CN113244373B - 麦胚芽凝集素在制备抑制冠状病毒的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麦胚芽凝集素在制备抑制冠状病毒的产品中的应用，本发明首次发现麦胚芽凝集素对SARS‑CoV、MERS‑CoV、SARS‑CoV‑2及SARS‑CoV‑2突变株均具有较好的抗病毒活性，且对水疱性口炎病毒(VSV)也表现出一定的抗病毒活性，可用于治疗和预防冠状病毒引起的感染，可作为冠状病毒感染的防治候选药物，具有较好的应用价值。

Description

麦胚芽凝集素在制备抑制冠状病毒的产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及麦胚芽凝集素在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。

背景技术

冠状病毒(Coronaviruses，CoVs)是导致呼吸道感染的主要病毒性病原体之一(Fehr A R,Perlman S.Coronaviruses:an overview of their replication andpathogenesis[J].Coronaviruses,2015:1-23.)，冠状病毒属于嵌套病毒目，冠状病毒科，冠状病毒的基因组和亚基因组至少包含6个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，一般拥有5’帽(Leader)和3’端(Ends)序列，5’帽开放阅读框编码产生多种非结构蛋白，非结构蛋白参与病毒的转录和复制；冠状病毒有至少4个主要结构蛋白，包括刺突蛋白(Spikeprotein，S蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N蛋白)，这些蛋白均在病毒基因组的3’端ORF编码，这些蛋白对于病毒-细胞受体结合至关重要，也是产生结构完整的冠状病毒颗粒所必需的(Schoeman D,Fielding B C.Coronavirus envelope protein:current knowledge[J].Virology journal,2019,16(1):1-22.)，其中，S蛋白含有受体结合区域(Receptorbinding domain，RBD)，能特异性结合宿主细胞表面的受体，介导冠状病毒进入宿主细胞内(Li F.Structure,function,and evolution of coronavirus spike proteins[J].Annual review of virology,2016,3:237-261.)。

根据遗传和抗原的标准，冠状病毒可以分为4类，即α、β、γ和δ冠状病毒(Fehr AR,Perlman S.Coronaviruses:an overview of their replication and pathogenesis[J].Coronaviruses,2015:1-23.)，其可引起多种动物的多系统感染，其中，α-冠状病毒和β-冠状病毒仅感染哺乳动物，γ-冠状病毒和δ-冠状病毒可感染鸟类，但其中一些也可感染哺乳动物(Woo P C Y,Lau S K P,Lam C S F,et al.Discovery of seven novelMammalian and avian coronaviruses in the genus deltacoronavirus supports batcoronaviruses as the gene source of alphacoronavirus and betacoronavirus andavian coronaviruses as the gene source of gammacoronavirus anddeltacoronavirus[J].Journal of virology,2012,86(7):3995-4008.)，相关研究已经发现了7种可能引起人类疾病的冠状病毒，包括3种在人类中引起严重的呼吸综合征的高致病性病毒SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2，以及其他4种人冠状病毒HCoV-NL63(Humancoronavirus NL63)、HCoV-229E(Human coronavirus 229E)、HCoV-OC43(Humancoronavirus OC43)和HCoV-HKU1(human coronavirus HKU1)，这4种病毒仅仅引发轻度呼吸道疾病。近期，有研究发现SARS-CoV-2发生了突变，产生了一系列的突变株，其中包括占主导地位的具有D614G突变的突变株，以及南非突变株B.1.351、英国突变株B.1.1.7、巴西突变株P.1、印度突变株B.1.617等，这些SARS-CoV-2突变株的出现给冠状病毒的预防和治疗提出了新的挑战。

鉴于此，本发明的目的在于筛选出一种对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株均具有较好的抗病毒活性的物质，以更好的应对当前突变株的出现带来的挑战。本发明经实验验证发现筛选出的麦胚芽凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA)对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株均表现出较好的抗病毒活性，且对水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)也表现出一定的抗病毒活性，可用于治疗和预防冠状病毒引起的感染。目前，尚未有麦胚芽凝集素在治疗冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株引起的感染中的应用。

