CN106581052A - 柠檬酸根离子和铁离子在抑制rna病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种柠檬酸根离子和铁离子在抑制RNA病毒中的应用，具体地，本发明提供了一种活性成分的用途，用于制备抑制RNA病毒的药物组合物，其中，所述的活性成分至少含有：提供柠檬酸根离子C₅H₇O₅COO^‑的物质A；和提供铁离子的物质B；且所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:8‑8:1。本发明复配的活性成分能够有效地抑制多种RNA病毒，如肠道病毒、流感病毒、艾滋病病毒等，当将柠檬酸根离子和铁离子按特定比例进行施用时，所产生的效果与该比例具有一定相关性。此外，提供柠檬酸根离子和铁离子的物质并没有限制，从而使本发明复配活性成分非常易于制备、简单廉价，具有强大的应用前景。

Description

柠檬酸根离子和铁离子在抑制RNA病毒中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药治疗领域。具体地，涉及特定含量的柠檬酸根离子和铁离子在抑制RNA病毒中的应用。

背景技术

手足口病作为一种严重危害儿童健康的传染病，近年来在中国流行呈加剧趋势。从2008年卫生部将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理以来，中国手足口病发病病例从2008年的48895例，死亡126例(分别占丙类传染病的28％和67％)，上升到2014年的2778861例，死亡501例(分别占丙类传染病的68％和88％)。

手足口病主要由肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16)引起。主要症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹，绝大部分手足口病病人无需治疗，自动恢复。但少数病例可出现比较严重的症状，如脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，重症病例多由EV71感染引起，致死原因主要为病毒感染大脑，导致脑干脑炎及神经源性肺水肿。目前EV71的致病机制尤其是重症致病机制仍不清楚。市场上也缺乏有效的针对EV71的抗病毒药物和疫苗。

艾滋病是由艾滋病毒(HIV)感染引起的严重慢性感染疾病。HIV主要感染人体免疫系统中CD4⁺T细胞，摧毁人的免疫系统，最终导致人体免疫功能丧失并发各种感染疾病而衰竭死亡。目前世界上仍然没有能根治艾滋病的药物与疫苗。

流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸道感染。流感病毒易发生突变，且传染性强、传播速度快，极易造成大范围流行。虽然现在市场上已有针对流感病毒的抗病毒药物，但仍然有必要研究出新型廉价高效且抗病毒机理迥异的抗病毒药物。

因此，本领域迫切需要开发一种能够有效抑制RNA病毒，尤其是上述病毒的预防和/或治疗药物。

发明内容

本发明提供了一种有效抑制RNA病毒的组合物。

本发明第一方面，提供了一种活性成分的用途，用于制备抑制RNA病毒的药物组合物，其中，所述的活性成分至少含有：

提供柠檬酸根离子C₅H₇O₅COO^-的物质A；和

提供铁离子的物质B；

且所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:8-8:1。

在另一优选例中，所述的抑制RNA病毒包括治疗和/或预防RNA病毒的感染和/或复制。

在另一优选例中，所述的抑制RNA病毒还包括抑制RNA病毒感染诱导的炎症因子。

在另一优选例中，所述的炎症因子包括一种或多种选自Caspase-1、IL-1β、NLRP3、和/或其他炎症小体。

在另一优选例中，所述提供柠檬酸根离子的物质A包括一种或多种选自下组的物质：柠檬酸氢二铵((NH₄)₂HCit)、柠檬酸氢二钠(Na₂HCit)、异柠檬酸三钠；优选为柠檬酸氢二铵、柠檬酸氢二钠。

在另一优选例中，所述的活性成分选自柠檬酸铁、柠檬酸亚铁、异柠檬酸铁、异柠檬酸铁亚铁、或其组合。

在另一优选例中，提供铁离子的物质B包括一种或多种选自下组的物质：氯化铁(FeCl₃)、硫酸铁铵、硫酸亚铁铵；优选为氯化铁、硫酸铁铵。

在另一优选例中，所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:5-5:1，较佳地为1:2-2:1，更佳地，为1:1。

