CN108721293B

CN108721293B - 吐根碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN108721293B
Application number: CN201810418492.4A
Authority: CN
Inventors: 谭文杰; 申梁; 黄保英; 牛军伟
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108721293A

Abstract

本发明公开了吐根碱在制备广谱冠状病毒药物中的应用。本发明选用无毒性浓度的吐根碱进行广谱抗冠状病毒研究，发现吐根碱能在体外有效抑制β群冠状病毒HCoV‑OC43、MERS‑CoV、MHV‑A59以及α群冠状病毒HCoV‑NL63的复制，并呈现剂量效应相关性，针对MOI＝0.01剂量的HCoV‑OC43、HCoV‑NL63、MERS‑CoV和MHV‑A59四种冠状病毒的EC₅₀分别为0.30uM、1.75uM、0.35uM和0.12uM，显示吐根碱具有广谱抗冠状病毒活性，为进一步开发广谱抗冠状病毒药物奠定了基础，具有重要的开发价值和广泛的应用前景。

Description

吐根碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用

技术领域本发明属于基于生物医药技术领域，尤其涉及吐根碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的新应用，具体涉及吐根碱在抗中东呼吸综合症冠状病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、小鼠肝炎病毒A59药物中的应用。

背景技术冠状病毒(Coronavirus，CoV)为有包膜的单股正链RNA病毒，可引起动物和人的呼吸道、消化道和神经系统的感染，是一种重要的人兽共患病病毒。根据冠状病毒的进化特点，国际病毒分类委员会第九次报告将其分为α、β、γ以及δ四个群。其中，α与β群冠状病毒主要感染哺乳动物，γ与δ群冠状病毒主要感染禽类。

冠状病毒能感染人及多种动物，并可导致人罹患从普通感冒到严重的急性呼吸综合征等疾病。目前已知的能感染人的冠状病毒有六种，包括引起上呼吸道感染症状普通感冒的人冠状病毒229E(HCoV-229E)、NL63(HCoV-NL63)、HKU1(HCoV-HKU1)、OC43(HCoV-OC43)以及能导致重症呼吸道疾病的严重急性呼吸道综合症冠状病毒(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middleeast respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)。值得关注的是，SARS-CoV和MERS-CoV均属于β群冠状病毒，该群病毒还包括HCoV-HKU1、HCoV-OC43以及作为人肝炎和肝脂肪变性和亚急性中枢系统病理重要动物模型的病原小鼠肝炎病毒(Murine hepatitisvirus，MHV)等；HCoV-229E、HCoV-NL63归属于α群冠状病毒，虽然引发的疾病症状较轻，但该群病毒的宿主范围广，猪传染性胃肠炎冠状病毒、猪流行性腹泻冠状病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒等均属于α群。冠状病毒是引起人类急性呼吸道感染的常见病原体之一，每年15％-30％的人呼吸道感染是由冠状病毒导致的，在新生儿、老年人和具有潜在疾病的个体中引起更严重的疾病，这些人群中下呼吸道感染的发生率更高；两种高致病性的冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV的病死率分别高达10％和36％，引起了人们对冠状病毒的高度重视。但是，目前尚无批准的特异性药物治疗冠状病毒引起的感染，即使针对由SARS-CoV和MERS-CoV感染引起的严重急性呼吸道患者，临床也主要以对症治疗减少患者并发症为主。因此，亟需研制有效的药物来治疗冠状病毒引起的感染。

单克隆抗体、多肽和小分子化合物通常是抗病毒药物研究的热点，通过对FDA已批准的药物库进行高通量筛选，探讨已有药物的新用途，已成为药物研发的一种重要途径。由于如候选药物已具有关于药理药效测试、功能靶点以及临床安全性等资料，有利于进一步的毒理学评价、药代动力学评价和制剂研发等，可以大大减少研发风险、缩短研发时间和研发成本，有着广阔的应用前景。

