CN117017964B - 花生四烯酸在制备狂犬病治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了花生四烯酸在制备狂犬病治疗药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明研究发现花生四烯酸能够显著地抑制狂犬病病毒的增殖，其抑制作用呈浓度依赖性；并且花生四烯酸不仅在狂犬病毒感染24h下能够有效抑制狂犬病病毒增殖，在狂犬病毒感染48h下同样具有此种情况出现。对花生四烯酸进行细胞毒性测试发现，花生四烯酸在N2a细胞上的CC50的对应浓度为187.2μM，作用浓度在100μM时对N2a细胞无明显的细胞毒性，结果显示花生四烯酸对细胞的毒性较低，具有较好的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及花生四烯酸在制备狂犬病治疗药物中的应用。
背景技术
狂犬病(Rabies)，是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种嗜神经性中枢系统人兽共患传染病。已经存在千年之久，时至今日依旧威胁全球公共卫生健康，多发于发展程度较低、经济及医疗卫生资源贫瘠的国家和地区。目前，狂犬病发病后的死亡人数仍旧高居法定报告传染病的前列，给人类社会造成严重危害。狂犬病一旦出现临床症状后致死率接近100％，目前尚无有效的治疗手段。
RABV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，丽莎病毒属(Lyssavirus)成员，病毒粒子呈现子弹状。RABV属于负链RNA病毒，外有囊膜，基因组编码5个结构蛋白，分别为核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。虽然，当前在国内已经通过大面积的灭活疫苗接种能够有效限制狂犬病在人群中的出现，但目前尚未有抗狂犬病毒药物用于临床治疗，因此亟需开发有效的抗狂犬病毒药物。
发明内容
本发明的目的是提供花生四烯酸在制备狂犬病治疗药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现花生四烯酸可以有效抑制狂犬病病毒的增殖，为狂犬病治疗药物的开发奠定了基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供花生四烯酸在制备狂犬病治疗药物中的应用。
进一步地，所述狂犬病治疗药物通过抑制狂犬病病毒增殖来治疗狂犬病。
本发明还提供一种狂犬病治疗药物，活性成分包括花生四烯酸。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供花生四烯酸在制备狂犬病病毒抑制剂中的应用。
本发明还提供一种狂犬病病毒抑制剂，活性成分包括花生四烯酸。
本发明公开了以下技术效果：
本发明研究发现花生四烯酸能够显著地抑制狂犬病病毒的增殖，其抑制作用呈浓度依赖性；并且花生四烯酸不仅在狂犬病毒感染24h下能够有效抑制狂犬病病毒增殖，在狂犬病毒感染48h下同样具有此种情况出现。
对花生四烯酸进行细胞毒性测试发现，花生四烯酸在N2a细胞上的CC50的对应浓度为187.2μM，作用浓度在100μM时对N2a细胞无明显的细胞毒性，结果显示花生四烯酸对细胞的毒性较低，具有较好的安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为花生四烯酸处理N2a细胞(0μM，50μM，75μM，100μM)后感染狂犬病病毒(MOI＝0.01，0.1；24h)的毒价测定结果；
图2为花生四烯酸处理N2a细胞(0μM，50μM，75μM，100μM)后感染狂犬病病毒(MOI＝0.01，0.1；24h)的基因组拷贝数测定结果；
图3为花生四烯酸处理N2a细胞(0μM，50μM，75μM，100μM)后感染狂犬病病毒(MOI＝0.1；24h，48h)的毒价测定结果；
图4为花生四烯酸处理N2a细胞(0μM，50μM，75μM，100μM)后感染狂犬病病毒(MOI＝0.1；24h，48h)的基因组拷贝数测定结果；
图5为N2a细胞在感染狂犬病病毒(MOI＝0.1；24h)前(前处理2h，pre)、中(感染处理同时，co)、后(感染2h后处理，post)分别处理花生四烯酸的基因组拷贝数测定结果；
图6为花生四烯酸在N2a细胞上的半数细胞毒性(CC50)测定结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中使用的试验材料如下：
N2a细胞(小鼠脑神经瘤细胞，购自ATCC细胞库)；BSR细胞(BHK-21的一个克隆细胞系)；花生四烯酸(购自MedChemExpress)；异硫氰酸荧光素标记的狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体(Fujirebio)；Trizol(Invitrogen)；无RNA酶水(DEPC水，Vazyme)；通用型反转录试剂(Vazyme)；荧光定量PCR试剂(2×chamQ，Vazyme)；狂犬病病毒(华中农业大学赵凌课题组提供)。