发明内容

本发明的目的在于应对当前SARS-CoV-2突变株出现的问题，提供了麦胚芽凝集素在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了麦胚芽凝集素在制备用于治疗、改善或预防病毒疾病的药物中的应用。

进一步，所述病毒疾病包括由冠状病毒、弹状病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、丝状病毒、副粘病毒、正粘病毒、本雅病毒、沙粒病毒、微小核糖核酸病毒、披膜病毒、黄热病病毒引起的疾病；

优选地，所述病毒疾病为由冠状病毒、弹状病毒引起的疾病；

更优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；

最优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；

最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；

最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1；

更优选地，所述弹状病毒包括水疱性口炎病毒、狂犬病病毒；

最优选地，所述弹状病毒为水疱性口炎病毒。

第二方面，本发明提供了一种药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含有效量的麦胚芽凝集素。

所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料；

优选地，所述载体和/或辅料包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂；

更优选地，所述稀释剂包括乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；

更优选地，所述粘合剂包括淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；

更优选地，所述表面活性剂包括聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；

更优选地，所述致湿剂包括甘油、淀粉等；

更优选地，所述吸附载体包括淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；

更优选地，所述润滑剂包括硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；

更优选地，所述填充剂包括甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；

更优选地，所述崩解剂包括交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

进一步，所述药物组合物还包括用于预防和/或治疗病毒疾病的成分；

优选地，所述成分包括白介素抑制剂、两面神激酶抑制剂、糖皮质激素、蛋白酶抑制剂、奥司他韦或其盐、托那韦、法匹拉韦、干扰素、肿瘤坏死因子抑制剂、洛匹那韦、利巴韦林、瑞德西韦、氯喹或其盐、羟基氯喹或其盐、阿比多尔或其盐、肠道微生态调节剂中的一种或多种。

进一步，所述药物组合物还可包括药物中适用的添加剂；

优选地，所述添加剂选自防腐剂、着色剂、调味剂、香料、抗氧化剂、乳化剂、粘稠剂、保鲜剂、氨基酸、微量元素、蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素中的一种或多种。

进一步，所述药物组合物的剂型选自注射药剂、喷剂、胶囊、片剂、丸剂、颗粒冲剂中的任意一种；

优选地，所述药物组合物的释放形式为常释、延释、缓释、控释中的任意一种。

上述药物组合物中还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等，如需要，也可以向药物组合物制剂中添加其它材料，上述药物组合物可以制成多种剂型，包括(但不限于)：片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等，上述各种剂型的药物组合物均可以按照药学领域中的常规方法进行制备，使用上述剂型可以经注射给药，所述注射给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道给药；呼吸道给药，如经鼻腔给药；粘膜给药。

第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的药物组合物在治疗、改善或预防病毒引起的感染性疾病中的应用；

优选地，所述病毒引起的感染性疾病包括由冠状病毒、弹状病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、丝状病毒、副粘病毒、正粘病毒、本雅病毒、沙粒病毒、微小核糖核酸病毒、披膜病毒、黄热病病毒引起的疾病；

更优选地，所述病毒引起的感染性疾病为由冠状病毒、弹状病毒引起的疾病；

最优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；

最优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；

最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；

最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1；

最优选地，所述弹状病毒包括水疱性口炎病毒、狂犬病病毒；

最优选地，所述弹状病毒为水疱性口炎病毒。

第四方面，本发明提供了本发明第二方面所述的药物组合物在治疗、改善或预防病毒感染中的应用；

优选地，所述病毒包括冠状病毒、弹状病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、丝状病毒、副粘病毒、正粘病毒、本雅病毒、沙粒病毒、微小核糖核酸病毒、披膜病毒、黄热病病毒；

