CN113350482B - 植物凝集素pha-e在制备治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用 - Google Patents
植物凝集素pha-e在制备治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了植物凝集素PHA‑E在制备治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用,本发明发现植物凝集素PHA‑E对冠状病毒及其突变株具有高度抑制的活性,有抑制冠状病毒及其突变株早期阶段感染细胞的作用,表明了植物凝集素PHA‑E可用于预防和/或治疗冠状病毒感染或冠状病毒相关疾病的药物制备中,为冠状病毒的预防和治疗提供了理论依据和新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地,涉及植物凝集素PHA-E在制备药物中的应用,更具体地,涉及植物凝集素PHA-E在制备治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用。
背景技术
冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是一种有包膜的非节段的单股正链RNA病毒,属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae),在自然界中广泛存在,人和多种动物易感,其自然宿主包括人类和其他哺乳动物,如牛、猪、犬、猫、鼠和蝙蝠等,冠状病毒是导致呼吸道感染的主要致病性病原体之一(Chen Y,Liu Q,Guo D.Emerging coronaviruses:genome structure,replication,and pathogenesis[J].Journal of medical virology,2020,92(4):418-423.),冠状病毒的基因组大小约为26 000至32 000个碱基,包括可变数目的开放阅读框(ORFs),第一个ORF约占整个基因组的67%,编码16个非结构蛋白(Nonstructuralproteins,NSPs),而其余的ORF编码辅助蛋白和结构蛋白,其中,四种主要的结构蛋白为刺突表面糖蛋白(S蛋白)、小包膜蛋白(E蛋白)、基质蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白),SARS-CoV、 SARS-CoV-2和MERS-CoV的S蛋白通过不同的受体结合域(RBDs)与不同的宿主受体结合,SARS-CoV和SARS-CoV-2采用血管紧张素转换酶2(ACE2)作为其主要的受体之一,CD209L作为替代受体,而MERS-CoV采用二肽基肽酶 4(DPP4,CD26)作为其主要的受体。
逆转录是RNA病毒复制过程中必不可少的过程之一,由于逆转录酶在参与 DNA合成的过程中缺少校正功能,合成的cDNA会有更多的错误,所以RNA 病毒相比于DNA病毒而言更容易发生基因组突变,随着时间的推移,全世界公布的SARS-CoV-2的基因组信息迅速增加,越来越多的病毒突变株被发现 (Junejo Y,Ozaslan M,Safdar M,et al.Novel SARS-CoV-2/COVID-19:origin, pathogenesis,genes and genetic variations,immuneresponses and phylogenetic analysis[J].Gene reports,2020,20:100752.),包括D614G突变株,以及由其演变而来的G614突变株,其中,G614相较于D614而言,选择竞争力更强,G614 增强了病毒粒子的感染性和稳定性;还包括N501Y突变株,以及由其在流行过程中演变而来的B.1.1.7突变株、B.1.351突变株等(Leung K,Shum M H H,Leung G M,etal.Early transmissibility assessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2in the United Kingdom,October to November 2020[J]. Eurosurveillance,2021,26(1):2002106.),相关研究已经证明这些突变株出现了功能性的突变,会影响抗体的中和作用,也可能会影响现有的针对S蛋白设计的疫苗的有效性。
因此,目前存在研发预防和治疗冠状病毒(包括其突变株)感染或者是冠状病毒(包括其突变株)感染引发的疾病的药物的强烈需求,有效的预防和治疗药物对于冠状病毒引发的流行性疾病的防控具有重要意义,尤其是处在高危传染环境中的易感人群,目前,尚未有植物凝集素PHA-E在制备治疗冠状病毒 (SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株)所致疾病的药物中的应用。
发明内容
为了解决目前没有有效治疗SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及 SARS-CoV-2突变株的药物,也无有效预防高危易感人群感染SARS-CoV、 MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株和预防冠状病毒性疾病的药物和手段的技术问题,本发明的目的在于提供植物凝集素PHA-E在制备治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供的第一个技术方案是:一种用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物。