在另一优选例中，所述的铁离子包括二价铁离子和/或三价铁离子；和/或

所述的柠檬酸根离子还包括异柠檬酸根离子。

在另一优选例中，所述的RNA病毒包括：肠道病毒、艾滋病病毒、流感病毒。

在另一优选例中，所述的肠道病毒包括小RNA病毒科的各种病毒，如肠道病毒71型、肠道病毒68型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A10型等及其变种、猪水疱病病毒、猪脑脊髓炎病毒、鸡脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒等肠道病毒属的病毒，口蹄疫病毒属，以及多种已知小RNA病毒及其各种变种。

在另一优选例中，所述的艾滋病病毒包括反转录病毒科的各种病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)属及其变种，人类T-淋巴性病毒属及其变种等。

在另一优选例中，所述的流感病毒包括正黏液病毒科的各种流感病毒如H1N1、H5N1、H7N9等甲型流感病毒及其变种，各种乙型、丙型流感病毒及其变种等。

在另一优选例中，所述的药物组合物的工作pH值为7.0±0.05-7.5±0.05，较佳地，为7.2±0.05-7.4±0.05。

在另一优选例中，所述的工作pH值为在室温到生理温度(摄氏20-40度)条件下的pH值。

在另一优选例中，药物组合物的来源组分，即A或B的pH值范围不限于此工作pH值范围。

在另一优选例中，所述的活性成分中，按柠檬酸根离子和铁离子的总量计，浓度≥10μM，较佳地≥30μM，更佳地≥50μM。

本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述的活性成分为：

提供柠檬酸根离子的物质A；和

提供铁离子的物质B；

且所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:8-8:1，较佳地，为1:5-5:1，更佳地为1:2-2:1，最佳地，为1:1。

在另一优选例中，本发明第二方面药物组合物中所述的活性成分不是柠檬酸铁、柠檬酸亚铁、异柠檬酸铁、异柠檬酸铁亚铁。

在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有抗病毒剂，优选地，所述的病毒为RNA病毒。

本发明第三方面，提供了一种体外非治疗性抑制RNA病毒对细胞的侵袭的方法，在提供柠檬酸根离子的物质A和提供铁离子的物质B的共同存在下，对RNA病毒和细胞进行共培养，从而抑制RNA病毒对细胞的侵袭。

在另一优选例中，所述的细胞为RNA病毒感染细胞，如人肌肉瘤RD(Rhabdomyosarcoma)细胞、人单核细胞系THP-1细胞、人肺上皮细胞系A549、Vero细胞等。

本发明第四方面，提供了一种抑制RNA病毒、预防和/或治疗病毒感染的方法，向需要的对象共同施用提供柠檬酸根离子的物质A和提供铁离子的物质B，其中，所述需要的对象是感染或易感RNA病毒的对象。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了柠檬酸铁铵(FAC)能够抑制EV71病毒对人肌肉瘤RD细胞的感染引起的细胞病变；图1B和C则通过实时荧光定量PCR和免疫印迹进一步说明FAC能够抑制EV71病毒在RD细胞中的复制；图1D的剂量依赖实验结果表明FAC对胞内病毒复制的抑制，因为病毒释放进入上清的量与FAC剂量负相关；图1E显示在人单核细胞系THP-1细胞中，FAC同样能抑制病毒的复制；图1F显示病毒所诱导的炎症小体激活也同样受到了抑制，表现在上清中成熟Caspase-1和IL-1β的分泌减少，及细胞内ASC寡聚体形成的减少。

图2A表明FAC同样能够抑制HIV-1在人原代树突状细胞(dendritic cell,DC)中的复制；而图2B、C、D则表明HIV病毒感染引起的细胞因子分泌同样因病毒复制被抑制而未被诱导表达。

图3A显示FAC能够抑制A型流感病毒PR8株在人肺上皮细胞系A549中的复制；图3B、C显示流感病毒复制引发的细胞因子表达同样受到了抑制；图3D显示感染流感病毒的小鼠腹腔注射FAC能够抑制病毒感染引发的体重减轻；图3E则表明柠檬酸铁并不能在成纤维细胞系中抑制人巨细胞病毒(HCMV)的复制。

