CN113274484A - 小扁豆凝集素在制备预防和治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物中的应用 - Google Patents

小扁豆凝集素在制备预防和治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了小扁豆凝集素在制备预防和治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物中的应用，本发明首次发现小扁豆凝集素能够同时对SARS‑CoV‑2及SARS‑CoV‑2流行性突变株表现出较好的抗病毒活性，具有显著的抑制作用，且未表现出细胞毒性，可作为抑制SARS‑CoV‑2和SARS‑CoV‑2流行性突变株的候选药物，应用前景广阔。

Description

小扁豆凝集素在制备预防和治疗冠状病毒引起的感染性疾病 的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及小扁豆凝集素在制备预防和 治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。
背景技术
冠状病毒(Coronaviruses，CoVs)在自然界中广泛存在，其自然宿主包括人类 和其他哺乳动物如牛、猪、犬、猫、鼠和蝙蝠等。冠状病毒是一种有包膜的、非 节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae) 正冠状病毒亚科(Ortho-coronavirinae)，由于病毒包膜上有向四周伸出的突起，形 似花冠而得名，冠状病毒亚科进一步细分为四类，即α、β、γ和δ冠状病毒(Fehr A R,Perlman S.Coronaviruses:an overview of their replication and pathogenesis[J]. Coronaviruses,2015:1-23.)，目前，已经鉴定出7种可感染人类的冠状病毒，其 中，2种为α属冠状病毒，包括HCoV-229E和HCoV-NL63，5种为β属冠状病 毒，包括严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征相关 冠状病毒(MERS-CoV)、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。 SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV为高致病性冠状病毒，可引起急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，甚至多器官损伤和衰竭 等，目前尚无特效疫苗或药物用于预防和治疗高致病性冠状病毒的感染，临床上 主要采取对症治疗和支持治疗。
近期，一些新检测到的具有全球流行性的SARS-CoV-2突变株引起了全世界 的关注，在目前已经检测分离到的SARS-CoV-2突变株中，发生在Spike蛋白(S 蛋白)受体结合域的多个突变是主要的突变类型，Spike蛋白受体结合域是新冠病 毒结合宿主受体的主要结构，该结构的突变则有可能导致增强与受体的亲和力、 减弱中和抗体效应或者造成病毒的免疫逃逸，其中，D614G突变增强了 SARS-CoV-2的感染能力(Daniloski Z,Jordan T X,Ilmain J K,et al.The Spike D614G mutation increases SARS-CoV-2 infection ofmultiple human cell types[J]. Elife,2021,10:e65365.)，与D614G组合的突变株(D614G+I472V，D614G+A435S) 降低了对中和抗体的敏感性(Li Q,Wu J,Nie J,et al.Theimpact of mutations in SARS-CoV-2 spike on viral infectivity and antigenicity[J].Cell,2020,182(5): 1284-1294.e9.)，K417N、E484K和N501Y突变株介导的病毒感染性、中和抗性 增强，最近出现的SARS-CoV-2突变株B.1.1.7(501Y.V1)、B.1.351(501Y.V2)和 P.1(501Y.V3)对中和抗体具有更高的抗性、传播性更强。
针对当前出现的SARS-CoV-2流行性突变株，本发明的目的在于提供一种 同时对SARS-CoV-2及SARS-CoV-2流行性突变株均具有较好的抗病毒活性的 物质，所述物质为小扁豆凝集素(Lentil lectin)，分子量为52.5kD，可同时与高 甘露糖型、以及末端具有GlcNac的N糖结合，来源于兵豆属的小扁豆(Lens culinaris)，本发明经实验研究首次发现小扁豆凝集素具有有效的抗SARS-CoV-2 和SARS-CoV-2流行性突变株的活性，且未表现出细胞毒性，可作为抑制 SARS-CoV-2和SARS-CoV-2流行性突变株的候选药物，具有较高的临床应用 价值和市场价值。
目前，关于小扁豆凝集素在制备预防和治疗SARS-CoV-2及SARS-CoV-2 流行性突变株引起的感染性疾病的药物中的应用，尚未见报道。
发明内容
针对当前出现的SARS-CoV-2流行性突变株，本发明的目的在于提供小扁豆 凝集素在制备预防和治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物中的应用，所述小扁 豆凝集素能够同时对SARS-CoV-2及SARS-CoV-2流行性突变株表现出较好的抗 病毒活性，具有显著的抑制作用，且未表现出细胞毒性，可作为抑制SARS-CoV-2 和SARS-CoV-2流行性突变株的候选药物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了小扁豆凝集素在制备预防和/或治疗冠状病毒引起 的感染性疾病的药物中的应用；