进一步,所述药物组合物包含有效量的植物凝集素PHA-E;
优选地,所述冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株中的任意一种或多种;
更优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
最优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
进一步,所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料、其他抗病毒的药物和 /或化合物;
优选地,药学上可接受的辅料包括矫味剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂、包衣材料、润滑剂、崩解剂中的任意一种或多种;
优选地,所述其他抗病毒的药物和/或化合物包括利巴韦林、IFN-α、IFN-β、 IFN-τ、IFN-ω、IFN-γ、洛匹那韦、奈非那韦、阿比多尔、瑞德西韦、溴己新、金精三羧酸、磷酸氯喹、甘草甜素、黄芩甙中的任意一种或多种。
进一步,所述IFN-α包括IFN-α1b、IFN-α2b。
进一步,所述药物组合物的剂型选自注射剂、涂剂、洗剂、气雾剂、油制剂、口服剂、透皮贴剂中的任意一种。
进一步,所述药学上可接受的辅料为适合于对人和/或动物给药而无过度的不良副反应,同时适合于维持位于其中的药物或活性成分的活力,依照给药途径的不同,可以采用本领域技术人员熟知的各种不同的辅料。
进一步,所述药物组合物还可包含药学上可接受的盐,包括(但不限于):盐酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、山梨酸盐、高氯酸盐、抗坏血酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲酸盐、阿康酸盐、羟硝酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘-2-磺酸盐、邻苯二甲酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、柠檬酸盐、庚酸盐、富马酸盐、谷氨酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、对甲苯磺酸盐、铵盐、有机碱盐(例如异丙胺盐、二环己胺盐、二乙胺盐)、碱金属盐(例如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐、镁盐)。
进一步,所述药学上可接受的盐可以采用本领域技术人员所熟知的制备方法制备得到。
进一步,所述药物组合物中的植物凝集素PHA-E可作为有效成分之一,也可作为唯一有效成分,所述药物组合物中的植物凝集素PHA-E可作为活性成分之一,也可作为唯一活性成分。
进一步,所述药物组合物的给药途径包括(但不限于):静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下、口服、经吸入、透皮等。
本发明提供的第二个技术方案是:植物凝集素PHA-E在制备用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用。
进一步,所述冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株中的任意一种或多种;
优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
更优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
在本发明公开植物凝集素PHA-E具有抗冠状病毒活性的情况下,本领域技术人员可以预测植物凝集素PHA-E的衍生物可能也具有抗冠状病毒的活性,因此,这些具有抗冠状病毒活性的植物凝集素PHA-E的衍生物在制备用于预防和/ 或治疗冠状病毒所致疾病的药物组合物中的应用也包括在本发明的保护范围之内。
本发明提供的第三个技术方案是:一种抑制冠状病毒在细胞中复制的抑制剂。
进一步,所述抑制剂包含植物凝集素PHA-E;
优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
更优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
进一步,所述抑制剂还可与药学上可接受的辅剂结合,采用现有常规制药的工艺,制备成抗冠状病毒感染的药物;
优选地,所述辅剂包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂;
优选地,所述药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂的形式使用,其给药途径可为经皮、静脉或肌肉注射、口服等。
进一步,利用植物凝集素PHA-E对冠状病毒在细胞中复制的显著抑制作用,制备成的抗冠状病毒感染的药物,通过抑制冠状病毒在细胞中复制,从而实现抗冠状病毒感染的目的。
