CN102399907A - 用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光pcr引物、探针及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针，分别如序列表中SEQ ID NO：1～6所示的寡核苷酸。含有上述引物及探针的多重实时检测试剂盒可一次性联合检测小鼠腺病毒和小鼠脱脚病病毒，具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。

Description

用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针、试剂盒及其检测方法。 

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。 

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠腺病毒和脱脚病病毒均属于二类，目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。 

小鼠腺病毒(Murine adenoviruses，简称MADV)在小鼠群中多呈隐 性感染，但也可引起致死性疾病。这类病毒的带毒期和排毒期均较长，严重影响小鼠健康。小鼠是小鼠腺病毒的自然宿主，实验小鼠在笼内主要经粪便和尿液接触传播。不同毒株MADV，其毒力差异很大，MADV对不同年龄小鼠的易感性也不相同，临床表现多种多样。自然流行多由于感染FL株引起，病鼠表现弓背、被毛粗糙、食欲下降等症状，新生乳鼠可死亡。K87株感染新生乳鼠和成年鼠均不发病，只是经粪便不断向外排毒并产生高滴度的抗体。裸鼠也可自然发生MADV感染，但株型未定。用FL株接种乳裸鼠，可造成十二指肠出血和致死性消耗性疾病。 

小鼠脱脚病病毒也叫鼠痘病毒(poxvirus of mice，MPV)，能引起鼠痘。鼠痘多呈爆发性流行，致死率较高，常造成小鼠全群淘汰，危害极大。临床表现以四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征，故鼠痘病毒又称脱脚病病毒(ectromelis virus，以下将此病毒简称为EV)。该病在世界各地的实验室鼠群中广泛流行，在我国鼠群中呈散发性流行。 

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。 

而目前发展十分成熟的实时荧光PCR技术(Real-time FluorencePolymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Appliedbiosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过 Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定性定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团所发射的荧光信号被淬灭基团吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定性定量分析。 

实时荧光PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定性/定量，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。但迄今为止，使用多重实时荧光PCR技术同时对小鼠腺病毒和脱脚病病毒进行检测方面还未见有报道，同时一次性检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒更经济、省力、快速。 

发明内容

为了解决现有小鼠病毒检测方法的不足，本发明提供了一种同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针及其试剂盒，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。 

本发明的一个目的是提供用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物，其中， 

特异性地扩增小鼠腺病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸； 

特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQID NO：3的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：4的下游引物组成的一对寡核苷酸。 

本发明的另一个目的是提供一种与上述引物配合使用的探针，其中， 

特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO：5的核苷酸序列； 

特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针具有序列表中的SEQ IDNO：6的核苷酸序列。 

其中，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针与特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针均为检测病毒的探针，后述提及处可简称为检测探针。 

优选地，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。 

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、ROX中 的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse或BHQ1或BHQ2。 

优选地，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针与特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针可具有相同或不同的荧光报告基团。 

优选地，两种病毒的探针5’端均为FAM标记，3’端为TAMRA标记。 

优选地，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针5’端为JOE标记，3’端为TAMRA标记。 

本发明人设计了多对PCR引物和探针，经过长期大量的实验从众多引物对中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物、探针。小鼠腺病毒、脱脚病病毒的扩增目的片段大小分别为131bp、119bp。上述引物分别对小鼠腺病毒/脱脚病病毒具有高度的保守性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用上述引物、探针进行PCR扩增，可实现准确定性、定量检测。 

本发明的再一个目的是提供一种同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述提及的引物或探针。 

优选地，每个试剂盒中两种病毒的引物探针混合液的体积比为1∶1；每种病毒引物探针混合液中，优选将浓度均为10μM的引物、探针按照上游引物∶下游引物∶探针体积比为1∶1∶1的比例混合成引物探针混合液。 

优选地，所述试剂盒还包括内标DNA标准品、内标DNA标准品的扩增引物和探针。后述，所述内标DNA标准品的扩增引物和探针分别简 称为内标引物、内标探针。 

优选地，所述内标DNA标准品为含序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的pT easy-3质粒；所述内标DNA标准品的扩增引物是由具有序列表中的SEQ ID NO：8的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：9的下游引物组成的一对寡核苷酸，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO：10的核苷酸序列。 

优选地，所述内标DNA标准品的浓度为2×10⁷copies/μl。 

优选地，所述内标探针与两种病毒检测探针共三种探针分别由相同的荧光基团标记或不同的荧光基团标记，但是至少内标探针的的荧光基团不同于检测探针的荧光基团。优选地Taqman探针为Taqman-MGB探针BHQ1/BHQ2等。 