优选地，所述小扁豆凝集素通过抑制冠状病毒S蛋白与细胞上的ACE2受体 蛋白的结合而在早期发挥抗冠状病毒的作用；
更优选地，所述小扁豆凝集素通过与冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、 N165、N343特异性结合而抑制冠状病毒S蛋白与细胞上的ACE2受体蛋白的结 合。
进一步，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；
优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突 变株；
更优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、 D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、 K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；
最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
本发明的第二方面提供了一种用于预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾 病的药物组合物。
所述药物组合物包括小扁豆凝集素；
优选地，所述药物组合物还可包括药学上可接受的载体和/或赋形剂；
更优选地，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包括抑菌剂、粘膜吸收促 进剂、保护剂中的一种或多种；
最优选地，所述抑菌剂选自山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类、 苯甲酸和山梨酸钾联合使用中的一种或多种；
最优选地，所述粘膜吸收促进剂选自甘露醇、磷脂、表面活性剂、环糊精及 其衍生物、甘草次酸及其衍生物、肽和蛋白质水解酶抑制剂、金属离子螯合剂中 的一种或多种，
最优选地，所述保护剂选自神经生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长 因子、人白蛋白、脑源性神经营养因子、透明质酸酶、神经胶质生长因子、生长 分化因子、神经调节蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、白 血病抑制因子、白介素、类干扰素活性物质、肿瘤坏死因子、神经生长相关蛋白 中的一种或多种。
所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、 颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、 结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
进一步，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者 的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏 性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方 对所希望的治疗有效的给药剂量。
本发明的第三方面提供了一种体外非治疗性地抑制冠状病毒产生细胞病变 效应和/或抑制冠状病毒增殖的方法。
进一步，所述方法包括给有需要的受试对象施用小扁豆凝集素或本发明第二 方面所述的药物组合物；
优选地，所述小扁豆凝集素的使用剂量为40-80μg/mL；
更优选地，所述小扁豆凝集素的使用剂量为55-65μg/mL。
本发明的第四方面提供了一种筛选预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾 病的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)提供待测化合物以及阳性对照化合物，所述的阳性对照化合物为小扁豆 凝集素；
(2)在测试组中，检测步骤(1)中所述待测化合物对冠状病毒产生的细胞病变 效应的抑制程度和/或对冠状病毒增殖的抑制程度，并与阳性对照组以及阴性对 照组中相应的实验结果进行比较；
(3)若所述待测化合物对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或对 冠状病毒增殖的抑制程度显著高于阴性对照组，则提示所述待测化合物是预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的候选药物；
(4)比较所述待测化合物对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或 对冠状病毒增殖的抑制程度(A1)与阳性对照组中小扁豆凝集素对冠状病毒产生 的细胞病变效应的抑制程度和/或对冠状病毒增殖的抑制程度(A2)，若A1/A2≥ 80％，则表明所述待测化合物为预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的候选 药物；
优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；