本发明提供的第四个技术方案是:植物凝集素PHA-E在制备抑制冠状病毒在细胞中复制的抑制剂中的应用;
优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
更优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
本发明提供的第五个技术方案是:本发明第一个技术方案所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒所致疾病中的应用;
优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
更优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
本发明提供的第六个技术方案是:本发明第一个技术方案所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染中的应用;
优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
更优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
本发明提供的第七个技术方案是:本发明第三个技术方案所述的抑制剂在抑制冠状病毒在细胞中的复制中的应用;
优选地,所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、及其突变株;
更优选地,所述突变株包括D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、 S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、 E484K+D614G、N501Y+D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1;
最优选地,所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
本发明还提供了如下技术方案:一种抑制冠状病毒感染动物的方法。
进一步,所述方法包括如下步骤:给受试动物施用植物凝集素PHA-E或本发明第一个技术方案所述的药物组合物或本发明第三个技术方案所述的抑制剂以抑制冠状病毒感染受试动物;
优选地,所述受试动物为哺乳动物;
更优选地,所述哺乳动物包括小鼠、大鼠、牛、猪、犬、猫、蝙蝠、非人灵长类动物、人等;
最优选地,所述哺乳动物为人。
为了使本发明可以更容易地理解,对相关术语进行了如下解释:
本文中使用的术语“预防”,是指避免、减少、或延迟受试者中特定疾病或疾病相关症状的出现,并且在相关药物给药前这种疾病或疾病相关症状还未出现,“预防”并非需要完全阻止疾病或疾病相关症状的出现,例如,在相关药物给药后可以减小受试者出现特定疾病或疾病相关症状的风险,或者减弱后来出现的相关症状的严重程度,均可认为是“预防”该疾病的出现或发展。
本文中使用的术语“治疗”,是指缓解、减轻、改善、或抑制(例如,阻止发展)受试者已经表现出的或曾经出现过的疾病,就某一具体疾病而言,“治疗”可以包括“治愈”该疾病,但大多数情况下并不需要完全消除其所有症状,例如,采用相关药物给药导致受试者至少一种症状减弱或消除,则可认为是对受试者进行了“治疗”。
本文中使用的术语“有效量的”,例如本文中使用到的“有效量的植物凝集素PHA-E”,是指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的的量,可通常由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定,当用于预防目的时,“有效量的”也可认为是“预防有效量的”。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明发现植物凝集素PHA-E对冠状病毒及其突变株具有高度抑制的活性,有抑制冠状病毒及其突变株早期阶段感染细胞的作用,所述冠状病毒及其突变株包括SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株,因此,植物凝集素PHA-E可用于预防和/或治疗冠状病毒感染或冠状病毒相关疾病的药物制备中,为冠状病毒的预防和治疗提供了理论依据和新的途径。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1是采用假病毒中和实验检测不同的植物凝集素对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和VSV的抗病毒活性的结果统计图;
图2是SARS-CoV-2S蛋白突变株和流行性突变株对不同的植物凝集素的中和敏感性的结果图;
图3是不同的植物凝集素对3种流行性突变株的抗病毒活性的结果图,其中,A 图:B.1.1.7,B图:B.1.351,C图:P.1;
图4是植物凝集素的血细胞凝集活性的实验结果图;
图5是小扁豆凝集素对Balb/c小鼠体重增加的影响结果统计图;
图6是小扁豆凝集素在早期阶段抑制SARS-CoV-2感染的结果图,其中,A图:小扁豆凝集素在处理前后抑制假病毒感染的结果图,B图:CPE抑制实验的结果图;