优选地，所述内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，两种病毒的检测探针5’端均为FAM标记，3’端为TAMRA标记。 

优选地，所述内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针5’端为JOE标记，3’端为TAMRA标记。 

优选地，所述试剂盒还包括阳性DNA标准品。优选地，所述阳性DNA标准品的浓度为2×10⁷copies/μl。 

优选地，所述阳性标准品为含小鼠腺病毒和脱脚病病毒扩增目的片段的序列的pMD18-T重组质粒。 

当所述试剂盒含有内标DNA标准品、内标引物、内标探针时，本 试剂盒可进行定性或相对定量检测；当所述试剂盒只含有阳性DNA标准品时，可进行绝对定量检测；如所述试剂盒同时含有内标DNA标准品、、内标引物、内标探针和阳性DNA标准品，则本试剂盒不仅可进行绝对定量检测，同时因使用内标DNA标准品从提取步骤(而不只是荧光定量PCR过程)开始衡量了整个方法的可行性，实现了对整个反应体系进行质控。 

优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、阴性质控品、空白对照。其中，PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix。 

本发明的又一目的是提供一种使用上述提及的试剂盒同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测方法，其中，所述方法所述实时荧光PCR的退火温度为60℃。 

优选地，本发明提供一种上述提及的试剂盒用于同时检测鼠源生物制品中小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测方法。 

优选地，所述多重实时荧光PCR的反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，共40个循环。 

优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，将所述内标DNA标准品十倍稀释成不同浓度的内标定量标准品，以所述内标定量标准品作为模板进行实时荧光PCR检测，得到内标标准曲线。 

优选地，所述方法还包括将所述阳性DNA标准品十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行多重实时荧光PCR检测，得到检测病毒的标准曲线。 

使用本发明试剂盒检测时，可以将进行两种病毒的单管同时检测， 也可将异管同时检测。单管同时检测时优选扩增两种病毒和内标的探针均具有不同的荧光报告基团。优选地，所述内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针5’端为JOE标记，3’端为TAMRA标记。 

本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针、试剂盒或检测方法在检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒残留时的应用。 

优选地，本发明的目的是提供上述提及的引物或探针、试剂盒或检测方法在检测鼠源生物制品中小鼠腺病毒和脱脚病病毒残留时的应用。 

与现有检测方法相比，本发明提供的同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒及方法具有以下优点： 

1、简单快速：现有的药典小鼠腺病毒检测方法为：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角度检测生物制品中小鼠腺病毒的潜在感染，需时长(1～4周时间)，而本发明从核酸角度对腺病毒和脱脚病病毒进行联合检测，操作更为简便快速，只需要6小时左右即可出结果，且对操作实验室环境要求不高，规避了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高了生物制品质控质量； 

2、灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠腺病毒的潜在感染，其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典规定方法而言，提高了 检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光PCR同时检测鼠源生物制品中腺病毒和脱脚病病毒时，不仅可定性也可以准确定量，目标DNA在10²～10⁷浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达到20copies/μl(100copies/reaction)； 

3、重复性、准确性和特异性：本发明中的引物和探针分别根据小鼠腺病毒、脱脚病病毒的同源性序列设计，设计时充分考虑各引物间的退火温度，是经筛选后得到的特异性引物和探针，且与小鼠基因组无同源性，检测特异性强，重复性好； 

4、回收率高：本发明实时荧光PCR方法回收率均达到了50％以上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法； 

5、对整个反应体系进行质控：使用内标DNA标准品从提取步骤(而不只是荧光定量PCR过程)开始衡量了整个方法的可行性，大大提高了本发明的准确性。 

附图说明

图1为多重实时荧光PCR检测小鼠腺病毒时的定量曲线； 

图2为多重实时荧光PCR检测小鼠脱脚病病毒时的定量曲线； 

图3为多重实时荧光PCR检测小鼠腺病毒时的标准曲线； 

图4为多重实时荧光PCR检测小鼠脱脚病病毒时的标准曲线。 

具体实施方式

以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范 围。 

下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。 

实施例1  同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针 

从genbank中查到MADV-1、MADV-2、MADV-3的全长基因组序列，它们的genbank号分别为NC_000942/AC_000012、NC_014899/H_049560和NC_012584/EU835513。进行序列比对，找出具有其保守序列区的同源序列SEQ ID NO：11； 

