CN117899080B - 石蒜碱在抗鳜蛙虹彩病毒中的应用 - Google Patents

石蒜碱在抗鳜蛙虹彩病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及石蒜碱在制备抗MRV产品中的应用。本发明发现石蒜碱对鳜蛙虹彩病毒(MRV)具有显著的抗病毒活性，并证实了石蒜碱抗鳜蛙虹彩病毒的作用机制，可以将石蒜碱制备抗MRV药物、添加在饲料或饲料添加剂中用于预防和/或治疗鳜蛙虹彩病毒感染鱼类，为控制鳜蛙虹彩病毒导致的危害提供新的绿色安全手段。

Description

石蒜碱在抗鳜蛙虹彩病毒中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及石蒜碱在抗鳜蛙虹彩病毒中的应用。
背景技术
鳜蛙虹彩病毒(Mandarinfish Ranavirus，MRV)属于虹彩病毒科，蛙病毒属，该病毒与大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)基因组具有极高的相似性，一般认为是其变异株。MRV感染的鱼类死亡率高，病毒感染后会引起细胞凋亡，进而造成涉及代谢、免疫等多个方面的机体功能障碍，目前急需绿色安全的新手段来控制病毒感染。
鳜鱼(Siniperca chuatsi)，俗称桂花鱼，是鲈形目鮨科鳜属的中型鱼类，属于名贵经济养殖鱼类，全国年产量可达37万吨。近年以来，以MRV为代表的病毒使鳜鱼养殖业深受其害，造成重大经济损失。大口黑鲈(Micropterus salmoides)，俗称加州鲈，隶属鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属，其适温范围广，在我国南北地区均有养殖，加之其生长速度快，经过多年的发展，已成为我国重要的淡水养殖品种之一。MRV会导致鳜鱼和大口黑鲈发病，病程持续期长至1-4月不等，急性感染可见死亡高峰，通常呈缓慢但持续死亡状态，总体死亡率20％-80％不等。
天然植物的抗病毒作用已被大量研究和报道。其不但能直接作用于病毒粒子，阻止病毒黏附、入侵，还能够激活宿主的先天免疫，通过多种途径抑制病毒增殖。石蒜碱(lycorine)是一种石蒜科植物中常见的生物碱，分子式C16H17NO4，已被报道具有抗炎、抗病毒、抗疟疾等生物活性，但其对于虹彩病毒的抗病毒活性或作用机制尚属未知。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供石蒜碱在制备预防和/或治疗鳜蛙虹彩病毒感染的产品中的应用，以解决缺乏防治鳜蛙虹彩病毒危害的绿色安全产品的难题。
实现上述目的的具体技术方案包括如下。
本发明的第一目的在于提供石蒜碱在制备预防和/或治疗鳜蛙虹彩病毒感染鱼类的产品中的应用。
在其中的一些实施例中，所述鱼类是鲈形目的鱼种。
在其中的一些实施例中，所述鱼类是鲈形目鮨科鳜属的鱼类，优选是鳜鱼。
在其中的一些实施例中，所述鱼类是鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属的鱼种，优选是大口黑鲈。
在其中的一些实施例中，所述产品是药物。
在其中的一些实施例中，所述药物是口服剂或者注射剂。
在其中的一些实施例中，所述产品是添加了石蒜碱的食品添加剂。
在其中的一些实施例中，所述产品是添加了石蒜碱的鱼饲料或鱼饲料添加剂。
在其中一些实施例中，所述应用包括降低MRV病毒拷贝数和/或抑制鳜蛙虹彩病毒核衣壳蛋白的表达与合成。
在其中一些实施例中，所述应用包括激活I型干扰素通路的关键基因表达，所述关键基因包括JAK1、TYK2、STAT1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF9、Mx1。
在其中一些实施例中，所述应用包括调控凋亡基因的表达，所述凋亡基因包括：Bad、Bax、p53、Bcl-2b、Bcl-xl、Mcl。
在其中一些实施例中，所述应用包括抑制凋亡效应酶caspase-3和/或caspase-8的活性。
在其中一些实施例中，所述应用包括抑制ROS过量产生，保护宿主细胞的线粒体功能，保护细胞免受氧化损伤。