图7是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2S蛋白的反应结果图,其中,A图:Cy3标记的小扁豆凝集素聚糖阵列结果图;B图:L-阿拉伯糖、 D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)、甲基α-D-甘露醇苷和 D-GlcNAc与甲基α-D-甘露醇苷的摩尔混合物对小扁豆凝集素中和活性的竞争性抑制结果图,C图:小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性抑制结果图;
图8是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2S蛋白的反应结果图,其中,A图:N165的N-聚糖图谱,B图:N234的N-聚糖图谱,C图:N343 的N-聚糖图谱,D图:SARS-CoV-2糖蛋白三聚体(原始株,GenBank:MN908947, PDB ID 6VSB)预融合结构上的代表聚糖N165(紫色)、N234(黄色)和N343(红色),其中一个RBD为“上”构象,另外两个RBD为“下”构象,ACE2受体结合位点用淡蓝色表示,E图:N165、N234和N343能与小扁豆凝集素结合的N-聚糖比例的饼状结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1植物凝集素对SARS-CoV-2S蛋白结合活性及抗病毒活性的检测
1、实验材料
小扁豆凝集素(Lentil lectin)、麦胚芽凝集素(WGA)、无梗接骨木凝集素(SSL)、花生凝集素(Peanut lectin)、怀槐凝集素(MAL)均购自于Wako(Japan);曼陀罗凝集素(DSL)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)、雪花莲凝集素(GNL)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、来源于红芸豆的植物凝集素-M(PHA-M) 和植物凝集素-P(PHA-P)均购自于Sigma Aldrich;HEK293细胞表达的 SARS-COV-2S三聚体购自于ACRO Biosystems公司(中国,北京);293T细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供;Huh7细胞由日本研究生物资源保藏中心 (JCRB)提供;构建了SARS-CoV-2spike(原始株,MN908947;hCoV-19/SouthAfrica/KRISP-K007869/2020,B.1.351,EPI_ISL_860630; hCoV-19/England/QEUH-F56F0F/2021,B.1.1.7,EPI_ISL_852526; hCoV-19/Brazil/AM-991/2020,P.1,EPI_ISL_833171)、SARS-CoV spike(GenBank: AY278491)、MERS-CoV spike(GenBank:AFS88936.1)、VSV glycoprotein(GenBank: M27165)表达质粒,其中,原始株spike表达质粒用作诱变的模板。
2、假病毒的制备、滴定和抗病毒的分析
首先进行假病毒的制备和滴定,在假病毒制备滴定完成后,采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测,将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中,然后加入50μL假病毒(1300TCID50/mL),并在37℃的条件下孵育1小时。然后,加入100μLHuh7细胞(2×105cells/mL),并在37℃、5% CO2的湿化环境中孵育,孵育24小时后进行化学发光检测,采用Reed-Muench 法计算各凝集素的IC50。
3、表面等离子体共振(SPR)方法检测凝集素与SARS-CoV-2S蛋白的结合活性
SPR检测在BIAcore T200仪器(BIAcore,Cytiva)上进行,采用胺偶联法将 SARS-CoV-2S蛋白三聚体固定在CM5芯片的第二流通池上,首先将400mM N-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐与100mM N-羟基琥珀酰亚胺的1:1混合物激活传感器芯片表面,将S三聚体稀释至25μg/mL的浓度,采用10mM醋酸钠溶液(pH 5.0)稀释,并注入活化的表面,用1.0M乙醇胺/盐酸(pH 8.5)溶液以 10μL/min的速度阻断残留的反应表面封闭7min,达到约1000个响应单元(RU) 的固定化水平。采用类似胺偶联剂处理流通池1,但不注射任何配体,作为空白对照。
采用0.01M HEPES、0.05%聚山梨酯20、150mM NaCl和3mM EDTA缓冲液对凝集素进行系列稀释,将稀释后的凝集素以30μL/min的速度注入芯片上2 min,然后解离150s,用甘氨酸1.5(Cytiva)以20μL/min的浓度再生表面30s,以去除结合凝集素。
4、采用SEC-MALS测定蛋白质的分子量