实施例1
花生四烯酸抑制狂犬病病毒(RABV)毒价的测定及病毒基因组拷贝数的测定(MOI＝0.01，0.1)：
(1)将生长状态良好的N2a细胞按照1.2×106个/mL的量接种于6孔板，每孔2mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。花生四烯酸粉末用DMSO稀释为母液。
(2)将药物处理组分为DMSO组和花生四烯酸组，简单来说，将六孔板内培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基，其中花生四烯酸组分为50μM组，75μM和100μM组，分别加入终浓度为50μM，75μM和100μM的花生四烯酸，DMSO组加入等体积的DMSO后，继续置于37℃，5％CO2培养箱中培养2h。
(3)2h后，取出六孔板，每孔内加入MOI＝0.1或MOI＝0.01的RABV病毒，置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h。
(4)1h后，将培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基，其中花生四烯酸组分为50μM组，75μM和100μM组，分别加入终浓度为50μM，75μM和100μM的花生四烯酸，DMSO组加入等体积的DMSO后，继续置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
(5)24h后，将孔板中上清分别收集，涡旋均匀待用；向孔板中以1mL/孔加入Trizol溶解细胞，将1mL收集待用。
(6)向1.5mL的EP管内以450μL/管加入无血清DMEM培养基，从涡旋均匀的上清中吸取50μL于第一管内，涡旋均匀后继续吸取50μL于第二管内，如此重复稀释至第12管，即分别将上清稀释为10-1,10-2,10-3……10-12，向96孔板第一列四个孔中每孔加入100μL稀释度为的10-1上清，第二列四个孔中每孔加入100μL稀释度为的10-2上清，第三列四个孔中每孔加入100μL稀释度为的10-3上清，以此类推，在第十二列四个孔中每孔加入100μL稀释度为的10-12上清，然后将生长状态良好的BSR细胞按照1×105/mL的量接种于6孔板，每孔100μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(7)48h后，弃去上清，细胞使用4％多聚甲醛固定后，加入0.01％的Triton X-100通透后，加入异硫氰酸荧光素标记的狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，置于37℃孵育45分钟；使用PBS清洗三遍孔板后，在荧光显微镜下观察。以Reed-Muench法计算各个实验组处理后对应的狂犬病病毒毒价，以PFU/mL表示。
(8)将步骤(5)中使用1mL的Trizol收集的细胞涡旋均匀后，加入200μL氯仿，置于冰上10分钟。
(9)4℃，12000rpm离心10分钟，将上层清液吸取600μL于新的无RNA酶的1.5mL的EP管内，加入等体积600μL的异丙醇，涡旋均匀后置于冰上10分钟。
(10)4℃，12000rpm离心10分钟，弃去液体，加入1mL的75％乙醇(DEPC水稀释)于EP管内，涡旋均匀后置于冰上5分钟。
(11)4℃，12000rpm离心10分钟，弃去液体，干燥后加入20μL的DEPC水溶解，使用分光光度计测定浓度后进行反转录，具体体系如表1所示：
表1
用移液器轻轻吹打均匀，按下列条件(表2)进行反转录反应，反转录为cDNA：
表2
(12)将产物直接用于荧光定量PCR反应，具体体系如表3所示：
表3
按下列条件(表4)进行荧光定量PCR反应：
表4
具体引物序列如表5所示：
表5
实验结果如图1所示，结果显示随着花生四烯酸处理浓度的不断升高，能够发现狂犬病病毒的毒价逐渐降低，这个抑制情况不仅出现在MOI＝0.1感染下，在MOI＝0.01感染下同样发现具有此种情况出现。同时，对病毒基因组拷贝数进行荧光定量PCR检测，依旧发现病毒基因组拷贝数随着花生四烯酸作用浓度升高而逐渐降低(图2)，具有花生四烯酸浓度依赖性。说明花生四烯酸能够显著地抑制狂犬病病毒的增殖，并且其抑制作用呈浓度依赖性。
实施例2
花生四烯酸抑制狂犬病病毒(RABV)毒价的测定及病毒基因组拷贝数的测定(24h，48h)：
(1)将生长状态良好的N2a细胞按照1.2×106/mL的量接种于6孔板，每孔2mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。花生四烯酸粉末用DMSO稀释为母液。