根据文献(David J.Esteban et al.，2005)，对小鼠脱脚病病毒ECTV-Mos的基因组进行分析，并结合文献(Gloria Ribas et al.，2003)，选择ECTV-Mos的保守基因EVM170(即crmD基因)进行ECTV同源性分析。将该基因序列与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库进行序列比对，及与小鼠基因组数据库进行序列比对，确定同源序列SEQ ID NO：12。 

分别针对上述找出的保守的同源序列区域设计实时荧光PCR检测专用引物和探针序列。因要同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒，故在筛选引物时还要考虑分别针对两种病毒的专用引物要求退火温度相近。 

其中优选的引物、探针序列如下表1所示： 

表1 

上述两种检测探针标记的荧光基团可以相同也可以不同： 

优选所述探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团TAMRA标记。 

经同源性比对发现：设计的引物、探针分别只对其特异性检测的小鼠腺病毒/脱脚病病毒具有高度保守型，与小鼠基因组/EST、及其他近缘病毒不同源，其特异性较高。 

实施例2  同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法 

2.1同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒 

该试剂盒的组分为： 

两种病毒的引物探针混合液(MADV反应液、EV反应液) 

2×Taqman PCR Mix 

无菌ddH₂O 

其中，2×Taqman PCR Mix可直接使用AB公司的产品Taqman GeneExpression Master MiX。 

上述MADV反应液由特异性地扩增小鼠腺病毒的专用引物、探针组成；EV反应液由特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用引物、探针组成，其中， 

MADV反应液与EV反应液体积比为1∶1。 

其中，MADV反应液与EV反应液分别由浓度均为10μM的引物、探针按照上游引物∶下游引物∶探针体积比为1∶1∶1的比例混合成引物探针混合液。 

另外，该试剂盒还可包括： 

内标DNA标准品 

内标DNA标准品的引物探针混合液 

稀释液(λDNA) 

其中，所述内标DNA标准品是将441bp的LTA片段插入到pT easy-3质粒中获得，命名为：pT-LTA，其插入序列如SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列。 

内标DNA标准品的扩增引物混合液分别由浓度均为10μM的内标引物、探针按照上游引物∶下游引物∶探针体积比为1∶1∶1的比例混合成引物探针混合液。 

内标引物、探针序列如下表2所示： 

表2 

上述内标探针与两种病毒的检测探针具有不同的标记荧光基团，内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，两种病毒的检测探针5’端均为FAM标记，3’端为TAMRA标记。 

2.2同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测方法 

(1)多重实时荧光PCR模板制备——总DNA提取： 

1)向样品(如为组织需研磨匀浆)中加入适量λDNA，内标DNA标准品(通常使得加入内标DNA总量为1×10⁷copies即可)； 

2)加250μl酚仿，振荡混匀，室温放置约5min； 

3)4℃、13000rpm离心15min，转移上清至新离心管； 

4)加入Ethachimate 3μl，无水乙醇600μl，3M NaAC 30μl。混匀，4℃、13000rpm离心15min； 

5)弃上清，加入0.5ml 75％冷乙醇，4℃、13000rpm离心15min； 

6)弃上清，真空干燥5-10min； 

7)加100μl超纯水溶解沉淀，冻存于-80度备用。 

(2)配制多重实时荧光PCR反应体系 

以总DNA为模板，进行多重实时荧光PCR： 

每种病毒检测反应体系(20μl)的组成： 

内标DNA标准品反应体系(20μl)的组成： 

其中ddH₂O作为空白对照，以阴性不含病毒的样品DNA为阴性对照品。 

同时，用稀释液将内标DNA标准品稀释至2×10⁵copies/μl后，10倍梯度稀释成2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹copies/μl作为内标DNA定量标准品，作为标准曲线的模板，反应体系如内标DNA标准品反应体系(20μl)的组成，具体地： 

将上述配制好的反应体系转至荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。 

(3)多重实时荧光PCR反应条件 

将上述(2)中反应体系进行实时荧光PCR，具体反应条件为： 

具体反应条件为： 

50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，共40个循环。每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。 