更优选地，所述病毒为冠状病毒、弹状病毒；

最优选地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、及其突变株；

最优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；

最优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；

最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1；

最优选地，所述弹状病毒包括水疱性口炎病毒、狂犬病病毒；

最优选地，所述弹状病毒为水疱性口炎病毒。

第五方面，本发明提供了本发明第二方面所述的药物组合物在抑制冠状病毒、弹状病毒增殖中的应用；

优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；

更优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；

最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1；

优选地，所述弹状病毒包括水疱性口炎病毒、狂犬病病毒；

更优选地，所述弹状病毒为水疱性口炎病毒。

第六方面，本发明提供了本发明第二方面所述的药物组合物在抑制冠状病毒、弹状病毒产生细胞病变效应中的应用；

优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、及其突变株；

更优选地，所述突变株包括B.1.1.7、B.1.351、P.1、D614G+I472V、D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、A222V+D614G、K417N+D614G、S477N+D614G、E484K+D614G、N501Y+D614G；

最优选地，所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1；

优选地，所述弹状病毒包括水疱性口炎病毒、狂犬病病毒；

更优选地，所述弹状病毒为水疱性口炎病毒。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义，术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义，在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包含”及其他形式的使用是非限制性的。

为了使本发明可以更容易地理解，对以下术语进行了解释：

本文中使用的术语“SARS-CoV-2”，是一类新型病毒，同“新型冠状病毒”、“2019新型冠状病毒”、“2019-nCoV”、“Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2”。

本文中使用的术语“突变株”，是指由各种原因所导致的，病毒的遗传物质发生改变而形成的病毒突变株，在本发明的实施例中，所述突变株包括SARS-CoV-2 S蛋白突变株和流行性突变株。

本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量，例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映，药学上有效量取决于几个因素，包括(但不限于)治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。

本发明的优点和有益效果如下：

本发明首次发现麦胚芽凝集素对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及SARS-CoV-2突变株均具有较好的抗病毒活性，且对水疱性口炎病毒(VSV)也表现出一定的抗病毒活性，可用于治疗和预防冠状病毒引起的感染，可作为冠状病毒感染的防治候选药物，具有较好的应用价值。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是采用假病毒中和实验检测不同的植物凝集素对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和VSV的抗病毒活性的结果统计图；

图2是SARS-CoV-2 S蛋白突变株和流行性突变株对不同的植物凝集素的中和敏感性的结果图；

图3是不同的植物凝集素对3种流行性突变株的抗病毒活性的结果图，其中，A图：B.1.1.7，B图：B.1.351，C图：P.1；

图4是植物凝集素的血细胞凝集活性的实验结果图；

图5是小扁豆凝集素对Balb/c小鼠体重增加的影响结果统计图；

图6是小扁豆凝集素在早期阶段抑制SARS-CoV-2感染的结果图，其中，A图：小扁豆凝集素在处理前后抑制假病毒感染的结果图，B图：CPE抑制实验的结果图；

图7是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2 S蛋白的反应结果图，其中，A图：Cy3标记的小扁豆凝集素聚糖阵列结果图；B图：L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)、甲基α-D-甘露醇苷和D-GlcNAc与甲基α-D-甘露醇苷的摩尔混合物对小扁豆凝集素中和活性的竞争性抑制结果图，C图：小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性抑制结果图；

图8是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2 S蛋白的反应结果图，其中，A图：N165的N-聚糖图谱，B图：N234的N-聚糖图谱，C图：N343的N-聚糖图谱，D图：SARS-CoV-2糖蛋白三聚体(Wuhan-Hu-1，GenBank:MN908947，PDB ID 6VSB)预融合结构上的代表聚糖N165(紫色)、N234(黄色)和N343(红色)，其中一个RBD为“上”构象，另外两个RBD为“下”构象，ACE2受体结合位点用淡蓝色表示，E图：N165、N234和N343能与小扁豆凝集素结合的N-聚糖比例的饼状结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白结合活性及抗病毒活性的检测