本发明的第二目的在于提供一种抗MRV的鱼饲料或鱼饲料添加剂，其组成成分包括a.石蒜碱，以及b.鱼类的日常饲料原料或饲料添加剂的原料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明发现石蒜碱对鳜蛙虹彩病毒具有显著的抗病毒活性，并证实了石蒜碱抗MRV的作用机制，为采用石蒜碱制备抗MRV的产品提供可能，制备含有石蒜碱的抗MRV药物、饲料或饲料添加剂，对抑制鱖鱼或大口黑鲈感染MRV致使的细胞病变具有显著效果，可为石蒜碱进一步应用于防治MRV导致的危害提供基础。
附图说明
图1MRV感染SCB3细胞的方案研究。
图2不同浓度石蒜碱对SCB3细胞毒性评价，(A)石蒜碱对SCB3细胞形态的影响结果，(B)石蒜碱对SCB3细胞活力影响显著性分析结果，(C)CC50计算结果。
图3石蒜碱不同给药方式下抗MRV空斑测定及病毒拷贝数测定结果，(A)预混合给药方式，(B)预防给药方式，(C)治疗给药方式。
图4不同浓度石蒜碱的抗病毒作用，(A)石蒜碱抑制MRV诱导的CPE，(B)石蒜碱抗MRV EC50值计算。
图5石蒜碱对MRV MCP蛋白的表达水平的影响，(A)间接免疫荧光结果，(B)平均荧光强度计算结果。
图6石蒜碱对SCB3细胞I型干扰素信号通路关键基因表达的影响。
图7石蒜碱对SCB3细胞凋亡的影响，其中(A)以Annexin-Ⅴ/PI染色法检测细胞凋亡的结果，(B)MRV感染诱导SCB3细胞凋亡百分比测定结果，(C)以JC-1染色法检测线粒体膜电位结果，(D)石蒜碱对MRV感染后促凋亡基因表达的影响，(E)石蒜碱对MRV感染后抗凋亡基因表达的影响，(F)Caspase酶活检测结果。
图8石蒜碱影响活性氧(ROS)的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
TCID50：半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量，指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡的病毒量，用以表征病毒的滴度。
CC50：半数细胞毒性浓度，表示导致细胞活力下降50％的药物浓度。我们会使用显微镜观察不同浓度药物处理后的细胞情况，并通过CCK-8试验来测定细胞的存活率，最后通过适当的软件计算出药物的CC50值。
EC50：半数有效浓度，表示50％的病毒被抑制时的药物浓度。我们会在不同药物浓度下观察细胞的病变情况，当病毒对照组出现明显病变时，我们会记录不同药物浓度组的细胞病变情况，并通过qPCR方法测定各组病毒拷贝数，继而测定各组的病毒抑制率，最后计算出药物的EC50值。
PFU：空斑形成单位，代表具有感染能力的病毒的总量，感染性滴度的单位表示为PFU/ml。本申请所用PFU检测方法是将MRV经过一系列梯度稀释后感染SCB3细胞，病毒吸附后再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散，通过统计空斑计算滴度。空斑形成单位PFU＝空斑均数×稀释倍数。
本发明以鳜鱼脑细胞系为体外研究模型，证实了石蒜碱能抑制MRV MCP合成、病毒DNA复制、刺激I型干扰素通路相关基因的表达，并且可以维持线粒体膜电位稳定、调控凋亡相关基因表达、抑制凋亡效应酶的活性和/或抑制ROS的过量产生，从而抑制病毒诱导的凋亡，保护宿主细胞。故本发明一些实施例中，提供了石蒜碱在制备预防/或治疗鳜蛙虹彩病毒感染鱼类的产品中的应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
材料方法
1.细胞，病毒，药物
以鳜鱼脑细胞系(SCB3)为研究模型，用L-15培养基培养细胞，培养温度为25℃。鳜蛙虹彩病毒(MRV)为本实验室从MRV感染的鳜鱼体内分离并保存。商品中药单体石蒜碱从Sellekchem公司购买，溶解于DMSO中(10mM)，超低温冰箱保存，取用时用L-15培养基稀释至安全浓度。
2.MRV感染SCB3细胞方案
通过调整感染剂量和时间确定合适的病毒感染方案。SCB3细胞在48孔板内25℃培养箱培养长至单层，每孔加400μL L-15培养基10倍梯度稀释的MRV(接毒量分别为104TCID50到10TCID50/孔)，感染细胞，并分别在感染0.5、1、2、4、6、8h时，用PBS洗涤3次，替换新鲜L15培养基，补充5％胎牛血清。以104TCID50病毒感染的孔为阳性对照，每天观察细胞病变，当阳性对照孔病变率达到80％时收样，-80℃反复冻融3次，取上清提取DNA，qPCR检测病毒拷贝数。
