ２００）は、正常対照群（ＮＣ）に比べて有意に高いことが示され（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５）、アッケシソウ脱塩粉末２００ｍｇ／ｋｇ投与群（ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００）及び陽性対照群（ＨＦＤ＋ＧＥ２００）は、誘発対照群（ＨＦＤ）に比べて有意に低いことが観察された（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５）（図１２Ａ、１２Ｂ）。

図１２Ｃに示すように、腹部内臓脂肪（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｆａｔ）の体積を測定した結果、誘発対照群、アッケシソウ非脱塩粉末（ＨＦＤ＋ＳＰ２００）及び陽性対照群（ＨＦＤ＋ＧＥ２００）は、正常対照群（ＮＣ）に比べて有意に高いことが示され（ｐ＜０．０１）、アッケシソウ脱塩粉末投与群（ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００）は、誘発対照群と非脱塩粉末とに比べて有意に低いことが観察された（ｐ＜０．０１）。図１２Ｄに示すように、腹部皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ）の体積を測定した結果、肥満誘発対照群（ＨＦＤ）及びアッケシソウ非脱塩粉末（ＨＦＤ＋ＳＰ２００）は、正常対照群に比べて有意に高いことが示され（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）、アッケシソウ脱塩粉末投与群（ＨＦＤ＋ＤＳＰ２００）及び陽性対照群（ＨＦＤ＋ＧＥ２００）は、誘発対照群に比べて有意に低いことが観察された（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５）。

４−２−３．統計学的分析
本試験の結果について資料の正規性を仮定して母数的な一元分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を適用した。分散の同質性は、Ｌｅｖｅｎｅ ｔｅｓｔで検定し、ＡＮＯＶＡ結果が有意であり、等分散である場合はＤｕｎｃａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔで、分散不均一である場合はＤｕｎｎｅｔｔ Ｔ３ ｔｅｓｔで事後検定を行い、試験群間の有意な差を確認した。統計学的分析は、常用の広く使われる統計パッケージであるＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １８．０Ｋを用い、ｐ値が０．０５未満である場合、統計学的に有意であると判定した。

高脂肪食餌で誘導されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ肥満モデル実験を総合すれば、ａ）アッケシソウ脱塩粉末は、肥満誘発対照群に対して体重を顕著に減少させ；ｂ）血中脂質（ＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）、血中ＡＬＴとＡＳＴ水準及び動脈硬化指数（ＡＩ）も効果的に下げ；ｃ）実験動物のＭｉｃｒｏ−ＣＴ実験において体脂肪である腹部脂肪と皮下脂肪とを肥満誘発対照群に対して顕著に減少させることを確認した。したがって、このようにアッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）の体重減少及び体脂肪抑制効果は、アッケシソウの非脱塩粉末（ＳＰ）より顕著に優れることが確認され、陽性対照群に投与されたガルシニア抽出物（ＧＥ）より比較優位にあることが確認できた。

実験例５：アッケシソウ由来の脱塩栄養組成物における脂肪細胞分化抑制の有効指標成分
５−１．アッケシソウ脱塩栄養組成物からの主要指標成分の分離
実施例２の方法で製造されたアッケシソウ脱塩栄養組成物（脱塩粉末）１００ｇに１Ｌの蒸留水を加え、消化酵素であるアミラーゼとプロテアーゼを加えて３７℃で６時間インキュベイションした後遠心分離（１００００ｇ、２５分）した。遠心分離後に得られる上澄液を減圧濃縮した後に凍結乾燥して得られたアッケシソウ脱塩粉末の消化酵素分解試料（ＤＳＰ−ＥＷ、１５．９ｇ）をメタノールに溶解させてメタノール可溶性成分を高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ、ＵＳＡ）分析を行った結果（図１３Ａ）滞留時間１１．３５分近くの主要ピーク化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １）が存在することを確認した。このピーク成分のＵＶスペクトルの特性（λｍａｘ：２１８−２２０，２４０，２８５−２９０ｓｈ、３２５）は、典型的なフェニルプロパノイドフェノール酸の特徴を示したので、多様な種類のフェニルプロパノイドフェノール酸の標準品（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏ．ＵＳＡ）とＨＰＬＣ滞留時間とＵＶスペクトルを比較した結果Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １は、トランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）と同定された（図１３Ｂ）。