更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其 突变株；
最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、 D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、 K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；
最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
进一步，对筛选出的待测化合物的治疗效果进行评价，有显著的治疗效果： A1/A0≥2，有较佳的治疗效果：A1/A0≥3，有更佳的治疗效果A1/A0≥4，其中， A1为所述待测化合物(测试组)对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或 对冠状病毒增殖的抑制程度，A0为阴性对照组中的对应的实验结果。
进一步，所述的方法还包括对筛选得到的候选药物进行进一步的实验验证；
优选地，所述实验验证包括候选药物的治疗效果验证、候选药物的细胞毒性 验证；
更优选地，所述候选药物的细胞毒性验证可采用MTT法、细胞病变效应(CPE) 观察法；
MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原 理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色 结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(DMSO) 能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在550nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正 比，该方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验中。
细胞病变效应(CPE)观察法是指在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞 性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆，坏死，从瓶壁脱落等现 象，称之细胞病变作用(CPE)，是指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性 的现象。
本发明的第五方面提供了小扁豆凝集素在筛选预防和/或治疗冠状病毒引起 的感染性疾病的候选药物中的应用。
本发明的第六方面提供了一种筛选冠状病毒的候选抑制剂的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：将待测物质与冠状病毒S蛋白上的糖基化 位点N234、N165、N343接触，若所述待测物质能明显和冠状病毒S蛋白上的 糖基化位点N234、N165、N343结合，则表明所述待测物质为冠状病毒的候选 抑制剂；
优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；
更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其 突变株；
最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、 D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、 K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；
最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
本发明的第七方面提供了冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、N165、N343 在筛选冠状病毒的候选抑制剂中的应用。
本发明的第八方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第二方面所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒引起的感 染性疾病中的应用；
(2)本发明第二方面所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染中的 应用；
(3)本发明第二方面所述的药物组合物在抑制冠状病毒产生细胞病变效应 中的应用；
(4)本发明第二方面所述的药物组合物在抑制冠状病毒增殖中的应用。
本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明首次发现小扁豆凝集素能够同时对SARS-CoV-2及SARS-CoV-2流 行性突变株表现出较好的抗病毒活性，具有显著的抑制作用，且未表现出细胞毒 性，可作为抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV-2流行性突变株的候选药物；
(2)本发明首次发现冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、N165、N343可作 为抗冠状病毒药物的候选作用靶点，所述靶点在冠状病毒及其突变株中发挥着重 要的作用，该发现为抗冠状病毒药物的研发提供了重要的新思路；