3.安全浓度测定
为测定石蒜碱的细胞安全浓度，SCB3细胞铺96孔板，25℃培养箱培养长至单层，之后用不同浓度稀释的石蒜碱(终浓度100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)溶液换液，对照组用新鲜培养基换液，设置DMSO对照以排除DMSO溶剂可能对细胞造成的毒性。继续于25℃培养箱培养48h后，每孔以CCK-8:L15＝1:9的比例加入CCK-8溶液，继续培养4h后，用酶标仪检测每孔于450nm处的吸光值，根据吸光值计算石蒜碱的安全浓度，并用GraphPadPrism8.0软件计算CC50值。
4.石蒜碱EC50
SCB3细胞在48孔板内25℃培养箱培养长至单层，以100TCID50 MRV感染4h后，用不同浓度的石蒜碱稀释液(终浓度100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)换液，继续培养96h后，用上述2中方法收样，提取DNA检测病毒拷贝数，并用GraphPad Prism8.0软件计算EC50值。
5.病毒空斑试验
用4中方法感染细胞后，将上清替换为2％低熔点琼脂，待琼脂凝固后倒置培养板，25℃培养至出现明显空斑后收样，用4％多聚甲醛固定30min，流水洗去琼脂层，用0.2％结晶紫染色15min后洗去染液，晾干，通过孔内的空斑数计算病毒滴度(PFU/ml)，用SPSS25软件分析结果。
6.石蒜碱抗病毒机制研究
以预混、预防及治疗3个方案，探讨石蒜碱抗MRV的机制。
预混：10μM终浓度的石蒜碱与100TCID50 MRV在4℃条件下预混2h,加至SCB3细胞单层细胞，25℃继续培养4d后收样。
预防：SCB3细胞在6孔板内长至单层，每孔培养上清换10μM石蒜碱，25℃孵育4h后，用100TCID50 MRV 25℃感染4h，换新鲜培养基继续培养4d后收样。
治疗：SCB3细胞在6孔板内长至单层，用100TCID50 MRV 25℃感染4h，每孔培养上清换10μM石蒜碱，25℃继续培养4d后收样。
上述3个方案收样的细胞提取DNA后qPCR检测MRV拷贝数，同时测定病毒引起的空斑。
7.免疫荧光检测
为研究石蒜碱对MRV核衣壳蛋白(MCP)表达的影响，检测接毒组、对照组和治疗组的免疫荧光。
SCB3细胞在25mm玻底培养皿内培养至单层后感染MRV(方法同6中治疗方案)，培养上清换10μM石蒜碱继续培养4d后，进行如下步骤：
固定：去掉培养液，PBS润洗3次，每皿加1mL 4％多聚甲醛固定20min；
通透：PBS润洗3次，加0.1％ Triton x-100通透10min，以去除脂质和部分膜蛋白，暴露抗原；
封闭：PBS润洗3次，加入1％ BSA封闭液封闭30min；
孵一抗：去掉封闭液，PBS润洗5次，加一抗(兔抗MCP多克隆抗体，1:1000PBS稀释，每皿1mL)4℃孵育过夜；
孵二抗：去掉一抗孵育液，PBS润洗5次，去掉一抗，加AF647标记的羊抗兔抗体(1:5000PBS稀释，每皿1mL)，避光，37℃孵育1h；
DAPI染色：去掉二抗孵育液，PBS润洗5次，加DAPI稀释液(1:1000PBS稀释，每皿1mL)，避光，37℃孵育10min；
封片：去掉DAPI，PBS润洗5次，加抗荧光猝灭剂约50μL至玻璃皿中心圈内，共聚焦显微镜下观察并拍照记录。
拍得照片用image J软件计算平均荧光强度，用SPSS25软件分析显著性。
8.细胞凋亡检测1：Annexin-Ⅴ/PI染色法
为确定石蒜碱、MRV影响宿主细胞凋亡的机制，采用Annexin-Ⅴ/PI染色法检测细胞凋亡。
以6中治疗方案的方法培养SCB3细胞并感染MRV，石蒜碱处理96h后，用胰蛋白酶消化细胞，1000×g离心5min，PBS重悬洗涤1次，再1000×g离心5min。用195μL AnnexinⅤ-FITC结合液轻轻悬浮细胞后依次加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL PI，轻轻混匀，流式细胞术检测凋亡细胞。SPSS25软件进行单因素方差分析和LSD检验分析细胞凋亡水平。
9.细胞凋亡检测2：JC-1线粒体膜电位检测
为确定石蒜碱、MRV对细胞凋亡的影响，采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位。