吐根碱(emetine)也称依米丁，是从茜草科植物吐根中提取的一种异喹啉生物碱，是吐根的主要活性成分之一，分子式为C₂₉H₄₀N₂O₄，主产于巴西。1894年B.H.保罗和A.J.科恩利从吐根中获得纯的吐根碱。盐酸吐根碱能够干扰溶组织阿米巴滋养体的分裂与增殖，可用于治疗急性阿米巴痢疾急需控制患者，对治疗肠外阿米巴病如肝、肺、脑、肾阿米巴性脓肿疗效亦佳，此外，还可用于蝎子蛰伤及肺吸虫病，但毒性较大，能引起蓄积中毒；去氢盐酸吐根碱也具有强大的杀死组织阿米巴滋养体的作用，且毒性反应较轻，已供临床使用。

吐根碱及其衍生物的生物活性研究表明，该药物具有多种药理活性，比如抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫、催吐及避孕等。抗病毒研究表明，吐根碱及衍生物对登革热病毒、人免疫缺陷病毒、新城疫病毒、小反刍兽疫病毒、水牛痘病毒、疱疹病毒以及MERS-CoV等多种DNA病毒和RNA病毒均有抑制活性。据报道，对吐根碱在人包皮成纤维细胞中的抗人巨细胞病毒作用研究结果显示，该药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC₅₀)为40nM，半数细胞毒性浓度(Concentration cytotoxicity 50％，CC₅₀)为8000nM，选择指数(Slectivity index，SI，SI＝CC₅₀/EC₅₀，SI＞1为有效)大于200，进一步证实吐根碱可抑制包括HSV-1和HSV-2等疱疹病毒的复制(Mukhopadhyay R，Roy S，Venkatadri R，etal.Efficacy and Mechanism of Action of Low Dose Emetine against HumanCytomegalovirus.PLoS Pathog，2016，12，e1005717)。MERS-CoV抗病毒药物高通量筛选研究发现，吐根碱具有一定的抗冠状病毒的活性，对0.0001MOI剂量的MERS-CoV感染的EC₅₀为14.7uM，CC₅₀为17uM，药物安全指数为1.5，提示吐根碱具有一定的抗冠状病毒的活性(ChanJF，Chan KH，Kao RY，et al.Broad-spectrum antivirals for the emerging MiddleEast respiratory syndrome coronavirus.J Infect，2013，67，606-616.)。但是，目前尚未见吐根碱作为抗作为制备抗MERS-CoV以外的其它冠状病毒的药物报道。

基于上述分析，本发明以β群冠状病毒(HCoV-OC43、MERS-CoV和MHV-A59)以及α群冠状病毒(HCoV-NL63)作为模式病毒，通过体外抗病毒效果研究，探讨吐根碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用的可能性，发现吐根碱能在体外显著抑制β群冠状病毒HCoV-OC43、MERS-CoV、MHV-A59以及α群冠状病毒HCoV-NL63的复制，对于冠状病毒感染的防控和治疗具有重要意义。

发明内容本发明提供了一种吐根碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的新应用，证实了吐根碱能在体外细胞模型中有效抑制β群冠状病毒HCoV-OC43、MERS-CoV、MHV-A59以及α群冠状病毒HCoV-NL63的核酸复制，为进一步开发广谱抗冠状病毒的药物奠定了基础。

附图说明

图1为吐根碱的化学分子结构示意图。

图2为不同浓度吐根碱对四种冠状病毒抗病毒效果。

图2A为不同浓度吐根碱对对HCoV-OC43病毒复制的抑制效果。横坐标为吐根碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对HCoV-OC43的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对BHK-21细胞活性的抑制效率。结果显示，吐根碱在BHK-21细胞中可有效抑制HCoV-OC43的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的HCoV-OC43病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为0.30uM。

图2B为不同浓度吐根碱对对HCoV-NL63病毒复制的抑制效果。横坐标为吐根碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对HCoV-NL63的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对LLC-MK2细胞活性的抑制效率。结果显示，吐根碱在LLC-MK2细胞中可有效抑制HCoV-NL63的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的HCoV-NL63病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为1.75uM。