通过体积排阻色谱法将凝集素流过TSK G3000 SWXL色谱柱(Tosoh BioscienceLLC,King of Prussia,PA,USA),并通过三角光散射检测器(DAWN) 和示差折光检测器(Optilab T-rEX,Wyatt Technology,Santa Barbara,California) 进行检测,采用ASTRA7进行数据分析,计算蛋白质的分子量(Mw)。
5、实验结果
实验结果显示,小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对SARS-CoV-2S 蛋白均具有较强的结合活性(见表1),而花生凝集素和怀槐凝集素(MAL)对 SARS-CoV-2S蛋白对SARS-CoV-2S蛋白则没有结合活性;
假病毒中和实验的结果显示,小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对 SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒均具有较强的抑制活性,5种凝集素对SARS-CoV-2的IC50在8.5~33.8μg/mL之间,其中,小扁豆凝集素和麦胚芽凝集素(WGA)对SARS-CoV-2的抑制活性最强。麦胚芽凝集素(WGA)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对水疱性口炎病毒VSV也显示出较强的抑制活性,无梗接骨木凝集素(SSL)虽然对SARS-CoV和SARS-CoV-2均有一定的抑制作用,但对MERS-CoV无抑制作用,花生凝集素未表现出病毒抑制作用,怀槐凝集素(MAL)对SARS-CoV-2S蛋白无明显的结合活性,对SARS-CoV-2也无抗病毒活性,仅对MERS-CoV有不显著的抗病毒活性(见表1和图1),结果表明了 5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2S蛋白具有较强的结合活性,且同时对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV均有较强的抗病毒活性。
表1不同的植物凝集素对SARS-CoV-2的抗病毒活性的结果
实施例2植物凝集素对SARS-CoV-2S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用检测
本实施例分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用,所述突变株包括英国流行突变株B.1.1.7、南非流行突变株B.1.351、巴西流行突变株P.1、组合突变株D614G+I472V、组合突变株D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、组合突变株A222V+D614G、组合突变株K417N+D614G、组合突变株S477N+D614G、组合突变株E484K+D614G、组合突变株N501Y+D614G等突变株;
凝集素主要针对糖蛋白的糖基部分,在本实施例中,发明人研究了 SARS-CoV-2 S蛋白的糖化位点的变化是否会影响其对凝集素的中和敏感性,共构建28个N-连接糖基化位点缺失(22个位点,24个突变体)或O-连接糖基化位点缺失(4个预测位点,4个突变体)的人工突变体。
1、基于假病毒(SARS-CoV-2S蛋白突变株)的中和敏感性实验
分别检测了28个糖基化突变体以及各种组合突变株对各植物凝集素的敏感性,具体实验方法如下:
采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测,将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中,然后加入50μL假病毒(1300TCID50/mL),并在37℃的条件下孵育1小时。然后,加入100μL Huh7细胞(2×105cells/mL),并在37℃、5%CO2的湿化环境中孵育,孵育24小时后进行化学发光检测,采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC50。
2、植物凝集素的抗病毒活性检测实验
分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2流行性突变株B.1.1.7、B.1.351 和P.1的抗病毒活性,具体实验方法如下:
采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测,将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中,然后加入50μL假病毒(1300TCID50/mL),并在37℃的条件下孵育1小时。然后,加入100μL Huh7细胞(2×105cells/mL),并在37℃、5%CO2的湿化环境中孵育,孵育24小时后进行化学发光检测,采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC50。
3、实验结果
中和敏感性的实验结果显示,小扁豆凝集素对28个糖基化突变体的抗病毒活性(中和敏感性)均未受影响,IC50的倍数变化均在4.0以下(见图2),N122Q 和N801Q对GNL的敏感性降低了4倍,N343Q对DSL和GNL的敏感性降低了4倍,而N709Q和位于近端膜C端的三个突变(N1098Q、N1134Q和N1173Q) 对PHA-L、PHA-E的敏感性增加了4-10倍,N1098Q对WGA的敏感性增加了6 倍(见图2),表明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)) 可以对28个糖基化突变体高效中和;
