CN107441207B - 中成药控涎丸在制备抗hiv潜伏药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域,涉及中成药控涎丸的药物新用途,具体涉及中成药控涎丸在制备抗HIV潜伏药物的用途。所述控涎丸批准文号:国药准字Z11021138。本发明的实验结果证实,所述控涎丸对潜伏感染细胞模型不仅具有高的诱导激活作用,且其激活作用具有剂量依赖效应,可制备抗HIV潜伏药物;所述控涎丸与核苷类逆转录酶抑制剂或非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂等多种抗HIV药物可进一步制备药物组合物,用于激活清除潜伏病毒,并最终清除或降低病毒库。本发明将为HIV潜伏感染病毒诱导激活和最终清除提供新的途径和手段。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,涉及一种中成药控涎丸的药物新用途,具体涉及中成药控涎丸在制备抗HIV潜伏药物的用途。
背景技术
艾滋病,即获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV-1)感染免疫系统引起的严重影响人类身心健康的传染性疾病。2012年全球约有3530万人感染HIV-1,其中新增感染数为230万,死亡数为160万,AIDS已成为当今世界严重的公共卫生问题和社会问题。目前,艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆转录病毒疗法(High Active AntiretroviralTreatment ,HAART),该疗法可使血浆HIV-1水平降低到临床检测线以下,大大提高了患者的生活质量,使患者获得接近正常的寿命;但是一旦终止治疗,患者的病毒载量又会迅速回升到治疗前水平。患者体内HIV-1难以被完全清除的一个重要原因是病毒潜伏库的存在,病毒潜伏库主要由静止的CD4+T细胞组成,此外,还包括树枝状细胞和巨噬细胞等,其形成主要有两条途径:一是HIV-1感染活化的细胞,所述细胞多数被免疫系统等杀死,极少数存活下来,转化成静止记忆状态,是潜伏库的主要来源;二是HIV-1直接感染静止细胞,在细胞未激活的情况下病毒cDNA成功整合到宿主基因组上。由于潜伏库中整合的前病毒缺乏转录活性,因而可逃避免疫系统和HAART疗法的攻击,虽然潜伏感染细胞数量很少,但半衰期长,在个体生存期内仅靠HAART治疗将其彻底清除是不可能的,病毒潜伏库成为根除HIV-1的主要障碍[Finzi, D. et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanismfor lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combinationtherapy. Nature Med. 1999,5, 512–517]。针对上述现象,有研究者提出了激活-清除策略,即试图通过药物诱导潜伏感染细胞中前病毒表达,同时结合HAART疗法以达到彻底根除HIV-1的目的(Richman et al.The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection ,Science,2009,1304, 323)。
目前,已有报道的几种激活潜伏HIV-1的方案进入临床试验;如基于细胞因子的有白细胞介素2(NCT00004978,NCT00001535),白细胞介素7(NCT00105417); 基于组蛋白去乙酰化酶抑制剂的有Valproic acid (NCT00289952),Vorinostat(NCT01319383,NCT01365065),Romidepsin(NUT01933594,NUT02092116),Panobinostat(NCT01680094);基于磷酸酶及其同源物抑制剂的有 Disulfiram(NCT01286259,NCT01365065)。上述诱导剂分别与HAART疗法结合在临床上已取得了初步疗效,但仍存在激活效率不高或毒副作用等问题,因此,研发新型药物,制定新型抗潜伏治疗策略已成为该领域亟待解决的关键问题。
口服中成药控涎丸由醋甘遂,红大戟,白芥子制成,具有涤痰逐饮之功效;主治痰涎水饮停于胸膈,症见胸胁隐痛,咳喘痛甚,痰不易出;瘰疬、痰核。已载入《中华人民共和国药典》2010版第一部,国药准字Z11021138。然而,迄今为止,仍未见有关控涎丸具有抗HIV潜伏治疗作用的报道。
基于现有技术的现状,本申请的发明人拟提供中成药控涎丸的药物新用途,具体涉及中成药控涎丸在制备抗HIV潜伏药物的用途。
发明内容