图4A和B显示了各组分的组合对病毒的抑制作用；图4C显示了活性成分浓度与抗病毒效应的相关性；图4D则说明说明柠檬酸铁铵对病毒感染有一定的预防作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，任何提供柠檬酸根离子和提供铁离子的物质作为复配活性成分，按一定比例施用时，能够高效地抑制多种RNA病毒，而复配后形成的柠檬酸铁作为其有效成分，可以起到预防和/或治疗病毒感染的药物，而其他阴离子或金属离子的复配则不具有这样的病毒抑制效果。同时，本发明的复配活性成分具有广谱的抗RNA病毒活性而对DNA病毒无相应作用。此外，本发明人还发现，柠檬酸根的异构体异柠檬酸根以及二价和三价的铁离子均具有相同或相似的病毒抑制活性。因此，可采用多种廉价的提供(异)柠檬酸根和铁离子的物质复配从而起到病毒抑制作用，因此应用前景十分广泛。在此基础上，完成了本发明。

活性成分

如本文所用，术语“活性成分”、“复配配方”、“复配活性成分”可互换使用，均指至少含有提供柠檬酸根离子C₅H₇O₅COO-的物质A；和提供铁离子的物质B的复配配方。优选地，所述的活性成分由提供柠檬酸根离子C₅H₇O₅COO^-的物质A和提供铁离子的物质B组成。

在本发明活性成分中，物质A和物质B的比例与病毒抑制效果具有一定相关性，即当按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计，物质A和物质B的比例在1：5-5：1、较优选为1：2-2：1、更优选为1:1时，本发明活性成分的病毒抑制活性最强。通常，按柠檬酸根离子和铁离子的总量计，在活性成分中柠檬酸根离子和铁离子的浓度≥10μM，较佳地≥30μM，更佳地≥50μM。

此外，本发明活性成分，或当将本发明活性成分制备成药物组合物时，通常会通过pH调节剂将pH值调节到一个适合施用的范围，例如7.0±0.05-7.5±0.05，较佳地，为7.2±0.05-7.4±0.05。

本发明中，除非另行定义，“柠檬酸根离子”广义地指的是具有C₅H₇O₅COO^-结构式的柠檬酸根离子，其中包括了柠檬酸根离子本身及其异构体异柠檬酸根离子。可用于本发明的提供柠檬酸根离子的物质A没有特别限制，可以为任何能够在体外和/或体内特定微环境下解离出柠檬酸根离子的、适用于体外或体内施用的物质，例如各种含有柠檬酸根的盐，如柠檬酸氢二铵((NH₄)₂HCit)、柠檬酸氢二钠(Na₂HCit)、异柠檬酸三钠(可例举柠檬酸的盐)；优选为柠檬酸氢二铵、柠檬酸氢二钠。

本发明中，除非另行定义，“铁离子”广义地指的是二价或三价铁离子。可用于本发明的提供铁离子的物质B没有特别限制，可以为任何能够在体外和/或体内特定微环境下解离出铁离子的、适用于体外或体内施用的物质，例如各种铁盐，如氯化铁(FeCl₃)、硫酸铁铵、硫酸亚铁铵；优选为氯化铁、硫酸铁铵。

本发明的活性成分中，当柠檬酸根离子和铁离子共同处于同一体系(如液体体系)时，柠檬酸根离子和铁离子可以各自处于解离状态而不形成化合物，或通过离子键共同形成柠檬酸铁、柠檬酸亚铁、异柠檬酸铁、异柠檬酸铁亚铁、或其组合，当共同形成以上化合物时，本发明的活性成分就是柠檬酸铁、柠檬酸亚铁、异柠檬酸铁、异柠檬酸铁亚铁、或其组合。本发明的活性成分可以通过将液态的物质A和B进行接触并混合，从而获得所述的活性成分；也可以将固体的物质A和B混合并加入药学上可接受的载体(如溶剂)或分别加入溶剂后再进行混合制备而成。