抗病毒活性检测的结果显示,小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对流行性突变株B.1.1.7、B.1.351和P.1的抗病毒活性与对SARS-CoV-2的抗病毒活性相似,均表现出一定的抗病毒活性,其中,小扁豆凝集素和WGA对3种流行性突变株的抗病毒活性最强(见图3A-C),进一步证明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2及其流行性突变株均具有抗病毒活性。
实施例3植物凝集素的血细胞凝集活性和细胞毒性的检测
由于许多的天然凝集素都会引起血细胞凝集,因此,在本实施例中发明人研究了不同植物凝集素的血细胞凝集活性,并对Huh7和293T细胞的细胞毒性进行了研究。
1、植物凝集素的血细胞凝集活性的检测
采用鸡血标本检测植物凝集素的血细胞凝集活性,用PBS洗涤公鸡红细胞,并以1%(v/v)的终浓度重悬,将50μL 2倍系列稀释的植物凝集素溶液与等体积的红细胞溶液在96孔圆底板中混合,将流感抗原(B/Maryland/15/2016, NIBSC-UK-EN63QG,NIBSC代码:18/104,HA:69μg/mL)进行2倍系列稀释,并作为阳性对照,PBS溶液用作阴性对照,将板在室温条件下孵育1小时,并通过目测确定各种植物凝集素的血细胞凝集活性。
2、植物凝集素的细胞毒性的检测
采用Huh7和293T细胞对各种植物凝集素的细胞毒性进行检测,植物凝集素对Huh7和293T细胞的细胞毒性活性以CC50(50%细胞毒浓度)表示;
此外,采用Balb/c小鼠对小扁豆凝集素在体内的影响进行了验证,在第0 天,对小鼠腹膜内注射20mg/kg的小扁豆凝集素(n=6)或PBS(n=6),其中,PBS 为阴性对照,并在注射后每天测量小鼠的体重并记录,以Balb/c小鼠的体重增加作为机体健康状况的指标。
3、实验结果
血细胞凝集活性检测的实验结果显示,PBS没有显示出任何血凝活性,已知的血凝剂流感血凝剂HA在浓度高于0.03μg/mL时显示出血凝活性,小扁豆凝集素在最高浓度为1mg/mL时才会表现出较弱的凝集活性,琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)在1mg/mL时也未表现出血凝活性(见图4),表明了小扁豆凝集素和琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)均具有较弱的血凝活性;
细胞毒性检测的实验结果显示,所有的植物凝集素在500μg/mL时均未表现出细胞毒性(见表1),证明了本发明所述的植物凝集素不具有细胞毒性,进一步采用动物实验验证小扁豆凝集素在体内的影响的结果表明,在20mg/kg的注射量下,并未出现Balb/c小鼠的体重下降,进一步证明了所述的植物凝集素不具有细胞毒性(见图5)。
实施例4小扁豆凝集素抗SARS-CoV-2感染的机制研究
为了研究小扁豆凝集素对SARS-CoV-2感染的抑制作用的机制,本发明对其体外作用模式进行了研究,具体实施方式如下:
1、对小扁豆凝集素的抗病毒活性进行检测
首先用小扁豆凝集素分别对Huh7细胞或假病毒进行预处理和后处理,并检测其抗病毒活性。小扁豆凝集素预处理:用系列稀释的凝集素溶液在37℃的条件下与Huh7细胞共孵育1h,PBS洗涤5次后(此洗涤步骤也可省略),用 SARS-CoV-2假病毒感染细胞;小扁豆凝集素后处理:将SARS-CoV-2假病毒分别在37℃的条件下感染Huh7细胞0、1、2、4、6、8和24h后,再加入系列稀释的小扁豆凝集素,检测小扁豆凝集素对病毒感染的影响。
2、基于SARS-CoV-2活病毒的细胞病变抑制实验(CPE抑制实验)
首先将梯度稀释的小扁豆凝集素和100TCID50的SARS-CoV-2活病毒等体积混合,并在37℃的条件下孵育1小时,然后将混合物转移至铺有Vero E6细胞的96孔培养板中,37℃培养3天后,采用显微镜观察细胞的形态和状态,并记录相关数据,根据所得数据计算CPE抑制率,评估小扁豆凝集素对SARS-CoV-2 活病毒的抗病毒作用。
3、聚糖阵列分析
用Cy3标记植物凝集素,并用基于假病毒的抗病毒测定实验检测其生物活性,用封闭缓冲液封闭N-Glycan微阵列载玻片(Creative Biochip,南京,中国)30 分钟,然后用PBST(PBS缓冲液,0.05%Tween 20)洗涤,加入1~8μg/mL凝集素-Cy3,37℃孵育2小时,洗涤以去除未结合的凝集素,然后对微阵列载玻片进行扫描和分析。
4、基于SPR的ACE2竞争性结合测定
小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性分析是采用BIAcore T200系统(BIAcore,Cytiva)在25℃的条件下进行分析的,通过抗人IgG(Fc)抗体(Cat.No.BR100530,Cytiva)以5μg/mL的浓度将人ACE2-hFc标签捕获到S系列传感器芯片CM5的第二个流通池中,注射时间为30s,流速为10μL/min,以产生 350RU的响应,在运行缓冲液(1×HEPES、0.005%Tween-20)中制备400nM SARS-CoV-2S蛋白的测定溶液,其中含有浓度为0nM、0.5nM、5nM、20nM、 50nM的小扁豆凝集素,流速为30μL/min,缔合时间为60s,解离时间为90s,检测对人ACE2结合的反应,用3M MgCl2再生人ACE2和抗人IgG(Fc)抗体的表面,结合动力学参数采用Insight软件(BIAcore,Cytiva)进行评估。