内标检测结果通过标准曲线来计算内标DNA测定值，与理论值(1×10⁵copies/μl)相比，计算内标DNA回收率。 

(4)结果判定标准： 

内标DNA回收率在50～200％间，则认为此次多重实时荧光PCR检测体系成立。 

病毒DNA残留的判定标准： 

阳性：标本检测结果Ct≤35，有明显指数增长期。 

阴性：标本检测结果Ct≥38或无Ct。 

可疑：标本检测结果35＜Ct＜38，有明显指数增长期，应进行重新检测。 

实施例3同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法 

3.1同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒 

该试剂盒的组分与实施例2.1中试剂盒组分不同之处仅在于： 

两种病毒的引物探针混合液中，两种病毒的探针标记荧光基团不同，目的是可使本试剂盒可单管同时检测两种病毒。 

其中，内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记；小鼠腺病毒的检测探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；小鼠脱脚病病毒的检测探针5’端为JOE标记，3’端为TAMRA标记。 

3.2同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒的检测方法 

本实施例检测方法与实施例2.2的不同之处仅在于配制的多重实时荧光PCR反应体系不同，该实施例单管同时检测两种病毒，故只需配制一种检测的反应体系。 

是以总DNA为模板，进行多重实时荧光PCR： 

每种病毒检测反应体系(20μl)的组成： 

将上述配制好的反应体系转至荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。 

实施例4阳性DNA标准品的制备 

将含小鼠腺病毒和小鼠脱脚病病毒同源序列SEQ ID NO：11和SEQID NO：12的核苷酸序列插入pMD18-T质粒中，制备阳性DNA标准品。 

将含上述pMD18-T质粒的甘油菌(Invitrogen公司提供)在LB培养基(含100ng/ml Amp)中37℃过夜震荡培养后，用质粒小提试剂盒(QIAgen公司提供)提取该质粒，紫外吸光法定量并计算拷贝数，稀释至10⁸copies/μl作为阳性标准品，分装保存于-80℃备用。 

实施例5本发明试剂盒的方法学验证 

(一)本发明试剂盒相对定量检测方法的方法学验证 

为了验证看本发明试剂盒中引入内标能否作为各种病毒联合检测实验的质控指标，发明人将市售生物制品苏肽生样品中同时加入内标DNA标准品和某种病毒DNA，同时提取DNA，用荧光定量PCR检测内标DNA标准品和病毒DNA的回收率。当内标DNA标准品和病毒DNA的回收率比值在0.5～2之间时，内标DNA标准品回收率可被用于评价病毒DNA的荧光定量PCR效率，这样内标DNA就可作为病毒DNA检测 的阳性对照。 

具体验证方法如下： 

5.1DNA提取 

1)配制预混液：每50μl预混液中含λDNA(0.4μg/μl)5μl，病毒阳性DNA标准品、内标DNA标准品(要求加入的病毒DNA、内标DNA总量均达到1×10⁷copies)，水35μl； 

2)苏肽生200μl，加入预混液50μl，加250μl酚仿，振荡混匀，室温放置约5min； 

3)加250μl酚仿，振荡混匀，室温放置约5min； 

4)4℃、13000rpm离心15min，转移上清至新离心管； 

5)加入Ethachimate 3μl，无水乙醇600μl，3M NaAC 30μl，混匀，4℃、13000rpm离心15min； 

6)弃上清，加入0.5ml 75％冷乙醇，4℃、13000rpm离心15min； 

7)弃上清，真空干燥5～10min； 

8)加100μl超纯水溶解沉淀，冻存于-80℃备用。 

5.2荧光定量PCR检测内标DNA标准品和病毒DNA的回收率 

下表3为检测得到的2种病毒和内标的回收率实验数据，每种病毒重复3次实验： 

表3 

结论： 

1、每种病毒重复三次实验，内标DNA和病毒DNA的回收率均大于50％，符合要求； 

2、内标DNA与病毒DNA回收率的比值在0.5～2之间，符合要求，说明可用内标DNA的提取检测效率来对病毒DNA进行相对定量。 

(二)本发明试剂盒绝对定量检测方法的方法学验证 

本发明人采用制备的阳性DNA标准品，通过绘制标准曲线计算本发明试剂盒进行病毒检测时候的灵敏度和准确性实验，经验证表明，该试剂盒检测每种病毒的灵敏度均可达到了20copies/μl(100copies/reaction)，且特异性强，准确度都很高。 

将实施例4制备的阳性DNA标准品稀释至10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies/μl为模板，在单管中加入两种病毒的引物探针混合液按照实施例2中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应，随着PCR体系的每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标，吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct为纵坐标的标准曲线。其中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 

本发明实时荧光定量PCR的检测低限：在40个循环内出现可信Ct值的稀释低限，当每差10倍模板量，Ct值相差3.3的Ct值被认为是可信的Ct值，由图1、2所示的定量曲线可得出，该实时荧光定量PCR检测腺病毒、脱脚病病毒的灵敏度均可达到20copies/μl (100copies/reaction)。 

