CN108478571B - 石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用 - Google Patents

石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用。本发明选用无毒性浓度的石蒜碱进行广谱抗冠状病毒研究，发现石蒜碱能在体外有效抑制β群冠状病毒HCoV‑OC43、MERS‑CoV、MHV‑A59以及α群冠状病毒HCoV‑NL63的复制，并呈现剂量效应相关性，针对MOI＝0.01剂量的HCoV‑OC43、HCoV‑NL63、MERS‑CoV和MHV‑A59四种冠状病毒的EC50分别为0.18uM、0.55uM、1.64uM和0.35uM，显示石蒜碱具有广谱抗冠状病毒活性，为进一步开发广谱抗冠状病毒药物奠定了基础，具有重要的开发价值和广泛的应用前景。

Description

石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用
技术领域 本发明属于基于生物医药技术领域，尤其涉及石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，具体涉及石蒜碱在抗中东呼吸综合症冠状病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、小鼠肝炎病毒A59药物中的应用。
背景技术 冠状病毒(Coronavirus，CoV)是目前已知基因组最大的、有包膜的单股正链RNA病毒。冠状病毒感染宿主范围广泛，在多种动物和人类中都有流行，可引起动物和人的呼吸道、消化道和神经系统的感染，是一种重要的人兽共患病病毒。
根据冠状病毒的进化特点，国际病毒分类委员会第九次报告将其分为α、β、γ以及δ四个群。其中，α与β群冠状病毒主要感染哺乳动物，γ与δ群冠状病毒主要感染禽类。α群冠状病毒主要包括人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E，HCoV-229E)与NL63(HCoV-NL63)、猪传染性胃肠炎冠状病毒、猪流行性腹泻冠状病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒等；β群冠状病毒主要有严重急性呼吸道综合症冠状病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle east respiratorysyndrome coronavirus，MERS-CoV)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)与OC43(HCoV-OC43)、小鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus，MHV)等；禽冠状病毒主要包括鸡传染性支气管炎病毒与火鸡冠状病毒等。
在目前已知的能感染人的六种冠状病毒中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1这四种冠状病毒通常引发普通感冒，表现为较轻的上呼吸道感染症状，如发烧、头痛和流鼻涕等，10-15％的人类普通感冒是由冠状病毒感染引起，由于引起普通感冒的四种冠状病毒致死率较低，并未引起人们足够的重视，目前尚无针对这些病毒的疫苗或特效药物。与之相比，SARS-CoV和MERS-CoV者两种病毒均能导致重症呼吸道疾病，严重威胁了人类生命健康：2003年由SARS-CoV引发的严重急性呼吸道综合征疫情波在短期内迅速波及全球29个国家和地区，导致8096人感染，774人死亡，病死率高达10％；自2012年9月沙特阿拉伯首次发现MERS-CoV以来，截至2018年1月28日，该病毒引发的中东呼吸道综合征疫情已波及全球27个国家和地区，全球共有确诊病例2143人，死亡750人，病死率高达36％。SARS-CoV和MERS-CoV的出现引起了人们对冠状病毒的高度重视。自此，抗冠状病毒药物研究也提上了日程。
目前针对SARS-CoV和MERS-CoV的治疗物主要包括免疫调节因子(干扰素，利巴韦林等)、病毒进入抑制物(S蛋白的单克隆抗体，针对S蛋白关键融合区域的多肽等)以及病毒复制抑制剂(如病毒聚合酶特异性抑制剂、广谱性蛋白酶抑制剂等)三种类型，但是大部分仍处于研究阶段。临床上对SARS-CoV感染的主要治疗方案是用糖皮质激素和IFN进行联合治疗，而MERS-CoV临床治疗方案主要是利用IFN或者IFN联合利巴韦林进行治疗，临床治疗的原则是在对症治疗的基础上防止并发症的发生，目前依然缺乏有效的疫苗和特效药物。
通过对FDA已批准的药物库或已上市的小分子化合物药物库进行高通量筛选，探讨已有药物的新用途，已成为药物研发的一种重要途径。“药物再利用”或“老药新用”具有众多的优势，如候选药物已具有关于药理药效测试、功能靶点以及临床安全性等资料，有利于进一步的毒理学评价、药代动力学评价和制剂研发等，可以大大减少研发风险、缩短研发时间和研发成本，有着广阔的应用前景。