1、实验材料

小扁豆凝集素(Lentil lectin)、麦胚芽凝集素(WGA)、无梗接骨木凝集素(SSL)、花生凝集素(Peanut lectin)、怀槐凝集素(MAL)均购自于Wako(Japan)；曼陀罗凝集素(DSL)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)、雪花莲凝集素(GNL)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、来源于红芸豆的植物凝集素-M(PHA-M)和植物凝集素-P(PHA-P)均购自于Sigma Aldrich；HEK293细胞表达的SARS-COV-2 S三聚体购自于ACRO Biosystems公司(中国，北京)；293T细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供；Huh7细胞由日本研究生物资源保藏中心(JCRB)提供；构建了SARS-CoV-2spike(Wuhan-Hu-1，MN908947；hCoV-19/South Africa/KRISP-K007869/2020，B.1.351，EPI_ISL_860630；hCoV-19/England/QEUH-F56F0F/2021，B.1.1.7，EPI_ISL_852526；hCoV-19/Brazil/AM-991/2020，P.1，EPI_ISL_833171)、SARS-CoV spike(GenBank:AY278491)、MERS-CoV spike(GenBank:AFS88936.1)、VSV glycoprotein(GenBank:M27165)表达质粒，其中，Wuhan-Hu-1spike表达质粒用作诱变的模板。

2、假病毒的制备、滴定和抗病毒的分析

首先进行假病毒的制备和滴定，在假病毒制备滴定完成后，采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID₅₀/mL)，并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μLHuh7细胞(2×10⁵cells/mL)，并在37℃、5％CO₂的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC₅₀。

3、表面等离子体共振(SPR)方法检测凝集素与SARS-CoV-2 S蛋白的结合活性

SPR检测在BIAcore T200仪器(BIAcore，Cytiva)上进行，采用胺偶联法将SARS-CoV-2 S蛋白三聚体固定在CM5芯片的第二流通池上，首先将400mM N-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐与100mM N-羟基琥珀酰亚胺的1:1混合物激活传感器芯片表面，将S三聚体稀释至25μg/mL的浓度，采用10mM醋酸钠溶液(pH 5.0)稀释，并注入活化的表面，用1.0M乙醇胺/盐酸(pH 8.5)溶液以10μL/min的速度阻断残留的反应表面封闭7min，达到约1000个响应单元(RU)的固定化水平。采用类似胺偶联剂处理流通池1，但不注射任何配体，作为空白对照。

采用0.01M HEPES、0.05％聚山梨酯20、150mM NaCl和3mM EDTA缓冲液对凝集素进行系列稀释，将稀释后的凝集素以30μL/min的速度注入芯片上2min，然后解离150s，用甘氨酸1.5(Cytiva)以20μL/min的浓度再生表面30s，以去除结合凝集素。

4、采用SEC-MALS测定蛋白质的分子量

通过体积排阻色谱法将凝集素流过TSK G3000 SWXL色谱柱(Tosoh BioscienceLLC，King of Prussia，PA，USA)，并通过三角光散射检测器(DAWN)和示差折光检测器(Optilab T-rEX，Wyatt Technology，Santa Barbara，California)进行检测，采用ASTRA 7进行数据分析，计算蛋白质的分子量(Mw)。

5、实验结果

实验结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对SARS-CoV-2 S蛋白均具有较强的结合活性(见表1)，而花生凝集素和怀槐凝集素(MAL)对SARS-CoV-2 S蛋白对SARS-CoV-2 S蛋白则没有结合活性；