RNA病毒

可用于本发明的RNA病毒没有特别限制，可以为任何遗传物质由核糖核酸组成的病毒，如单链RNA病毒或双链RNA病毒，优选地，本发明所述的RNA病毒包括肠道病毒、艾滋病病毒、流感病毒等全部RNA病毒。

所述的肠道病毒包括小RNA病毒科的各种病毒，如肠道病毒71型、肠道病毒68型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A10型等及其变种，猪水疱病病毒、猪脑脊髓炎病毒、鸡脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒等肠道病毒属的病毒，口蹄疫病毒属，以及多种已知小RNA病毒及其各种变种。

所述的艾滋病病毒包括反转录病毒科的各种病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)属及其变种，人类T-淋巴性病毒属及其变种等。

所述的流感病毒包括正黏液病毒科的各种流感病毒如H1N1，H5N1、H7N9等甲型流感病毒及其变种，各种乙型、丙型流感病毒及其变种等。

药物组合物

本发明还提供了一种含有活性成分的药物组合物，其中，所述药物组合物除了含有安全有效量的本发明活性成分以外，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

在另一优选例中，本发明活性成分可与大分子化合物或高分子通过非键合作用形成复合物。在另一优选例中，本发明活性成分作为小分子还可通过化学键与大分子化合物或高分子相连接。所述大分子化合物可以是生物大分子如高聚糖、蛋白、核酸、多肽等。

本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物(如抗生素)联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

应用

本发明还提供了一种治疗或非治疗性的抑制RNA病毒的方法。

其中，体外的非治疗性的方法是抑制RNA病毒对侵袭的感染，其包括：在提供柠檬酸根离子的物质A和提供铁离子的物质B、或本发明药物组合物的共同存在下，对RNA病毒和细胞进行共培养，从而抑制RNA病毒对细胞的侵袭。

此外，当用于需要的对象时，本发明抑制RNA病毒的方法包括向需要的对象共同施用提供柠檬酸根离子的物质A和提供铁离子的物质B、或本发明药物组合物，其中，所述需要的对象是感染或易感RNA病毒的对象。

如本文所用，术语“抑制RNA病毒”包括对RNA病毒感染和/或复制进行治疗和/或预防。当应用于体外非治疗性方法时，本发明细胞包括各种易感RNA病毒的细胞，例如人肌肉瘤RD(Rhabdomyosarcoma)细胞、人单核细胞系THP-1细胞、人肺上皮细胞系A549、Vero细胞等。当应用于体内治疗性方法时，本发明感染或易感RNA病毒的对象为哺乳动物，优选为人、小鼠或大鼠。

本发明有益效果

本发明复配的活性成分能够有效地抑制多种RNA病毒，如肠道病毒、流感病毒、艾滋病病毒等，而当将柠檬酸根离子和铁离子按特定比例进行施用时，所产生的效果与该比例具有一定相关性。此外，提供柠檬酸离子和铁离子的物质并没有限制，从而使本发明复配活性成分非常易于制备、简单廉价，具有强大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

细胞

RD和A549细胞系使用DMEM培养基(含10％FBS,100IU/ml青霉素,1mg/ml链霉素,and 50μM 2-巯基乙醇)培养。THP1细胞使用RPMI 1640培养基(含10％FBS,100IU/ml青霉素,1mg/ml链霉素,和50μM 2-巯基乙醇)培养。检测炎症小体激活时，THP-1单核细胞使用PMA分化成巨噬细胞。用PMA(50ng/ml)刺激2小时,换成新鲜培养基静息24小时即分化成巨噬细胞。细胞培养在5％CO2的37℃培养箱。

人原代DC细胞的制备

从上海血液中心获得的新鲜血液通过Ficoll密度梯度离心得到外周血单核细胞。然后用CD14磁珠富集单核细胞。在含有40ng/mL GM-CSF和20ng/mL IL-4的RPMI 1640培养基中培养一周得到成熟的DC细胞。