石蒜碱(lycorine)属于吡咯并菲啶型生物碱，分子式为C16H17NO4，是传统药用植物石蒜的生物碱成分，最先由日本人森岛库太从传统中药石蒜的鳞中分离得到。石蒜碱具有较为显著的催吐作用，毒性较小；有祛痰作用。石蒜碱经氢化后生成二氢石蒜碱，后者具有较强的抗阿米巴痢疾作用，且毒性较小，已供临床使用。生物活性研究表明，石蒜碱及其衍生物具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫、抑制乙酰胆碱酯酶及保护心血管等多种作用。抗病毒研究表明，石蒜碱及其衍生物对SARS-CoV、手足口病毒、黄热病病毒、脊髓灰质炎病毒、反转录病毒及疱疹病毒等均有抑制活性。对石蒜碱在Vero-E6细胞中抗SARS-CoV的作用研究显示，该药物的半数有效浓度(Concentration for 50％ of maximal effect，EC50)为15.7nM，半数细胞毒性浓度(Concentration cytotoxicity 50％，CC50)为14980nM，药物安全指数(Safety Index，SI，SI＝CC50/EC50，SI＞1为有效)大于900，提示石蒜碱可以作为一个很有前景的抗SARS-CoV药物(Shi youLia，CongChenae，Hai-qing，etal.Identification of natural compounds with antiviral activities againstSARS-associated coronavirus.Antiviral Research.2005，67，18-23)。但是，目前尚未见石蒜碱在作为制备抗SARS-CoV以外的其它冠状病毒的药物报道。
基于上述分析，本发明选择对人和动物危害较为严重的β群冠状病毒(HCoV-OC43、MERS-CoV和MHV-A59)以及α群冠状病毒(HCoV-NL63)作为模式病毒，通过体外抗病毒效果研究，探讨石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用的可能性，发现石蒜碱能在体外显著抑制β群冠状病毒HCoV-OC43、MERS-CoV、MHV-A59以及α群冠状病毒HCoV-NL63的复制，对于冠状病毒的防控和治疗具有重要意义。
发明内容 本发明提供了一种石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的新应用，证实了石蒜碱能在体外细胞模型中有效抑制β群冠状病毒HCoV-OC43、MERS-CoV、MHV-A59以及α群冠状病毒HCoV-NL63的核酸复制，为进一步开发广谱抗冠状病毒的药物奠定了基础，具有重要的开发价值和推广意义。
附图说明
图1为石蒜碱的化学分子结构示意图。
图2为不同浓度石蒜碱对四种冠状病毒抗病毒效果。
图2A为不同浓度石蒜碱对对HCoV-OC43病毒复制的抑制效果。横坐标为石蒜碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对HCoV-OC43的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对BHK-21细胞活性的抑制效率。结果显示，石蒜碱在BHK-21细胞中可有效抑制HCoV-OC43的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的HCoV-OC43病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC50为0.18uM。
图2B为不同浓度石蒜碱对对HCoV-NL63病毒复制的抑制效果。横坐标为石蒜碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对HCoV-NL63的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对LLC-MK2细胞活性的抑制效率。结果显示，石蒜碱在LLC-MK2细胞中可有效抑制HCoV-NL63的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的HCoV-NL63病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC50为0.55uM。
图2C为不同浓度石蒜碱对MERS-CoV病毒复制的抑制效果。横坐标为石蒜碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对MERS-CoV的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对Vero-E6细胞活性的抑制效率。结果显示，石蒜碱在Vero-E6细胞中可有效抑制MERS-CoV的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的MERS-CoV病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC50为1.64uM。