6孔板中，以6中治疗方案的方法培养SCB3细胞并感染MRV，用石蒜碱处理48h后，JC-1染液与L15培养基1:1混合，每孔加入2mL混合液，37℃孵育20min。用JC-1染色缓冲液洗涤2次后，每孔加入1mL L-15培养基。荧光显微镜观察线粒体染色。
10.细胞凋亡检测3：caspase酶活检测
检测细胞caspase酶活性以确定细胞凋亡水平。以6中治疗方案的方法培养SCB3细胞并感染MRV，用石蒜碱处理72h后，PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化细胞，1000×g离心5min收集细胞，使用碧云天caspase酶活试剂盒测定caspase-3、-8的活性，用SPSS25软件单因素方差分析(LST检验)分析显著性。
11.活性氧(ROS)检测
为确定石蒜碱、MRV对细胞活性氧水平的影响，以6中治疗方案的方法培养SCB3细胞并感染MRV，用石蒜碱处理48h后，加入荧光探针DCFH-DA溶液，37℃孵育20min，PBS洗涤2次后，胰蛋白酶消化细胞，1000×g离心5min，L-15培养基重悬细胞，检测荧光水平以确定ROS水平。用SPSS25软件单因素方差分析(LST检验)分析显著性。
12.基因表达检测
以6中治疗方案的方法培养细胞，感染MRV，用石蒜碱处理96h后，-80℃冻融，Trizol法提取细胞RNA，并反转录成cDNA，2-ΔΔCt相对定量检测I型干扰素通路相关基因(IRF3、IRF5、IRF7、TYK2、JAK1、STAT1、IRF9、MX1)和凋亡相关基因(Bcl-2b、Bcl-XL、Mcl、Bad、Bax、p53)的表达，18S为内参基因，结果用SPSS25软件单因素方差分析和LSD检验分析显著性。
结果
1.MRV感染SCB3细胞的方案的确定
如图1所示，一定范围内，MRV在SCB3细胞中的复制表现出感染剂量和时间依赖性。当感染时间不少于4h时，100TCID50/孔的MRV即可以高效感染SCB3细胞。因此本实验选择100TCID50/孔的MRV孵育SCB3细胞4h作为感染方案。
2.石蒜碱的细胞毒性及CC50计算
如图2A所示，当石蒜碱浓度≤12.5μM时，SCB3细胞形态与对照组一致。当给予较高浓度(≥25μM)的石蒜碱时，细胞毒性明显，导致细胞萎缩和脱壁。以CCK-8法测定细胞活力(见图2B)，结果与显微镜观察一致。根据石蒜碱浓度和对应孔的细胞活力，用GraphPadPrism 8.0计算得出石蒜碱的CC50值为18.36μM(见图2C)。
结果表明，石蒜碱在一定范围内对SCB3细胞无细胞毒性作用，可以用于药物研究。
3.石蒜碱抗MRV机制
如图3所示，qPCR检测病毒拷贝数的结果分析表明，石蒜碱在预防和治疗方案中对MRV的抑制率均超过90％，并且在治疗给药时显著降低了病毒诱导的空斑数量，最高抑制率为67.63％。
如图4A所示为不同浓度稀释的石蒜碱(25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)、新鲜培养基和DMSO溶液分别培养后的SCB3细胞状态，图4B为石蒜碱抗MRV EC50值计算结果：8.49μM。
结果表明，石蒜碱在体外具有显著的抗MRV效果，作为抗MRV药物具有一定的潜力。
4.石蒜碱抑制了MRV MCP合成
如图5所示，石蒜碱(10μM)处理后，SCB3细胞中MCP的表达受到明显限制。免疫荧光结果(见图5A)显示，石蒜碱处理组的红色荧光明显少于接毒组。
结果表明，石蒜碱可以抑制MRV MCP合成。
5.石蒜碱激活了干扰素信号通路
如图6所示，MRV感染抑制了I型干扰素通路相关基因的表达，与对照组相比，IRF3、IRF5、IRF7、TYK2、JAK1、STAT1、IRF9、Mx1 mRNA表达量分别下降至原表达量的54.12％、24.34％、93.24％、14.55％、15.86％、21.76％、13.97％、75.51％。石蒜碱处理逆转了MRV诱导的基因表达抑制趋势，使MRV感染细胞中IRF3、IRF5、IRF7、TYK2、JAK1、STAT1、IRF9和Mx1mRNA水平分别升高3.15倍、12.07倍、2.45倍、15.34倍、11.32倍、9.10倍、13.49倍和1.42倍。此外，在没有MRV感染的情况下，石蒜碱仍然表现出激活I型干扰素通路的效应，IRF3、IRF5、IRF7、TYK2、JAK1、STAT1、IRF9、Mx1分别上调了1.18倍、3.24倍、1.80倍、2.53倍、2.01倍、2.47倍、2.07倍和1.06倍。