假病毒中和实验的结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒均具有较强的抑制活性，5种凝集素对SARS-CoV-2的IC50在8.5～33.8μg/mL之间，其中，小扁豆凝集素和麦胚芽凝集素(WGA)对SARS-CoV-2的抑制活性最强。麦胚芽凝集素(WGA)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对水疱性口炎病毒VSV也显示出较强的抑制活性，无梗接骨木凝集素(SSL)虽然对SARS-CoV和SARS-CoV-2均有一定的抑制作用，但对MERS-CoV无抑制作用，花生凝集素未表现出病毒抑制作用，怀槐凝集素(MAL)对SARS-CoV-2 S蛋白无明显的结合活性，对SARS-CoV-2也无抗病毒活性，仅对MERS-CoV有不显著的抗病毒活性(见表1和图1)，结果表明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2 S蛋白具有较强的结合活性，且同时对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV均有较强的抗病毒活性。

表1不同的植物凝集素对SARS-CoV-2的抗病毒活性的结果

实施例2植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用检测

本实施例分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用，所述突变株包括英国流行突变株B.1.1.7、南非流行突变株B.1.351、巴西流行突变株P.1、组合突变株D614G+I472V、组合突变株D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、组合突变株A222V+D614G、组合突变株K417N+D614G、组合突变株S477N+D614G、组合突变株E484K+D614G、组合突变株N501Y+D614G等突变株；

凝集素主要针对糖蛋白的糖基部分，在本实施例中，发明人研究了SARS-CoV-2 S蛋白的糖化位点的变化是否会影响其对凝集素的中和敏感性，共构建28个N-连接糖基化位点缺失(22个位点，24个突变体)或O-连接糖基化位点缺失(4个预测位点，4个突变体)的人工突变体。

1、基于假病毒(SARS-CoV-2 S蛋白突变株)的中和敏感性实验

分别检测了28个糖基化突变体以及各种组合突变株对各植物凝集素的敏感性，具体实验方法如下：

采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID₅₀/mL)，并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μL Huh7细胞(2×10⁵cells/mL)，并在37℃、5％CO₂的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC₅₀。

2、植物凝集素的抗病毒活性检测实验

分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2流行性突变株B.1.1.7、B.1.351和P.1的抗病毒活性，具体实验方法如下：

采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID₅₀/mL)，并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μL Huh7细胞(2×10⁵cells/mL)，并在37℃、5％CO₂的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC₅₀。

3、实验结果

中和敏感性的实验结果显示，小扁豆凝集素对28个糖基化突变体的抗病毒活性(中和敏感性)均未受影响，IC50的倍数变化均在4.0以下(见图2)，N122Q和N801Q对GNL的敏感性降低了4倍，N343Q对DSL和GNL的敏感性降低了4倍，而N709Q和位于近端膜C端的三个突变(N1098Q、N1134Q和N1173Q)对PHA-L、PHA-E的敏感性增加了4-10倍，N1098Q对WGA的敏感性增加了6倍(见图2)，表明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))可以对28个糖基化突变体高效中和；

抗病毒活性检测的结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对流行性突变株B.1.1.7、B.1.351和P.1的抗病毒活性与对SARS-CoV-2的抗病毒活性相似，均表现出一定的抗病毒活性，其中，小扁豆凝集素和WGA对3种流行性突变株的抗病毒活性最强(见图3A-C)，进一步证明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2及其流行性突变株均具有抗病毒活性。

实施例3植物凝集素的血细胞凝集活性和细胞毒性的检测

由于许多的天然凝集素都会引起血细胞凝集，因此，在本实施例中发明人研究了不同植物凝集素的血细胞凝集活性，并对Huh7和293T细胞的细胞毒性进行了研究。

1、植物凝集素的血细胞凝集活性的检测

采用鸡血标本检测植物凝集素的血细胞凝集活性，用PBS洗涤公鸡红细胞，并以1％(v/v)的终浓度重悬，将50μL 2倍系列稀释的植物凝集素溶液与等体积的红细胞溶液在96孔圆底板中混合，将流感抗原(B/Maryland/15/2016，NIBSC-UK-EN63QG，NIBSC代码：18/104，HA：69μg/mL)进行2倍系列稀释，并作为阳性对照，PBS溶液用作阴性对照，将板在室温条件下孵育1小时，并通过目测确定各种植物凝集素的血细胞凝集活性。