图2C为不同浓度吐根碱对MERS-CoV病毒复制的抑制效果。横坐标为吐根碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对MERS-CoV的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对Vero-E6细胞活性的抑制效率。结果显示，吐根碱在Vero-E6细胞中可有效抑制MERS-CoV的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的MERS-CoV病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为0.35uM。

图2D为不同浓度吐根碱对MHV-A59病毒复制的抑制效果。横坐标为吐根碱的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对MHV-A59的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对DBT细胞活性的抑制效率。结果显示，吐根碱在DBT细胞中可有效抑制MHV-A59的病毒复制，使MOI＝0.01剂量的MHV-A59病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为0.12uM。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。

实施例1：吐根碱的细胞毒性检测

本发明中涉及的四种冠状病毒HCoV-OC43、HCoV-NL63、MERS-CoV及MHVA59的敏感细胞系分别是BHK-21、LLC-MK2、Vero-E6和DBT，为了测试吐根碱的安全用药浓度，本研究使用MTT法检测了吐根碱对这四种细胞系的毒性。检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在相应波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，测药物毒性时则表示药物毒性越小。

具体操作如下：将BHK-21、LLC-MK2、Vero-E6和DBT四种细胞分别按照1×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板，用含10％胎牛血清的DMEM培养16小时至80％成片；之后吸弃培养液，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基；吐根碱购于北京禾秀诚生物科技有限公司，产自美国Target Molecule Corp(陶素生化，TagerMol中国)，货号为T0982，纯度＞98％，使用DMSO溶解后，进一步用PBS稀释，将吐根碱按终浓度为0.5uM，2uM，5uM，10uM加入细胞，每组浓度药物做三组平行，同时设置空白对照组和细胞对照组。放置于37℃，5％CO₂孵箱中继续培养72小时，每孔加入用PBS配制的5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h。之后小心地弃掉上清液，每孔用异丙醇100μL溶解沉淀物，并在96孔板振荡器上混匀30min，最后使用多功能酶标仪在570nm波长下测定其吸光度值。根据公式计算：细胞活性抑制率(％)＝(药物组-空白对照组)/(细胞对照组-空白组)×100％。以吐根碱的药物浓度为横坐标，以细胞增殖抑制率为纵坐标，通过Graphpad Prism 7软件计算平均值和标准差拟合曲线作图，将药物浓度转换为对数值后计算吐根碱的细胞毒性CC₅₀。结果如图2圆形实心点拟合的浅色曲线所示，吐根碱在BHK-21、LLC-MK2、Vero-E6和DBT细胞中的CC₅₀分别为3.91uM、4.78uM、3.38uM和4.30uM。

实施例2：吐根碱的体外抗冠状病毒活性效果检测

2.1病毒感染与药物作用

将BHK21、CCL-MK2、Vero-E6和DBT细胞分别按照1×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养16小时至80％成片；之后吸弃细胞培养液，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基；将吐根碱按终浓度分别为0.5uM，2uM，5uM，10uM的剂量加入相应细胞孔内，同时设置相应不加药物的细胞对照孔和仅加病毒的病毒对照孔；加入药物后1小时内，分别于相应敏感细胞孔中以每孔10ul的体积加入HCoV-OC43、HCoV-NL63、MERS-CoV和MHV-A59，使病毒感染复数为0.01(Multiplicity of infection，MOI＝0.01)，放置于37℃，5％CO₂孵箱中培养72小时后收集上清。

2.2荧光定量RT-PCR检测药物对HCoV-OC43、HCoV-NL63和MERS-CoV的抑制效果

使用绝对荧光定量方法RT-PCR方法检测HCoV-OC43、HCoV-NL63和MERS-CoV相应病毒靶基因转录水平以便反应出病毒的复制水平。按照Qiagen Viral RNAMini Kit说明书提取病毒RNA，提取病毒RNA后进行RT-PCR检测。其中，检测各病毒的引物探针序列如下：