病毒

EV71病毒FY573株(subgenotype C4a,GenBank access ion number:HM064456.1)、HIV-1重组病毒、流感病毒PR8株、和人巨细胞病毒(HCMV)均来自上海巴斯德所。

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)

RD或THP-1细胞用TRIzol试剂(Invitrogen)抽取总RNA，并用反转录试剂盒(Promega)反转成cDNA后使用SYBR Green qPCR Master Mix(TOYOBO)和7900HT Real-timePCR系统(Applied Biosystems)检测基因的相对表达。GAPDH基因的作为内参。引物序列如下：

GAPDH:Forward，5-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3(SEQ ID NO.:1)

Reverse，5-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3(SEQ ID NO.:2)

EV71：Forward，5-TGAATGCGGCTAATCCCAACT-3(SEQ ID NO.:3)

Reverse，5-AAGAAACACGGACACCCAAAG-3(SEQ ID NO.:4)

HIV-GAG：Forward，5-GTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGG-3(SEQ ID NO.:5)

Reverse，5-CGCTCTCGCACCCATCTC-3(SEQ ID NO.:6)

IFNB：Forward，5-AGGACAGGATGAACTTTGAC-3(SEQ ID NO.:7)

Reverse，5-TGATAGACATTAGCCAGGAG-3(SEQ ID NO.:8)

IL-1β：Forward，5-CACGATGCACCTGTACGATCA-3(SEQ ID NO.:9)

Reverse，5-GTTGCTCCATATCCTGTCCCT-3(SEQ ID NO.:10)

IL-6：Forward，5-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3(SEQ ID NO.:11)

Reverse，5-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3(SEQ ID NO.:12)

PR8：Forward，5-AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-3(SEQ ID NO.:13)

Reverse，5-CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3(SEQ ID NO.:14)

免疫印迹

RD或THP-1巨噬细胞用1％NP-40lysis buffer裂解后加入SDS上样缓冲液用SDS-PAGE胶电泳检测pro-IL-1β,ASC,pro-caspase-1(Santa Cruz)。对于上清中成熟caspase-1and IL-1β的检测，上清先采用甲醇氯仿法浓缩蛋白，然后加SDS上样缓冲液，SDS-PAGE胶电泳检测。对于ASC pyroptosome的检测，THP1细胞裂解液12,000g，4度离心10分钟得到的沉淀用PBS洗三次，然后用disuccinimidyl suberate(DSS,4mM,Sigma-Aldrich)，37度交联30分钟。离心加入SDS上游缓冲液后通过免疫印迹法检测ASC。

TCID50法测定病毒滴度

细胞的准备：准备10ml含10％FBS的DMEM重悬RD细胞，将细胞浓度调至2×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加入100μl。细胞贴壁后，将上清弃去。

病毒的稀释：取一系列离心管，第一管中加入0.9ml含2％FBS的DMEM，其余则加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下抽吸5次使它们混匀。从第一管中吸取0.2ml加入第二管。重复这个稀释步骤直到最高稀释度。96孔板的每一排10孔作为一个稀释度。第11、12列不加病毒作为阴性对照。实验孔每孔加入0.1ml不同稀释度病毒。把96孔板放在37℃孵箱培养3-4天，观察病变。最后按公式T＝10^1+d(s-0.5)计算病毒的滴度(d为稀释度的对数值，s为病变比例的和)。

ELISA

THP-1细胞上清用eBioscience试剂盒，按照试剂盒操作指导检测IL-1β的分泌。

实施例1柠檬酸铁铵(FAC)对EV71病毒的抑制作用

方法：

1.1 RD细胞感染EV71病毒(MOI＝0.1)的同时加入FAC(100μM)，8小时后，对细胞病变拍照；然后从细胞抽提RNA，做Real-Time PCR检测病毒RNA载量；并通过免疫印迹(western blot)检测细胞中EV71蛋白VP1的表达；

1.2在EV71感染RD细胞时加入不同剂量(0,10,20,50,100μM)FAC，8小时后Real-Time PCR检测细胞中病毒RNA载量，细胞上清通过TCID50方法检测病毒滴度。