2、植物凝集素的细胞毒性的检测

采用Huh7和293T细胞对各种植物凝集素的细胞毒性进行检测，植物凝集素对Huh7和293T细胞的细胞毒性活性以CC50(50％细胞毒浓度)表示；

此外，采用Balb/c小鼠对小扁豆凝集素在体内的影响进行了验证，在第0天，对小鼠腹膜内注射20mg/kg的小扁豆凝集素(n＝6)或PBS(n＝6)，其中，PBS为阴性对照，并在注射后每天测量小鼠的体重并记录，以Balb/c小鼠的体重增加作为机体健康状况的指标。

3、实验结果

血细胞凝集活性检测的实验结果显示，PBS没有显示出任何血凝活性，已知的血凝剂流感血凝剂HA在浓度高于0.03μg/mL时显示出血凝活性，小扁豆凝集素在最高浓度为1mg/mL时才会表现出较弱的凝集活性，琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)在1mg/mL时也未表现出血凝活性(见图4)，表明了小扁豆凝集素和琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)均具有较弱的血凝活性；

细胞毒性检测的实验结果显示，所有的植物凝集素在500μg/mL时均未表现出细胞毒性(见表1)，证明了本发明所述的植物凝集素不具有细胞毒性，进一步采用动物实验验证小扁豆凝集素在体内的影响的结果表明，在20mg/kg的注射量下，并未出现Balb/c小鼠的体重下降，进一步证明了所述的植物凝集素不具有细胞毒性(见图5)。

实施例4小扁豆凝集素抗SARS-CoV-2感染的机制研究

为了研究小扁豆凝集素对SARS-CoV-2感染的抑制作用的机制，本发明对其体外作用模式进行了研究，具体实施方式如下：

1、对小扁豆凝集素的抗病毒活性进行检测

首先用小扁豆凝集素分别对Huh7细胞或假病毒进行预处理和后处理，并检测其抗病毒活性。小扁豆凝集素预处理：用系列稀释的凝集素溶液在37℃的条件下与Huh7细胞共孵育1h，PBS洗涤5次后(此洗涤步骤也可省略)，用SARS-CoV-2假病毒感染细胞；小扁豆凝集素后处理：将SARS-CoV-2假病毒分别在37℃的条件下感染Huh7细胞0、1、2、4、6、8和24h后，再加入系列稀释的小扁豆凝集素，检测小扁豆凝集素对病毒感染的影响。

2、基于SARS-CoV-2活病毒的细胞病变抑制实验(CPE抑制实验)

首先将梯度稀释的小扁豆凝集素和100TCID50的SARS-CoV-2活病毒等体积混合，并在37℃的条件下孵育1小时，然后将混合物转移至铺有Vero E6细胞的96孔培养板中，37℃培养3天后，采用显微镜观察细胞的形态和状态，并记录相关数据，根据所得数据计算CPE抑制率，评估小扁豆凝集素对SARS-CoV-2活病毒的抗病毒作用。

3、聚糖阵列分析

用Cy3标记植物凝集素，并用基于假病毒的抗病毒测定实验检测其生物活性，用封闭缓冲液封闭N-Glycan微阵列载玻片(Creative Biochip，南京，中国)30分钟，然后用PBST(PBS缓冲液，0.05％Tween 20)洗涤，加入1～8μg/mL凝集素-Cy3，37℃孵育2小时，洗涤以去除未结合的凝集素，然后对微阵列载玻片进行扫描和分析。