(3)本发明的提出为冠状病毒引起的感染性疾病的预防和治疗提供了一种 新的技术手段，对临床上冠状病毒引起的感染性疾病的治疗和/或辅助治疗具有 十分重要的意义，应用前景广阔。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是采用假病毒中和实验检测不同的植物凝集素对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和VSV的抗病毒活性的结果统计图；
图2是SARS-CoV-2 S蛋白突变株和流行性突变株对不同的植物凝集素的中和敏感性的结果图；
图3是不同的植物凝集素对3种流行性突变株的抗病毒活性的结果图，其中，A 图：B.1.1.7，B图：B.1.351，C图：P.1；
图4是植物凝集素的血细胞凝集活性的实验结果图；
图5是小扁豆凝集素对Balb/c小鼠体重增加的影响结果统计图；
图6是小扁豆凝集素在早期阶段抑制SARS-CoV-2感染的结果图，其中，A图： 小扁豆凝集素在处理前后抑制假病毒感染的结果图，B图：CPE抑制实验的结果 图；
图7是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2 S蛋白的反应结果图，其中，A图：Cy3标记的小扁豆凝集素聚糖阵列结果图；B图：L-阿拉伯糖、 D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)、甲基α-D-甘露醇苷和 D-GlcNAc与甲基α-D-甘露醇苷的摩尔混合物对小扁豆凝集素中和活性的竞争性 抑制结果图，C图：小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性抑制结果图；
图8是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2 S蛋白的反应结果图，其中，A图：N165的N-聚糖图谱，B图：N234的N-聚糖图谱，C图：N343 的N-聚糖图谱，D图：SARS-CoV-2糖蛋白三聚体(原始株，GenBank:MN908947， PDB ID 6VSB)预融合结构上的代表聚糖N165(紫色)、N234(黄色)和N343(红色)， 其中一个RBD为“上”构象，另外两个RBD为“下”构象，ACE2受体结合位 点用淡蓝色表示，E图：N165、N234和N343能与小扁豆凝集素结合的N-聚糖 比例的饼状结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理 和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白结合活性及抗病毒活性的检测
1、实验材料
小扁豆凝集素(Lentil lectin)、麦胚芽凝集素(WGA)、无梗接骨木凝集素(SSL)、花生凝集素(Peanut lectin)、怀槐凝集素(MAL)均购自于Wako(Japan)；曼陀罗凝 集素(DSL)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)、雪花莲凝集素(GNL)、植物 凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、来源于红芸豆的植物凝集素-M(PHA-M) 和植物凝集素-P(PHA-P)均购自于Sigma Aldrich；HEK293细胞表达的 SARS-COV-2 S三聚体购自于ACRO Biosystems公司(中国，北京)；293T细胞由 美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供；Huh7细胞由日本研究生物资源保藏中心 (JCRB)提供；构建了SARS-CoV-2 spike(原始株，MN908947；hCoV-19/South Africa/KRISP-K007869/2020，B.1.351，EPI_ISL_860630； hCoV-19/England/QEUH-F56F0F/2021，B.1.1.7，EPI_ISL_852526； hCoV-19/Brazil/AM-991/2020，P.1，EPI_ISL_833171)、SARS-CoV spike(GenBank: AY278491)、MERS-CoV spike(GenBank:AFS88936.1)、VSV glycoprotein(GenBank: M27165)表达质粒，其中，原始株spike表达质粒用作诱变的模板。
2、假病毒的制备、滴定和抗病毒的分析
首先进行假病毒的制备和滴定，在假病毒制备滴定完成后，采用基于假病毒 感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液 添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID50/mL)，并在37℃的条件 下孵育1小时。然后，加入100μLHuh7细胞(2×105cells/mL)，并在37℃、5％ CO2的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench 法计算各凝集素的IC50。
3、表面等离子体共振(SPR)方法检测凝集素与SARS-CoV-2 S蛋白的结合活性
SPR检测在BIAcore T200仪器(BIAcore，Cytiva)上进行，采用胺偶联法将 SARS-CoV-2 S蛋白三聚体固定在CM5芯片的第二流通池上，首先将400mM N-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐与100mM N-羟基琥珀酰亚胺的1:1混 合物激活传感器芯片表面，将S三聚体稀释至25μg/mL的浓度，采用10mM醋 酸钠溶液(pH 5.0)稀释，并注入活化的表面，用1.0M乙醇胺/盐酸(pH 8.5)溶液以 10μL/min的速度阻断残留的反应表面封闭7min，达到约1000个响应单元(RU) 的固定化水平。采用类似胺偶联剂处理流通池1，但不注射任何配体，作为空白 对照。