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 

标准曲线如图3、4所示，标准曲线R²＝0.996、0.998，线性相关性良好。 

本发明试剂盒重复性好，精密度符合要求，且具有很强的特异性。 

实施例6本发明多重实时荧光PCR检测试剂盒在检测苏肽生样品DNA病毒残留中的应用 

4.1制备模板 

根据实施例2.2中检测方法，提取市售苏肽生样品的DNA制备模板，配制反应体系进行反应后判定结果。 

4.2确定内标回收率： 

内标理论值1×10⁵copies/ul，根据内标标准曲线确定的实测值7.52×10⁴copies/ul，回收率75.2％。回收率大于50％，说明此次检测系统成立。 

4.3样品中2种DNA病毒残余检测结果见下表4所示 

表4 

反应孔位置	扩增片段	Ct值	结果判定
				A1，B1，C1	EV	-	阴性
A2，B2，C2	MAdV	-	阴性

该结果与中检所的检测结果具有一致性，因此，本发明试剂盒可用 于生物制品中DNA病毒的联合检测。 

实施例7本发明多重实时荧光PCR检测试剂盒 

两种病毒的引物探针混合液(MADV反应液、EV反应液)各500μl 

上述引物探针混合液均是由浓度为10μM的引物、探针按照上游引物∶下游引物∶探针体积比为1∶1∶1的比例混合而成。 

其中，内标DNA的引物探针混合液中的探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记；两种病毒引物探针混合液中的两种探针5’端均为FAM标记，3’端均为TAMRA标记。 

实施例8本发明多重实时荧光PCR检测试剂盒 

两种病毒的引物探针混合液(MADV反应液、EV反应液)各500μl 

上述引物探针混合液均是由浓度为10μM的引物、探针按照上游引物∶下游引物∶探针体积比为1∶1∶1的比例混合而成。 

其中，内标DNA的引物探针混合液中的探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记MADV反应液中的检测探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；EV反应液的检测探针5’端为JOE标记，3’端为TAMRA标记。 

实施例9本发明多重实时荧光PCR检测试剂盒 

两种病毒的引物探针混合液(MADV反应液、EV反应液)各500μl 

上述引物探针混合液均是由浓度为10μM的引物、探针按照上游引物∶下游引物∶探针体积比为1∶1∶1的比例混合而成。 

其中，内标DNA的引物探针混合液中的探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记；两种病毒引物探针混合液中的两种探针5’端均为FAM标记，3’端均为TAMRA标记。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (16)

1.用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物，其特征在于，

特异性地扩增小鼠腺病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸；

特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQID NO：3的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：4的下游引物组成的一对寡核苷酸。

2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，

特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO：5的核苷酸序列；

特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针具有序列表中的SEQ IDNO：6的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求2或3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、ROX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse或BHQ1或BHQ2。

5.根据权利要求2～4任一所述的探针，其特征在于，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针与特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针具有不同的荧光报告基团。 

6.一种同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中所述的引物及权利要求2～5任一所述的探针。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标DNA标准品、内标DNA标准品的扩增引物和探针。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标DNA标准品为含序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的pT easy-3质粒；所述内标DNA标准品的扩增引物是由具有序列表中的SEQ ID NO：8的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：9的下游引物组成的一对寡核苷酸，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO：10的核苷酸序列。

9.根据权利要求6～8任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性DNA标准品。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为含小鼠腺病毒同源序列SEQ ID NO：11和脱脚病病毒同源序列SEQ IDNO：12的pMD18-T重组质粒。

11.根据权利要求6～10任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、阴性质控品、空白对照。

12.一种使用权利要求1中所述的引物或权利要求2～5任一所述的探针或权利要求6～11任一所述的试剂盒同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述多重实时荧光PCR检测方法的退火温度为60℃。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述多重实时荧光 PCR的反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，共40个循环。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准曲线的建立，将内标DNA标准品十倍稀释成不同浓度的内标定量标准品，以所述内标定量标准品作为模板进行实时荧光PCR检测，得到内标标准曲线。

15.根据权利要求12～14任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将阳性DNA标准品十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行多重实时荧光PCR检测，得到检测病毒的标准曲线。

16.权利要求1中所述的引物或权利要求2～5任一所述的探针或权利要求6～11任一所述的试剂盒或权利要求12～15任一所述检测方法在检测鼠源生物制品中小鼠腺病毒和脱脚病病毒残留时的应用。 

Images