结果表明，石蒜碱通过激活宿主的先天免疫，帮助宿主建立抗病毒状态，从而抑制了MRV的增殖。
6.石蒜碱抑制了MRV诱导的线粒体凋亡
如图7A所示，以AnnexinⅤ/PI染色法检测的SCB3细胞凋亡。从图中可以看出，经过MRV病毒处理后的细胞，其AnnexinⅤ-FITC染色阳性且PI染色阴性的细胞(MRV组的右下象限)比例上升，AnnexinⅤ-FITC和PI染色双阳性的细胞也有所增加(MRV组的右上象限)，他们均为凋亡细胞。而石蒜碱处理后的右下象限及右上象限的凋亡细胞比例均有所下降。
如图7B所示，MRV感染诱导了SCB3细胞凋亡，凋亡细胞百分比由4.67％上升至10.86％，而石蒜碱处理使MRV感染诱导的SCB3细胞凋亡比例降低至正常水平。图7C是以JC-1染色法检测线粒体膜电位结果，MRV感染导致了细胞线粒体膜电位降低，显示绿色荧光，而石蒜碱处理后绿色荧光显著减少。
凋亡基因相对表达水平检测结果显示，抗凋亡基因(见图7D)Bcl-2b，Bcl-xl，Mcl在MRV感染后分别下调至原表达量的11.10％，66.86％，8.16％，而石蒜碱处理后，上述抗凋亡基因的表达又恢复到正常水平；MRV感染刺激了促凋亡基因(见图7E)Bad，Bax，p53表达，表达量分别上调1.83倍，2.45倍，2.42倍。
如图7F所示Caspase酶活检测结果显示，与对照组相比，MRV感染后凋亡效应酶caspase-3和caspase-8的活性分别提高了2.82和2.47倍，而石蒜碱处理抑制了这一趋势。
结果表明，石蒜碱通过维持线粒体膜电位稳定，调控凋亡相关基因表达，并抑制凋亡效应酶的活性，从而抑制了MRV诱导的凋亡，保护了宿主细胞。
7.石蒜碱抑制了ROS的产生
如图8所示，与对照组相比，MRV感染后引起细胞中产生过量的ROS(阳性细胞比例从31.2％上升到50.4％)，而石蒜碱处理后有效抑制了MRV感染细胞的ROS水平(阳性细胞比例为38.3％)，从而保护细胞免受氧化损伤。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.石蒜碱在制备预防和/或治疗鳜蛙虹彩病毒感染鱼类的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鱼类是鲈形目鮨科鳜属中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鱼类是鳜鱼。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鱼类是鲈形目太阳鱼科中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鱼类是大口黑鲈。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品是活性成分包括石蒜碱的药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物是口服剂或者注射剂。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品是添加了石蒜碱的鱼饲料或鱼饲料添加剂。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括降低MRV病毒拷贝数和/或抑制鳜蛙虹彩病毒核衣壳蛋白的表达与合成。
10.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括激活I型干扰素通路的关键基因表达，所述关键基因包括JAK1、TYK2、STAT1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF9、Mx1。
11.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括调控凋亡基因的表达，所述凋亡基因包括：Bad、Bax、p53、Bcl-2b、Bcl-xl、Mcl。
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