采用0.01M HEPES、0.05％聚山梨酯20、150mM NaCl和3mM EDTA缓冲 液对凝集素进行系列稀释，将稀释后的凝集素以30μL/min的速度注入芯片上2 min，然后解离150s，用甘氨酸1.5(Cytiva)以20μL/min的浓度再生表面30s， 以去除结合凝集素。
4、采用SEC-MALS测定蛋白质的分子量
通过体积排阻色谱法将凝集素流过TSK G3000 SWXL色谱柱(Tosoh BioscienceLLC，King of Prussia，PA，USA)，并通过三角光散射检测器(DAWN) 和示差折光检测器(Optilab T-rEX，Wyatt Technology，Santa Barbara，California) 进行检测，采用ASTRA7进行数据分析，计算蛋白质的分子量(Mw)。
5、实验结果
实验结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、 白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对SARS-CoV-2 S 蛋白均具有较强的结合活性(见表1)，而花生凝集素和怀槐凝集素(MAL)对 SARS-CoV-2 S蛋白对SARS-CoV-2S蛋白则没有结合活性；
假病毒中和实验的结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝 集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对 SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒均具有较强的抑制活性，5种凝 集素对SARS-CoV-2的IC50在8.5～33.8μg/mL之间，其中，小扁豆凝集素和麦 胚芽凝集素(WGA)对SARS-CoV-2的抑制活性最强。麦胚芽凝集素(WGA)、琥珀 酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对水疱性口炎病毒VSV也显示出较强的抑制活 性，无梗接骨木凝集素(SSL)虽然对SARS-CoV和SARS-CoV-2均有一定的抑制 作用，但对MERS-CoV无抑制作用，花生凝集素未表现出病毒抑制作用，怀槐 凝集素(MAL)对SARS-CoV-2 S蛋白无明显的结合活性，对SARS-CoV-2也无抗 病毒活性，仅对MERS-CoV有不显著的抗病毒活性(见表1和图1)，结果表明了 5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白 细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2 S蛋 白具有较强的结合活性，且同时对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV均有 较强的抗病毒活性。
表1不同的植物凝集素对SARS-CoV-2的抗病毒活性的结果
Figure BDA0003092550770000101
Figure BDA0003092550770000111
实施例2植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变 株感染的抑制作用检测
本实施例分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白突变株和 SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用，所述突变株包括英国流行突变株 B.1.1.7、南非流行突变株B.1.351、巴西流行突变株P.1、组合突变株D614G+I472V、 组合突变株D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、组合突 变株A222V+D614G、组合突变株K417N+D614G、组合突变株S477N+D614G、 组合突变株E484K+D614G、组合突变株N501Y+D614G等突变株；
凝集素主要针对糖蛋白的糖基部分，在本实施例中，发明人研究了 SARS-CoV-2 S蛋白的糖化位点的变化是否会影响其对凝集素的中和敏感性，共 构建28个N-连接糖基化位点缺失(22个位点，24个突变体)或O-连接糖基化位 点缺失(4个预测位点，4个突变体)的人工突变体。
1、基于假病毒(SARS-CoV-2 S蛋白突变株)的中和敏感性实验
分别检测了28个糖基化突变体以及各种组合突变株对各植物凝集素的敏感 性，具体实验方法如下：
采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释 的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID50/mL)， 并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μL Huh7细胞(2×105cells/mL)， 并在37℃、5％CO2的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采 用Reed-Muench法计算各凝集素的IC50。
2、植物凝集素的抗病毒活性检测实验