5、实验结果
抗病毒活性检测的实验结果显示,在处理0、1和2h后,以及用小扁豆凝集素预孵育假病毒1h后,观察到小扁豆凝集素对病毒感染性的显著抑制作用(见图6A);用小扁豆凝集素预孵育Huh7细胞后,用大量PBS洗涤细胞以清除残留的凝集素,结果显示没有抑制作用,而不使用PBS洗涤的预孵育导致了显著的剂量依赖性的感染抑制作用;随着添加小扁豆凝集素时间的延长,抑制作用逐渐减弱,4h后无病毒抑制,表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段发挥作用,且直接与SARS-CoV-2的S蛋白反应;
CPE抑制实验的结果显示,与SARS-CoV-2活病毒预孵育的小扁豆凝集素显示出了较强的抑制作用,IC50为60.26μg/mL(1.2μM)(见图6B),进一步表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段与SARS-CoV-2直接反应发挥抗病毒的作用;
聚糖阵列分析的结果显示,小扁豆凝集素与两种类型的N糖的结合效果最佳:从Man-5到Man-9的高甘露糖型N糖,以及非还原端含有GlcNAc的N糖(见图7A),高甘露糖型Man-8和Man-9的结合亲和力最高,非还原端含有GlcNAc 的N-聚糖可以是单天线复杂型N-聚糖(N020)、双天线复杂型N-聚糖(N000)或杂合型N-聚糖(N010)。凝集素分别与甲基α-D-甘露醇苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺 (D-GlcNAc)和D-葡萄糖孵育后,抑制了小扁豆凝集素的抗病毒活性,其中α-D- 甘露醇苷的抑制作用最强(见图7B),表明小扁豆凝集素的抗病毒活性直接依赖于其高甘露糖型/GlcNAc结合功能;
基于SPR的竞争性结合测定的结果显示,50nM的小扁豆凝集素可有效地阻断ACE2受体和S三聚体蛋白的结合,从而在病毒感染的早期发挥抗病毒的作用。糖基化位点N165、N234和N343位于S蛋白受体结合位点周围(见图8D), N234的N-聚糖是高甘露糖型,由Man-8(53.2%)、Man-9(40.3%)、Man-7(3.4%)、 Man-6(1.5%)和Man-5(1.5%)组成,在N165和N343中,N-聚糖以复杂型为主,在N165中也发现了约20%的高甘露糖型聚糖Man-5和少量的杂合型聚糖(见图 8A-C),小扁豆凝集素与各糖基化位点特异性结合聚糖的比例见图8E,N234、 N165和N343位点的大多数聚糖可与小扁豆凝集素结合,表明了小扁豆凝集素可与N234、N165和N343位点的N-聚糖结合,并阻断ACE2与RBD的结合,从而抑制SARS-CoV-2感染,发挥抗病毒的作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.植物凝集素PHA-E在制备用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用;
所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及其突变株;
所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物还包含药学上可接受的辅料、其他抗病毒的药物和/或化合物。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述药学上可接受的辅料包括矫味剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂、包衣材料、润滑剂、崩解剂中的任意一种或多种。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述其他抗病毒的药物和/或化合物包括利巴韦林、IFN-α、IFN-β、IFN-τ、IFN-ω、IFN-γ、洛匹那韦、奈非那韦、阿比多尔、瑞德西韦、溴己新、金精三羧酸、磷酸氯喹、甘草甜素、黄芩甙中的任意一种或多种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型选自注射剂、涂剂、洗剂、气雾剂、油制剂、口服剂、透皮贴剂中的任意一种。
6.植物凝集素PHA-E在制备抑制冠状病毒在细胞中复制的抑制剂中的应用;
所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及其突变株;
所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
7.权利要求6中所述的抑制剂在体外非治疗目的地抑制冠状病毒在细胞中的复制中的应用;
所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及其突变株;
所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。
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