检测HCoV-OC43的引物探针序列如下：

上游引物序列(q-OC43-F)为：5’-GCTCAGGAAGGTCTGCTCC-3’，

下游引物序列(q-OC43-R)为：5’-TCCTGCACTAGAGGCTCTGC-3’，

探针序列(q-OC43-probe)为：5’-TTCCAGATCTACTTCGCGCACATCC-3’。

检测HCoV-NL63的引物探针序列如下：

上游引物序列(q-NL63-F)为：5’-AGGACCTTAAATTCAGACAACGTTCT-3’，

下游引物序列(q-NL63-R)为：5’-GATTACGTTTGCGATTACCAAGACT-3’，

探针序列(q-NL63-probe)为：5’-AACAGTTTTAGCACCTTCCTTAGCAACCCAAACA-3’。

检测MERS-CoV的引物探针序列如下：

上游引物序列(q-MERS-F)为：5’-GGCACTGAGGACCCACGTT-3’，

下游引物序列(q-MERS-R)为：5’-TTGCGACATACCCATAAAAGCA-3’，

探针序列(q-MERS-probe)为：5’-CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA-3’。

反应体系为：12.5μL 2×One Step SYBR RT-PCR Buffer III、0.5μL Takara ExTaq HS、0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix II、1.5μL上游引物、1.5μL下游引物、2μL RNA模板，并用无菌双蒸水补至25μL。反应参数为：42℃ 5min、95℃ 10s一个循环；95℃ 5s、60℃ 30s，循环40次，延伸后采集荧光信号。每个样品做3个重复，最后统计样品CT值，将所测得样品CT值代入标准曲线后计算出样品中的病毒拷贝数。根据公式计算：病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组-药物照组)/病毒对照组×100％。

2.3空斑减少抑制试验检测吐根碱对MHV-A59病毒的抑制效果

使用空斑减少试验测定药物对MHV-A59病毒的复制抑制效果。将DBT按照1×10⁵细胞/孔的量接种于6孔培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养16小时至80％成片；之后吸弃细胞培养液，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基；将吐根碱按照终浓度分别为0.5uM，2uM，5uM，10uM的剂量加入相应细胞孔内，同时设置相应不加药物的细胞对照孔和仅加病毒的病毒对照孔；加入药物后1小时内，每孔加入10ul稀释好的病毒MHV-A59贮存液体，使病毒MOI＝0.01，放置于37℃，5％CO₂孵箱中培养72小时后收集上清，使用空斑减少试验测定药物对病毒的复制抑制效果，将收集的上清液按照不同稀释度感染DBT细胞，72h后吸弃上清，4％多聚甲醛固定后使用结晶紫染色，计数孔板，根据公式计算：病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组-药物照组)/病毒对照组×100％。

2.4拟合曲线与计算EC₅₀

以吐根碱的浓度为横坐标，以病毒复制抑制率为纵坐标，通过Graphpad Prism 7软件计算抑制效率的平均值和标准差拟合曲线作图，将药物浓度转换成对数后计算吐根碱的EC₅₀，结果如图2方框深色点拟合的曲线所示。吐根碱对HCoV-OC43、HCoV-NL63、MERS-CoV和MHV-A59四种冠状病毒的抑制效果分别见图2A、2B、2C和2D。如图2A所示，吐根碱在BHK-21细胞中可有效抑制HCoV-OC43的复制，使MOI＝0.01的HCoV-OC43复制效率50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为0.30uM；如图2B所示，吐根碱在LLC-MK2细胞中可有效抑制HCoV-NL63的复制，使0.01MOI的HCoV-NL63复制效率50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为1.75uM；如图2C所示，吐根碱在Vero-E6细胞中可有效抑制MERS-CoV的复制，使MOI＝0.01的MERS-CoV复制效率50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为0.35uM；如图2D所示，吐根碱在DBT细胞中可有效抑制MHV-A59的复制，使MOI＝0.01的MHV-A59复制50％抑制的药物半数有效浓度EC₅₀为0.12uM。

Claims

1.一种吐根碱在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述的冠状病毒为：人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、小鼠肝炎病毒A59(MHV-A59)。