分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2流行性突变株B.1.1.7、B.1.351 和P.1的抗病毒活性，具体实验方法如下：
采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释 的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID50/mL)， 并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μL Huh7细胞(2×105cells/mL)， 并在37℃、5％CO2的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采 用Reed-Muench法计算各凝集素的IC50。
3、实验结果
中和敏感性的实验结果显示，小扁豆凝集素对28个糖基化突变体的抗病毒 活性(中和敏感性)均未受影响，IC50的倍数变化均在4.0以下(见图2)，N122Q 和N801Q对GNL的敏感性降低了4倍，N343Q对DSL和GNL的敏感性降低 了4倍，而N709Q和位于近端膜C端的三个突变(N1098Q、N1134Q和N1173Q) 对PHA-L、PHA-E的敏感性增加了4-10倍，N1098Q对WGA的敏感性增加了6 倍(见图2)，表明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物 凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)) 可以对28个糖基化突变体高效中和；
抗病毒活性检测的结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝 集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对流 行性突变株B.1.1.7、B.1.351和P.1的抗病毒活性与对SARS-CoV-2的抗病毒活 性相似，均表现出一定的抗病毒活性，其中，小扁豆凝集素和WGA对3种流行 性突变株的抗病毒活性最强(见图3A-C)，进一步证明了5种植物凝集素(小扁豆 凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、 琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2及其流行性突变株均具有 抗病毒活性。
实施例3植物凝集素的血细胞凝集活性和细胞毒性的检测
由于许多的天然凝集素都会引起血细胞凝集，因此，在本实施例中发明人研 究了不同植物凝集素的血细胞凝集活性，并对Huh7和293T细胞的细胞毒性进 行了研究。
1、植物凝集素的血细胞凝集活性的检测
采用鸡血标本检测植物凝集素的血细胞凝集活性，用PBS洗涤公鸡红细胞， 并以1％(v/v)的终浓度重悬，将50μL 2倍系列稀释的植物凝集素溶液与等体积 的红细胞溶液在96孔圆底板中混合，将流感抗原(B/Maryland/15/2016， NIBSC-UK-EN63QG，NIBSC代码：18/104，HA：69μg/mL)进行2倍系列稀释， 并作为阳性对照，PBS溶液用作阴性对照，将板在室温条件下孵育1小时，并通 过目测确定各种植物凝集素的血细胞凝集活性。
2、植物凝集素的细胞毒性的检测
采用Huh7和293T细胞对各种植物凝集素的细胞毒性进行检测，植物凝集 素对Huh7和293T细胞的细胞毒性活性以CC50(50％细胞毒浓度)表示；
此外，采用Balb/c小鼠对小扁豆凝集素在体内的影响进行了验证，在第0 天，对小鼠腹膜内注射20mg/kg的小扁豆凝集素(n＝6)或PBS(n＝6)，其中，PBS 为阴性对照，并在注射后每天测量小鼠的体重并记录，以Balb/c小鼠的体重增加 作为机体健康状况的指标。
3、实验结果
血细胞凝集活性检测的实验结果显示，PBS没有显示出任何血凝活性，已知 的血凝剂流感血凝剂HA在浓度高于0.03μg/mL时显示出血凝活性，小扁豆凝 集素在最高浓度为1mg/mL时才会表现出较弱的凝集活性，琥珀酰-伴刀豆球蛋 白A(succ-Con A)在1mg/mL时也未表现出血凝活性(见图4)，表明了小扁豆凝 集素和琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-ConA)均具有较弱的血凝活性；
细胞毒性检测的实验结果显示，所有的植物凝集素在500μg/mL时均未表现 出细胞毒性(见表1)，证明了本发明所述的植物凝集素不具有细胞毒性，进一步 采用动物实验验证小扁豆凝集素在体内的影响的结果表明，在20mg/kg的注射 量下，并未出现Balb/c小鼠的体重下降，进一步证明了所述的植物凝集素不具有 细胞毒性(见图5)。
实施例4小扁豆凝集素抗SARS-CoV-2感染的机制研究
为了研究小扁豆凝集素对SARS-CoV-2感染的抑制作用的机制，本发明对其 体外作用模式进行了研究，具体实施方式如下：
1、对小扁豆凝集素的抗病毒活性进行检测
首先用小扁豆凝集素分别对Huh7细胞或假病毒进行预处理和后处理，并检 测其抗病毒活性。小扁豆凝集素预处理：用系列稀释的凝集素溶液在37℃的条 件下与Huh7细胞共孵育1h，PBS洗涤5次后(此洗涤步骤也可省略)，用 SARS-CoV-2假病毒感染细胞；小扁豆凝集素后处理：将SARS-CoV-2假病毒分 别在37℃的条件下感染Huh7细胞0、1、2、4、6、8和24h后，再加入系列稀 释的小扁豆凝集素，检测小扁豆凝集素对病毒感染的影响。
2、基于SARS-CoV-2活病毒的细胞病变抑制实验(CPE抑制实验)