图2D为不同浓度石蒜碱对MHV-A59病毒复制的抑制效果。横坐标为石蒜碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对MHV-A59的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对DBT细胞活性的抑制效率。结果显示，石蒜碱在DBT细胞中可有效抑制MHV-A59的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的MHV-A59病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC50为0.35uM。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1：石蒜碱的细胞毒性检测
本发明中涉及的四种冠状病毒HCoV-OC43、HCoV-NL63、MERS-CoV及MHVA59的敏感细胞系分别是BHK-21、LLC-MK2、Vero-E6和DBT，为了测试石蒜碱的安全用药浓度，本研究使用MTT法检测了石蒜碱在这四种敏感细胞系的毒性。检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在相应波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，测药物毒性时则表示药物毒性越小。
具体操作如下：将BHK-21、LLC-MK2、Vero-E6和DBT四种细胞分别按照1×104细胞/孔接种于96孔培养板，用含10％胎牛血清的DMEM培养16小时至细胞密度为80％；之后吸弃培养液，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基；石蒜碱购于北京禾秀诚生物科技有限公司，产自源叶生物，货号为B21442-20MG，纯度＞98％，使用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)溶解后，进一步用1XPBS稀释，将石蒜碱按终浓度为0.5uM，2uM，5uM，10uM加入细胞，每组浓度药物做三组平行，同时设置空白对照组和细胞对照组。放置于37℃，5％CO2孵箱中继续培养72小时，每孔加入用PBS配制的5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h。之后小心地弃掉上清液，每孔用异丙醇100μL溶解沉淀物，并在96孔板振荡器上混匀30min，最后使用多功能酶标仪在570nm波长下测定其吸光度值。根据公式计算：细胞活性抑制率(％)＝(药物组-空白对照组)/(细胞对照组-空白组)×100％。以石蒜碱的药物浓度为横坐标，以细胞增殖抑制率为纵坐标，通过Graphpad Prism 7软件计算平均值和标准差拟合曲线作图，将药物浓度转换为对数值后计算石蒜碱的细胞毒性CC50。结果如图2圆形实心点拟合的浅色曲线所示，石蒜碱在BHK-21、LLC-MK2、Vero-E6和DBT细胞中的CC50分别为5.13uM、6.28uM、4.00uM和5.95uM。
实施例2：石蒜碱的体外抗冠状病毒活性效果检测
2.1病毒感染与药物作用
将BHK21、CCL-MK2、Vero-E6和DBT细胞分别按照1×104细胞/孔接种于96孔培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养16小时至细胞密度为80％；之后吸弃细胞培养液，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基；将石蒜碱按终浓度分别为0.5uM，2uM，5uM，10uM的剂量加入相应细胞孔内，同时设置相应不加药物的细胞对照孔和仅加病毒的病毒对照孔；加入药物后1小时内，分别于相应敏感细胞孔中按照每孔10ul的体积加入HCoV-OC43、HCoV-NL63、MERS-CoV和MHV-A59，使病毒感染复数为0.01(Multiplicity of infection，MOI＝0.01)，放置于37℃，5％CO2孵箱中培养72小时后收集上清。
2.2荧光定量RT-PCR检测药物对HCoV-OC43、HCoV-NL63和MERS-CoV的抑制效果
使用绝对荧光定量方法RT-PCR方法检测HCoV-OC43、HCoV-NL63和MERS-CoV相应病毒靶基因转录水平以便反应出病毒的复制水平。按照Qiagen Viral RNA Mini Kit说明书提取病毒RNA，提取病毒RNA后进行RT-PCR检测。其中，检测各病毒的引物探针序列如下：
检测HCoV-OC43的引物探针序列如下：