したがって、ＤＳＰ−ＥＷ試料のメタノール可溶性成分（１ｇ）から高速分取液体クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＭＰＬＣ、Ｊａｐａｎ）を用いてトランス−フェルラ酸を精製して３Ｔ３−Ｌ１動物細胞培養実験に用いた。本実験に用いられた分析用ＨＰＬＣは、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｃ１８分析カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓ、５μｍ、４．５×２５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）と１２００ ＤＡＤ ｄｅｔｅｃｔｏｒが取り付けられたモデル（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いた。高速分取液体クロマトグラフィーは、日本ＹＭＣ社のプレップ用カラム（Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８，２０ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ、ＹＭＣ、Ｊａｐａｎ）が取り付けされたモデル（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＬＣ（ＬＣ−ｆｏｒｔｅ／Ｒ、ＹＭＣ、Ｊａｐａｎ）を用いた。Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＬＣの移動相溶媒条件は、メタノールと３次蒸留水を用いたグラジエント条件で１５ｍｌ／分の流速で３つの波長領域（２１０，２５４，３２０ｎｍ）の吸収度を導入したＹＭＣ ＵＶ−３４００ ＵＶ検出器を用いて４種の画分を精製した結果（図１３Ｃ）、主要ピークである３番化合物がトランス−フェルラ酸であることを確認して最終的に２３０ｍｇを得ることができた。残りの１，２，４番のピーク成分は、各々コーヒー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｐ−クマル酸（ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、及びｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ−３−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることが確認された。

５−２．アッケシソウ脱塩栄養組成物で精製したトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）の脂肪分化抑制効果

５−２−１． ３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞の分化
実験は３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞を用いて脂肪細胞分化を誘導したｉｎ−ｖｉｔｒｏモデルでアッケシソウ脱塩粉末の主要指標成分であるトランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）の脂肪分化抑制能力を評価するために３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞培養のあいだ８時間ごとに確認して汚染に対する実験進行の信頼性を高めた。実験条件は、最初の脂肪前駆細胞を培養後分化のために３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）とデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）及びインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）が添加された培養培地を３日に一回ずつ２回変えながら脂肪前駆細胞の分化を誘導した。

５−２−２．Ｏｉｌ−ｒｅｄ−Ｏ染色と細胞内中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の含有量分析

脂肪前駆細胞の分化を誘導した後脂肪球の生成を確認するためにＯｉｌ−ｒｅｄ−Ｏ染色を行った。脂肪球染色のプロセスは、先にｗｅｌｌに存在する細胞上層液を除去した後、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した。その後、１００％ １，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ溶液を添加した後、５分間インキュベイションした後にｏｉｌ−ｒｅｄ−Ｏ ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを追加して脂肪球染色を行った。Ｏｉｌ−ｒｅｄ−Ｏ染色後、８５％ １，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｓｔａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した後、ｗａｓｈｉｎｇ過程を経る。最後に染めたｗｅｌｌが乾燥しないように蒸留水でｗｅｌｌに満たした後、顕微鏡で観察して脂肪球形成を確認した。

図１４Ａの結果は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞の脂肪細胞で分化誘導時に生成される脂肪球の形成をＯｉｌ−ｒｅｄ−Ｏ染色により確認することで、アッケシソウ有効指標成分であるトランス−フェルラ酸（ＴＦＡ）の脂肪細胞分化抑制能力を確認したものである。ＴＦＡは、実験した濃度内で濃度依存的に脂肪細胞の分化及び脂肪球の形成を抑制し、特に５μＭと１０μＭのＴＦＡ処理群において脂肪分化誘発対照群（ＭＤＩ）に比べて顕著に有意に（^＃＃ｐ＜０．０１，^＃＃＃ｐ＜０．００１）抑制させることが確認できた（図１４Ｂ）。

また、脂肪分化指標で細胞内中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の発現を確認した。図１４Ｃの結果において、ＴＦＡ（１，２，５，１０μＭ）は、処理した濃度内で濃度依存的に細胞内中性脂肪の含有量を減少させ、特に５μＭと１０μＭのＴＦＡ処理群において誘発対照群（ＭＤＩ）に比べて顕著に有意に（^＊＊＊ｐ＜０．００１）減少させることが確認できた。そのため、ＴＦＡが脂肪分化を抑制して分化産物の発現抑制により脂肪細胞分化による脂肪合成を減らすことができると考えられる。