4、基于SPR的ACE2竞争性结合测定

小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性分析是采用BIAcore T200系统(BIAcore，Cytiva)在25℃的条件下进行分析的，通过抗人IgG(Fc)抗体(Cat.No.BR100530,Cytiva)以5μg/mL的浓度将人ACE2-hFc标签捕获到S系列传感器芯片CM5的第二个流通池中，注射时间为30s，流速为10μL/min，以产生350RU的响应，在运行缓冲液(1×HEPES、0.005％Tween-20)中制备400nM SARS-CoV-2 S蛋白的测定溶液，其中含有浓度为0nM、0.5nM、5nM、20nM、50nM的小扁豆凝集素，流速为30μL/min，缔合时间为60s，解离时间为90s，检测对人ACE2结合的反应，用3M MgCl₂再生人ACE2和抗人IgG(Fc)抗体的表面，结合动力学参数采用

Insight软件(BIAcore，Cytiva)进行评估。

5、实验结果

抗病毒活性检测的实验结果显示，在处理0、1和2h后，以及用小扁豆凝集素预孵育假病毒1h后，观察到小扁豆凝集素对病毒感染性的显著抑制作用(见图6A)；用小扁豆凝集素预孵育Huh7细胞后，用大量PBS洗涤细胞以清除残留的凝集素，结果显示没有抑制作用，而不使用PBS洗涤的预孵育导致了显著的剂量依赖性的感染抑制作用；随着添加小扁豆凝集素时间的延长，抑制作用逐渐减弱，4h后无病毒抑制，表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段发挥作用，且直接与SARS-CoV-2的S蛋白反应；

CPE抑制实验的结果显示，与SARS-CoV-2活病毒预孵育的小扁豆凝集素显示出了较强的抑制作用，IC50为60.26μg/mL(1.2μM)(见图6B)，进一步表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段与SARS-CoV-2直接反应发挥抗病毒的作用；

聚糖阵列分析的结果显示，小扁豆凝集素与两种类型的N糖的结合效果最佳：从Man-5到Man-9的高甘露糖型N糖，以及非还原端含有GlcNAc的N糖(见图7A)，高甘露糖型Man-8和Man-9的结合亲和力最高，非还原端含有GlcNAc的N-聚糖可以是单天线复杂型N-聚糖(N020)、双天线复杂型N-聚糖(N000)或杂合型N-聚糖(N010)。凝集素分别与甲基α-D-甘露醇苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)和D-葡萄糖孵育后，抑制了小扁豆凝集素的抗病毒活性，其中α-D-甘露醇苷的抑制作用最强(见图7B)，表明小扁豆凝集素的抗病毒活性直接依赖于其高甘露糖型/GlcNAc结合功能；

基于SPR的竞争性结合测定的结果显示，50nM的小扁豆凝集素可有效地阻断ACE2受体和S三聚体蛋白的结合，从而在病毒感染的早期发挥抗病毒的作用。糖基化位点N165、N234和N343位于S蛋白受体结合位点周围(见图8D)，N234的N-聚糖是高甘露糖型，由Man-8(53.2％)、Man-9(40.3％)、Man-7(3.4％)、Man-6(1.5％)和Man-5(1.5％)组成，在N165和N343中，N-聚糖以复杂型为主，在N165中也发现了约20％的高甘露糖型聚糖Man-5和少量的杂合型聚糖(见图8A-C)，小扁豆凝集素与各糖基化位点特异性结合聚糖的比例见图8E，N234、N165和N343位点的大多数聚糖可与小扁豆凝集素结合，表明了小扁豆凝集素可与N234、N165和N343位点的N-聚糖结合，并阻断ACE2与RBD的结合，从而抑制SARS-CoV-2感染，发挥抗病毒的作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.麦胚芽凝集素在制备用于治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的应用；

所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2及其突变株；

所述突变株为B.1.1.7、B.1.351、P.1。

2.麦胚芽凝集素在制备用于治疗水疱性口炎病毒引起的疾病的药物中的应用。

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