上游引物序列(q-OC43-F)为：5’-GCTCAGGAAGGTCTGCTCC-3’，
下游引物序列(q-OC43-R)为：5’-TCCTGCACTAGAGGCTCTGC-3’，
探针序列(q-OC43-probe)为：5’-TTCCAGATCTACTTCGCGCACATCC-3’。
检测HCoV-NL63的引物探针序列如下：
上游引物序列(q-NL63-F)为：5’-AGGACCTTAAATTCAGACAACGTTCT-3’，
下游引物序列(q-NL63-R)为：5’-GATTACGTTTGCGATTACCAAGACT-3’，
探针序列(q-NL63-probe)为：5’-AACAGTTTTAGCACCTTCCTTAGCAACCCAAACA-3’。
检测MERS-CoV的引物探针序列如下：
上游引物序列(q-MERS-F)为：5’-GGCACTGAGGACCCACGTT-3’，
下游引物序列(q-MERS-R)为：5’-TTGCGACATACCCATAAAAGCA-3’，
探针序列(q-MERS-probe)为：5’-CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA-3’。
反应体系为：12.5μL 2×One Step SYBR RT-PCR Buffer III、0.5μL Takara ExTaq HS、0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix II、1.5μL上游引物、1.5μL下游引物、2μL RNA模板，并用无菌双蒸水补至25μL。反应参数为：42℃ 5min、95℃ 10s一个循环；95℃ 5s、60℃ 30s，循环40次，延伸后采集荧光信号。每个样品做3个重复，最后统计样品CT值，将所测得样品CT值代入标准曲线后计算出样品中的病毒拷贝数。根据公式计算：病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组-药物照组)/病毒对照组×100％。
2.3空斑减少抑制试验检测石蒜碱对MHV-A59病毒的抑制效果
使用空斑减少试验测定药物对MHV-A59病毒的复制抑制效果。将DBT按照1×105细胞/孔的量接种于6孔培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养16小时至细胞密度为80％；之后吸弃细胞培养液，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基；将石蒜碱按照终浓度分别为0.5uM，2uM，5uM，10uM的剂量加入相应细胞孔内，同时设置相应不加药物的细胞对照孔和仅加病毒的病毒对照孔；加入药物后1小时内，每孔加入10ul稀释好的病毒MHV-A59贮存液体，使病毒MOI＝0.01，放置于37℃，5％CO2孵箱中培养72小时后收集上清，使用空斑减少试验测定药物对病毒的复制抑制效果，将收集的上清液按照不同稀释度感染DBT细胞，72h后吸弃上清，4％多聚甲醛固定后使用结晶紫染色，计数孔板，根据公式计算：病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组-药物照组)/病毒对照组×100％。
2.4拟合曲线与计算EC50
以石蒜碱的浓度为横坐标，以病毒复制抑制率为纵坐标，通过Graphpad Prism 7软件计算抑制效率的平均值和标准差拟合曲线作图，将药物浓度转换成对数后计算石蒜碱的EC50，结果如图2方框深色点拟合的曲线所示。石蒜碱对HCoV-OC43、HCoV-NL63、MERS-CoV和MHV-A59四种冠状病毒的抑制效果分别见图2A、2B、2C和2D。如图2A所示，石蒜碱在BHK-21细胞中可有效抑制HCoV-OC43的复制，使MOI＝0.01的HCoV-OC43复制效率50％抑制的药物半数有效浓度EC50为0.18uM；如图2B所示，石蒜碱在LLC-MK2细胞中可有效抑制HCoV-NL63的复制，使0.01MOI的HCoV-NL63复制效率50％抑制的药物半数有效浓度EC50为0.55uM；如图2C所示，石蒜碱在Vero-E6细胞中可有效抑制MERS-CoV的复制，使MOI＝0.01的MERS-CoV复制效率50％抑制的药物半数有效浓度EC50为1.64uM；如图2D所示，石蒜碱在DBT细胞中可有效抑制MHV-A59的复制，使MOI＝0.01的MHV-A59复制50％抑制的药物半数有效浓度EC50为0.35uM。

Claims (1)

1.一种石蒜碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述的冠状病毒为：中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、小鼠肝炎病毒A59(MHV-A59)。
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