首先将梯度稀释的小扁豆凝集素和100 TCID50的SARS-CoV-2活病毒等体 积混合，并在37℃的条件下孵育1小时，然后将混合物转移至铺有Vero E6细胞 的96孔培养板中，37℃培养3天后，采用显微镜观察细胞的形态和状态，并记 录相关数据，根据所得数据计算CPE抑制率，评估小扁豆凝集素对SARS-CoV-2 活病毒的抗病毒作用。
3、聚糖阵列分析
用Cy3标记植物凝集素，并用基于假病毒的抗病毒测定实验检测其生物活 性，用封闭缓冲液封闭N-Glycan微阵列载玻片(Creative Biochip，南京，中国)30 分钟，然后用PBST(PBS缓冲液，0.05％Tween 20)洗涤，加入1～8μg/mL凝集 素-Cy3，37℃孵育2小时，洗涤以去除未结合的凝集素，然后对微阵列载玻片进 行扫描和分析。
4、基于SPR的ACE2竞争性结合测定
小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性分析是采用BIAcore T200系 统(BIAcore，Cytiva)在25℃的条件下进行分析的，通过抗人IgG(Fc)抗体(Cat.No.BR100530,Cytiva)以5μg/mL的浓度将人ACE2-hFc标签捕获到S系列传感 器芯片CM5的第二个流通池中，注射时间为30s，流速为10μL/min，以产生 350RU的响应，在运行缓冲液(1×HEPES、0.005％Tween-20)中制备400nM SARS-CoV-2 S蛋白的测定溶液，其中含有浓度为0nM、0.5nM、5nM、20nM、 50nM的小扁豆凝集素，流速为30μL/min，缔合时间为60s，解离时间为90s， 检测对人ACE2结合的反应，用3M MgCl2再生人ACE2和抗人IgG(Fc)抗体的 表面，结合动力学参数采用
Figure BDA0003092550770000151
Insight软件(BIAcore，Cytiva)进行评估。
5、实验结果
抗病毒活性检测的实验结果显示，在处理0、1和2h后，以及用小扁豆凝 集素预孵育假病毒1h后，观察到小扁豆凝集素对病毒感染性的显著抑制作用(见 图6A)；用小扁豆凝集素预孵育Huh7细胞后，用大量PBS洗涤细胞以清除残留 的凝集素，结果显示没有抑制作用，而不使用PBS洗涤的预孵育导致了显著的 剂量依赖性的感染抑制作用；随着添加小扁豆凝集素时间的延长，抑制作用逐渐 减弱，4h后无病毒抑制，表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段发挥作用， 且直接与SARS-CoV-2的S蛋白反应；
CPE抑制实验的结果显示，与SARS-CoV-2活病毒预孵育的小扁豆凝集素显 示出了较强的抑制作用，IC50为60.26μg/mL(1.2μM)(见图6B)，进一步表明了 小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段与SARS-CoV-2直接反应发挥抗病毒的作 用；
聚糖阵列分析的结果显示，小扁豆凝集素与两种类型的N糖的结合效果最 佳：从Man-5到Man-9的高甘露糖型N糖，以及非还原端含有GlcNAc的N糖(见 图7A)，高甘露糖型Man-8和Man-9的结合亲和力最高，非还原端含有GlcNAc 的N-聚糖可以是单天线复杂型N-聚糖(N020)、双天线复杂型N-聚糖(N000)或杂 合型N-聚糖(N010)。凝集素分别与甲基α-D-甘露醇苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺 (D-GlcNAc)和D-葡萄糖孵育后，抑制了小扁豆凝集素的抗病毒活性，其中α-D- 甘露醇苷的抑制作用最强(见图7B)，表明小扁豆凝集素的抗病毒活性直接依赖于 其高甘露糖型/GlcNAc结合功能；
基于SPR的竞争性结合测定的结果显示，50nM的小扁豆凝集素可有效地 阻断ACE2受体和S三聚体蛋白的结合，从而在病毒感染的早期发挥抗病毒的作 用。糖基化位点N165、N234和N343位于S蛋白受体结合位点周围(见图8D)， N234的N-聚糖是高甘露糖型，由Man-8(53.2％)、Man-9(40.3％)、Man-7(3.4％)、 Man-6(1.5％)和Man-5(1.5％)组成，在N165和N343中，N-聚糖以复杂型为主， 在N165中也发现了约20％的高甘露糖型聚糖Man-5和少量的杂合型聚糖(见图 8A-C)，小扁豆凝集素与各糖基化位点特异性结合聚糖的比例见图8E，N234、 N165和N343位点的大多数聚糖可与小扁豆凝集素结合，表明了小扁豆凝集素 可与N234、N165和N343位点的N-聚糖结合，并阻断ACE2与RBD的结合， 从而抑制SARS-CoV-2感染，发挥抗病毒的作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.小扁豆凝集素在制备预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物中的应用；
优选地，所述小扁豆凝集素通过抑制冠状病毒S蛋白与细胞上的ACE2受体蛋白的结合而在早期发挥抗冠状病毒的作用；
更优选地，所述小扁豆凝集素通过与冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、N165、N343特异性结合而抑制冠状病毒S蛋白与细胞上的ACE2受体蛋白的结合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；
优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；
更优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；