1.3 THP-1细胞感染EV71病毒(MOI＝0.1)的同时加入FAC(100μM)，12小时后Real-Time PCR检测细胞中病毒RNA载量。以及在THP-1细胞感染EV71病毒(MOI＝0.1)的同时加入FAC(100μM)，24小时后western blot检测细胞上清中成熟Caspase-1和IL-1β的分泌，细胞裂解液沉淀中检测ASC寡聚体的形成。

结果：由图1可见，柠檬酸铁铵(Ferric Ammonium Citrate,FAC)能够抑制EV71病毒对人肌肉瘤RD(Rhabdomyosarcoma)细胞的感染引起的细胞病变(图1A)。Real-Time PCR和Western blot实验进一步说明FAC能够抑制EV71病毒在RD细胞中的复制(图1B,C)。剂量依赖实验结果表明FAC对胞内病毒复制的抑制，因为病毒释放进入上清的量与FAC剂量负相关(图1D)。在人单核细胞系THP-1细胞中，FAC同样能抑制病毒的复制(图1E)，病毒所诱导的炎症小体激活也同样受到了抑制，表现在上清中成熟Caspase-1和IL-1β的分泌减少，及细胞内ASC寡聚体形成的减少(图1F)。

以上实验表明柠檬酸铁盐能够抑制病毒在细胞内复制以及病毒复制所诱导的免疫反应。

实施例2柠檬酸铁铵(FAC)对HIV病毒的抑制作用

方法：采用人原代外周血单核细胞(PBMC)分化成的DC细胞感染HIV-1(Gag(p24)100ng/ml)，8、24、48、72小时后，Real-Time PCR检测病毒Gag RNA载量，IFN-β，IL-1β和IL-6的mRNA表达。FAC(100μM)。

结果：由图2可见，FAC同样能够抑制HIV-1在人原代DC细胞中的复制(图2A)。HIV病毒感染引起的细胞因子分泌同样因病毒复制抑制而未被诱导表达(图2B,C,D)。

实施例3柠檬酸铁铵(FAC)对HIV病毒和DNA病毒的抑制作用

方法：

3.1A549细胞感染流感病毒PR8(MOI＝1)的同时加入FAC(100μM)，12小时后，Real-Time PCR检测病毒RNA载量，IFN-β和IL-6的mRNA表达。6-8周龄的C57BL/6小鼠鼻腔滴注30pfu PR8流感病毒，并在第0、1、2、3、4天腹腔注射PBS或FAC(50mg/kg)，记录小鼠体重变化曲线。HCMV-GFP病毒感染细胞加PBS对照或100μM柠檬酸铁铵培养3天后荧光显微镜下观测病毒的复制水平。有绿色荧光的细胞为病毒活跃复制的细胞。

结果：由图3可见，FAC能够抑制A型流感病毒PR8株在人肺上皮细胞系A549中的复制(图3A)，病毒复制引发的细胞因子表达同样受到了抑制(图3B,C)。感染病毒小鼠腹腔注射FAC能够抑制病毒感染引发的体重减轻(图3D)。这证明了FAC通过抑制流感病毒复制对感染小鼠具有保护作用。

此外，本发明还检测了柠檬酸铁对DNA病毒的作用，结果显示柠檬酸铁并不能在成纤维细胞系中抑制人巨细胞病毒(HCMV)的复制(图3E)。

以上结果表明柠檬酸铁特异性抑制RNA病毒，但不抑制DNA病毒。

实施例4活性成分的研究

本实施例研究了FAC的哪些组分在起作用。

方法：

RD细胞感染EV71病毒(MOI＝0.1)的同时加入各种化合物(100μM)或化合物组合(100μM+100μM)，8小时后，对细胞病变拍照，对细胞抽RNA，做Real-Time PCR检测病毒RNA载量。RD细胞感染EV71的同时加入100μM FeCl₃+100μM Na₂HCit组合，100μM FeCl₃+1000μMNa₂HCit组合，100μM FeCl₃+10μM Na₂HCit组合。8小时后Real-Time PCR检测病毒载量。THP1巨噬细胞用柠檬酸铁预处理1小时后，洗掉上清，感染病毒，12小时后ELISA检测上清IL-1β的分泌。