(2)将药物处理组分为DMSO组和花生四烯酸组，简单来说，将六孔板内培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基，其中花生四烯酸组分为50μM组，75μM和100μM组，分别加入终浓度为50μM，75μM和100μM的花生四烯酸，DMSO组加入等体积的DMSO后，继续置于37℃，5％CO2培养箱中培养2h。
(3)2h后，取出六孔板，每孔内加入MOI＝0.1的RABV病毒，置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h。
(4)1h后，将培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基，其中花生四烯酸组分为50μM组，75μM和100μM组，分别加入终浓度为50μM，75μM和100μM的花生四烯酸，DMSO组加入等体积的DMSO后，继续置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(5)分别在培养24h和48h后，对各实验组的狂犬病病毒毒价和病毒基因组拷贝数进行测定，方法同实施例1步骤(5)-(12)。
实验结果显示，花生四烯酸能够有效抑制狂犬病病毒增殖(图3)，并且这种抑制呈浓度依赖性；并且不仅在狂犬病毒感染24h后能够有效抑制狂犬病病毒增殖，在狂犬病毒感染48h后同样具有此种情况出现。同时，对病毒基因组拷贝数进行荧光定量PCR检测，依旧发现病毒基因组拷贝数随着花生四烯酸作用浓度升高逐渐降低(图4)，具有花生四烯酸浓度依赖性。说明花生四烯酸在24h和48h均能够显著的抑制狂犬病病毒的增殖，同时呈现剂量依赖性。
实施例3
花生四烯酸在狂犬病病毒(RABV)感染N2a细胞的不同时期(感染前、感染与处理同时进行以及感染后)处理的基因组拷贝数测定：
(1)将生长状态良好的N2a细胞按照1.2×106/mL的量接种于6孔板，每孔2mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。花生四烯酸粉末用DMSO稀释为母液。
(2)将药物处理组分为DMSO组和花生四烯酸组，花生四烯酸处理与狂犬病病毒(RABV)感染顺序分为：
①花生四烯酸(100μM)处理2h后接种RABV(MOI＝0.1)，2h后将培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基(含有100μM的花生四烯酸)继续培养24h；
②花生四烯酸(100μM)与RABV(MOI＝0.1)同时加入处理N2a细胞，2h后将培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基(含有100μM的花生四烯酸)继续培养24h；
③RABV(MOI＝0.1)感染后2h，将培养基弃去，重新向孔内加入2mL培养基(含有100μM的花生四烯酸)继续培养24h。
(3)24h后，将上清弃去，对各实验组的狂犬病病毒基因组拷贝数进行测定，方法同实施例1步骤(8)-(12)。
实验结果如图5所示，结果显示无论在狂犬病病毒感染前、感染时还是感染后加入花生四烯酸，均在24h时能有效抑制狂犬病病毒的增殖。
实施例4
花生四烯酸抑制狂犬病病毒(RABV)的半数细胞毒性浓度(CC50)测定：
(1)将生长状态良好的N2a细胞按照1×105/mL的量接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。花生四烯酸粉末用DMSO稀释为母液。
(2)将花生四烯酸使用DMEM培养基分别稀释为100μM，125μM，150μM，175μM，200μM，300μM一系列浓度梯度，每个稀释度分别做8个复孔，每个孔内加入100μL制定浓度培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(3)48h后，弃去96孔板中培养基，加入PBS小心清洗两遍并弃去，然后将CCK-8试剂使用DMEM培养基以1:10稀释，稀释后以110μL/孔向96孔内分别加入，置于37℃，5％CO2培养箱中培养45min。
(4)将96孔板小心取出，置于酶标仪中，在吸光度450nm处测定每个孔内的OD450值，收集数据，计算出各个浓度下对应的细胞毒性，并使用回归方程进行拟合后计算出具体的CC50的对应浓度。
如图6所示，计算后得出花生四烯酸在N2a细胞上的CC50的对应浓度为187.2μM，作用浓度在100μM时对N2a细胞无明显的细胞毒性。结果显示花生四烯酸对细胞的毒性较低，具有较好的安全性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.花生四烯酸作为唯一活性成分在制备狂犬病治疗药物中的应用。
2.花生四烯酸作为唯一活性成分在制备狂犬病病毒抑制剂中的应用。
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