最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
3.一种用于预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括小扁豆凝集素；
优选地，所述药物组合物还可包括药学上可接受的载体和/或赋形剂；
更优选地，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包括抑菌剂、粘膜吸收促进剂、保护剂中的一种或多种；
最优选地，所述抑菌剂选自山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸和山梨酸钾联合使用中的一种或多种；
最优选地，所述粘膜吸收促进剂选自甘露醇、磷脂、表面活性剂、环糊精及其衍生物、甘草次酸及其衍生物、肽和蛋白质水解酶抑制剂、金属离子螯合剂中的一种或多种，
最优选地，所述保护剂选自神经生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、人白蛋白、脑源性神经营养因子、透明质酸酶、神经胶质生长因子、生长分化因子、神经调节蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、白血病抑制因子、白介素、类干扰素活性物质、肿瘤坏死因子、神经生长相关蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。
5.一种体外非治疗性地抑制冠状病毒产生细胞病变效应和/或抑制冠状病毒增殖的方法，其特征在于，所述方法包括给有需要的受试对象施用小扁豆凝集素或权利要求3或4所述的药物组合物；
优选地，所述小扁豆凝集素的使用剂量为40-80μg/mL。
6.一种筛选预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提供待测化合物以及阳性对照化合物，所述的阳性对照化合物为小扁豆凝集素；
(2)在测试组中，检测步骤(1)中所述待测化合物对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或对冠状病毒增殖的抑制程度，并与阳性对照组以及阴性对照组中相应的实验结果进行比较；
(3)若所述待测化合物对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或对冠状病毒增殖的抑制程度显著高于阴性对照组，则提示所述待测化合物是预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的候选药物；
(4)比较所述待测化合物对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或对冠状病毒增殖的抑制程度(A1)与阳性对照组中小扁豆凝集素对冠状病毒产生的细胞病变效应的抑制程度和/或对冠状病毒增殖的抑制程度(A2)，若A1/A2≥80％，则表明所述待测化合物为预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的候选药物；
优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；
更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；
最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；
最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
7.小扁豆凝集素在筛选预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病的候选药物中的应用。
8.一种筛选冠状病毒的候选抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测物质与冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、N165、N343接触，若所述待测物质能明显和冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、N165、N343结合，则表明所述待测物质为冠状病毒的候选抑制剂；
优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；
更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；
最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；
最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
9.冠状病毒S蛋白上的糖基化位点N234、N165、N343在筛选冠状病毒的候选抑制剂中的应用。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求3或4所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒引起的感染性疾病中的应用；
(2)权利要求3或4所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染中的应用；
(3)权利要求3或4所述的药物组合物在抑制冠状病毒产生细胞病变效应中的应用；
(4)权利要求3或4所述的药物组合物在抑制冠状病毒增殖中的应用。
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