５−２−３．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを用いた脂肪代謝転写因子の検査

ＰＰＡＲγ、ＦＡＳ、ＳＲＥＢＰ−１、ｃ／ＥＢＰ−αは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化誘導時に生成される脂肪代謝転写因子である。ｃ／ＥＢＰ−αとＰＰＡＲγは、互いに相補的な役割をする脂肪分化転写因子として脂肪前駆細胞が増殖を繰り返して初期分化状態に入ると、ｃ／ＥＢＰ−αが誘導され、誘導されたｃ／ＥＢＰ−αは、ＰＰＡＲγを刺激して分化成熟期を誘導する。ＰＰＡＲγは、脂肪組織に主に存在して脂肪形成を総括的に調節し、他の転写因子より分化誘導能に優れる。ＦＡＳは、脂肪細胞分化が後期に至った時、マーカーとして用いるマーカー遺伝子であって、脂肪代謝に関与する脂肪合成酵素である。また、ＦＡＳは、脂肪組織で最も多く発現され、脂肪細胞分化の最終因子として抗肥満効果の代表的な指標であり、前段階の誘導転写因子であるＳＲＥＢＰ−１によって誘導されることが知られている。

したがって、トランス−フェルラ酸（ｔｒａｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）が脂肪代謝転写因子に及ぶ影響を検討するため、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ遺伝子発現を調査した。遺伝子発現を確認するために対照群とＴＦＡとが濃度別に処理されたそれぞれの実験群から分離したＲＮＡ（ｅａｓｙ Ｂｌｕｅ、ｉＮｔＲｏｎ、ＩＮＣ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を各実験群別に同一濃度で希釈した後ｃＤＮＡで合成した（ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）。合成されたｃＤＮＡを用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認した。実験に用いたｐｒｉｍｅｒは、表９のとおりに製作した。

ＴＦＡを３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆分化細胞に濃度別（１，２，５，１０μＭ）に処理して表９のｐｒｉｍｅｒを用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲ（ＣＦＸ９６ＴＭ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を行った。反応条件は、９５℃３０分変性、９５℃５秒及び６０℃２０秒の条件で４５回連続反応後、０．２℃／１５秒の条件で９５℃まで加温後反応を終結した。反応後増幅された遺伝子発現量を確認した結果（図１５）、ＦＡＳとＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量は、脂肪分化誘発対照群（ＭＤＩ）と比較してＴＦＡの濃度依存的に減少し、１０μＭで最も多く減少し、２μＭと５μＭにおいても発現量が減少することを確認した。ｃ／ＥＢＰ−αの遺伝子発現量は、脂肪分化誘発対照群（ＭＤＩ）と比較して５μＭと１０μＭの試験物質濃度で濃度依存的に有意に減少することを確認した。最後にＰＰＡＲγの遺伝子発現量は、１０μＭで有意に減少した。すなわち、ＴＦＡは、５μＭ以上の濃度で４種（ＰＰＡＲγ、ＦＡＳ、ＳＲＥＢＰ−１，ｃ／ＥＢＰ−α）の脂肪代謝転写因子の遺伝子発現を効果的に抑制して（^＊＊＊ｐ＜０．００１）脂肪細胞分化と脂肪球形成を阻害させることが確認された（図１５）。したがって、ＴＦＡを有効性分として含有しているアッケシソウ脱塩粉末（ＤＳＰ）は、脂肪細胞分化及び脂肪球形成阻害による体脂肪を減少させることで、効果的に体重を減少させる抗肥満予防及び治療用機能性食品及び飼料としての活用及び開発が可能であると考えられる。

５−２−４．統計学的分析
統計学的分析は、ｏｎｅ−ｗａｙ ａｎｏｖａを用いて、ｐ値が０．０５未満である場合、統計学的に有意性があると判定した。

以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したので、当業界における通常の知識を有する者においてこのような具体的技術は単に好ましい実施様態であり、これにより本発明の範囲が制限されないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されるといえる。

本発明による塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物は、抗肥満及び体脂肪減少用薬学組成物並びに機能性食品及び飼料として開発されることができる。

Claims (4)

1. （ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；
   （ｂ）撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する段階；及び
   （ｃ）脱塩された沈殿物を乾燥する段階を含む、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩栄養組成物の製造方法。
2. （ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；
   （ｂ）撹拌物を遠心分離して塩分含有量が高い上澄液を除去し、脱塩された沈殿物を回収する段階；
   （ｃ）脱塩された沈殿物を液状抽出して抽出物を回収する段階；及び
   （ｄ）回収した液状抽出物を乾燥する段階を含む、塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物の製造方法。
3. 脱塩された沈殿物の液状抽出段階の前に脱塩された沈殿物を乾燥する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の塩生植物由来の機能性が強化した脱塩抽出物の製造方法。
4. （ａ）塩生植物乾燥粉末を９℃以下の水に混合して撹拌する段階；
   （ｂ）撹拌物を遠心分離して上澄液を分離する段階；
   （ｃ）分離した上澄液を濃縮した後、活性炭を用いて精製する段階；及び
   （ｄ）精製濃縮液を噴霧乾燥する段階を含む、塩生植物由来の冷水抽出塩代替物の製造方法。

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