结果：

柠檬酸铁铵(FAC)和柠檬酸铁(FeCit)都能抑制病毒复制，而氯化铁(FeCl₃)，硫酸铁铵(Ferric Ammonium Sulphate,FAS)和柠檬酸氢二钠(Na₂HCit)都不具有保护作用。这说明铁离子和柠檬酸根都是必需的。

亚铁离子硫酸亚铁铵(Ammonium Iron(II)Sulphate，AIS)和柠檬酸根组合同样具有保护作用，说明铁离子价态不是必需的。

FeCl₃，FAS，AIS分别和Na₂HCit的组合同样具有保护作用，进一步说明铁离子和柠檬酸根的必要性。

另外AIS与异柠檬酸钠(Sodium D-Isocitrate,Na₃IsoCit)的组合也能抑制病毒复制，说明异柠檬酸根也有保护作用。其他金属离子如氯化铝(AlCl₃)、氯化锰(MnCl₂)和Na₂HCit的组合则不具有保护作用。

同样其他酸根如顺乌头酸(cis-aconitate,HAco)、乙酸钠(Sodium Acetate，NaAc)和铁离子的组合也没有抑制作用。

综上可见，柠檬酸铁盐的特异性组合才具有抑制病毒特性。

铁离子与柠檬酸根的比例也很重要，当二者比例为1:10或10:1时，效果大大减弱，而在1:5-5:1的范围内该组合均具有一定效果，且该效果随着二者比例的接近而上升，其中研究结果显示二者在1:1比例是效果最好(图4C)

另外，柠檬酸铁预处理THP-1细胞1小时后，洗掉柠檬酸铁再加病毒感染仍然可以抑制病毒诱导的的IL-1β分泌(图4D),而IL-1β的分泌和病毒复制是正相关的。说明柠檬酸铁具对病毒感染有一定的预防作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种活性成分的用途，其特征在于，用于制备抑制RNA病毒的药物组合物，其中，所述的活性成分至少含有：

提供柠檬酸根离子C₅H₇O₅COO^-的物质A；和

提供铁离子的物质B；

且所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:8-8:1。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提供柠檬酸根离子的物质A包括一种或多种选自下组的物质：柠檬酸氢二铵((NH₄)₂HCit)、柠檬酸氢二钠(Na₂HCit)、异柠檬酸三钠；优选为柠檬酸氢二铵、柠檬酸氢二钠。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，提供铁离子的物质B包括一种或多种选自下组的物质：氯化铁(FeCl₃)、硫酸铁铵、硫酸亚铁铵；优选为氯化铁、硫酸铁铵。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:5-5:1，较佳地为1:2-2:1，更佳地，为1:1。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的铁离子包括二价铁离子和/或三价铁离子；和/或

所述的柠檬酸根离子还包括异柠檬酸根离子。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RNA病毒包括：肠道病毒、艾滋病病毒、流感病毒。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物的工作pH值为7.0±0.05-7.5±0.05，较佳地，为7.2±0.05-7.4±0.05。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的活性成分中，按柠檬酸根离子和铁离子的总量计，浓度≥10μM，较佳地≥30μM，更佳地≥50μM。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述的活性成分为：

提供柠檬酸根离子的物质A；和

提供铁离子的物质B；

且所述物质A和物质B的比例按柠檬酸根离子和铁离子的摩尔比计为1:8-8:1，较佳地，为1:5-5:1，更佳地为1:2-2:1，最佳地，为1:1。

10.一种体外非治疗性抑制RNA病毒对细胞侵袭的方法，其特征在于，在提供柠檬酸根离子的物质A和提供铁离子的物质B的共同存在下，对RNA病毒和细胞进行共培养，从而抑制RNA病毒对细胞的侵袭。