本发明的目的是提供中成药控涎丸的药物新用途,具体涉及中成药控涎丸在制备抗HIV潜伏药物的用途。
本发明所述的口服中成药控涎丸由醋甘遂,红大戟,白芥子制成,具有涤痰逐饮之功效;主治痰涎水饮停于胸膈,症见胸胁隐痛,咳喘痛甚,痰不易出;瘰疬、痰核。已载入《中华人民共和国药典》2010版第一部,国药准字Z11021138。更具体的,所述的控涎丸有下述重量配比的中药材制备:醋甘遂300g,红大戟300g,白芥子300g;以上三味,粉碎成细粉,过筛,混匀;另取米粉或黄米粉240g,调稀糊;取上述粉末,用稀糊泛丸,干燥,即得,为逐水剂,具有涤痰逐饮之功效;主治痰涎水饮停于胸膈,症见胸胁隐痛,咳喘痛甚,痰不易出;瘰疬、痰核。
本发明所采用的控涎丸来源于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂,批准文号国药准字Z11021138。碾成粉末溶于DMSO(购自SIGMA)。
本发明采用如下技术方案证实所述药物对HIV潜伏感染细胞有使其潜伏病毒再次激活作用:
本发明中,选用的HIV-1潜伏感染细胞模型是A10.6和C11,A10.6由美国国家健康卫生研究院AIDS参考试剂计划部(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)惠赠,是国际上通用的HIV-1潜伏感染细胞模型;C11,由本实验室构建,利用该模型已发表多篇文章(Ding, D. et al. Involvement of histone methyltransferase GLP in HIV-1 latency through catalysis of H3K9 dimethylation. Virology,2013, 440, 182-189。Wang PF, et al.. AS2O3 synergistically reactivate latent HIV-1 byinduction of NF-kB. Antiviral Research, 2013,100, 688–697。(6). Qu X, et al..Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1proviral DNA from infected and latently infected human T cells. Nucleic AcidsRes. 2013;41(16):7771-82.);
所述细胞系均是由携带绿色荧光蛋白基因的HIV-1感染人T淋巴细胞后经细胞分选及激活等途径而建立的HIV-1潜伏感染细胞克隆株,其生物学特性是整合有HIV-1,但病毒基因并不表达(基因沉默),一旦在激活诱导剂刺激下,沉寂的病毒基因可被激活而表达,绿色荧光蛋白可在活化细胞上观察,因此,作为报告基因(即潜伏感染细胞是否被激活的标记)。
本发明中,实验结果表明所述的药控涎丸具有可激活艾滋病病毒(HIV)潜伏感染细胞、具有抗HIV潜伏作用;
本发明进一步提供一种药物组合物,该药物组合物由控涎丸与抗 HIV药物或免疫抗体或基因修饰的免疫细胞组成;
经实验结果表明,所述控涎丸与抗 HIV药物或免疫抗体或基因修饰的免疫细胞结合具有激活清除潜伏病毒并最终清除或降低病毒库的作用;
本发明中,所述的细胞,属于人单个核细胞,人巨噬细胞,人CD4T淋巴细胞,人肥大细胞,人树突细胞,人滤泡样树突细胞,人造血祖细胞,人自然杀伤细胞、人神经元和少突神经胶质细胞等等;
本发明中,所述的抗 HIV药物为:
(1)核苷类逆转录酶抑制剂:①齐多夫定zidovudine(AZT或ZDV);②地丹诺辛didanosine(ddl、Videx);③扎西他滨Zalcitabine(ddc);④司他夫定Stavudine(d4T);⑤拉米夫定Lamivudine(3TC);⑥阿巴卡韦abacavir(1592U89Ziagen);
(2)非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI):①奈韦拉平nevirapine;②地拉韦啶delavird;③依非韦伦efavirene;
(3)蛋白酶抑制剂:①沙奎那韦saguinavir;②茚地那韦indinavir;③利托那韦ritonavir;④奈非那韦nelfinavirr;⑤安普那韦amprenavir。
本发明中,所述的抗 HIV免疫治疗抗体或基因修饰的免疫细胞为:抗 HIV免疫治疗抗体是中活性抗体;基因修饰的免疫细胞是针对HIV感染细胞的嵌合抗原受体T细胞或NK细胞或造血干细胞等。
本发明中进行了如下药物试验:
(1)控涎丸对HIV潜伏诱导激活的影响试验
本发明以浓度为25μg/mL的药物处理HIV潜伏感染细胞模型C11,在药物处理后的3天,通过对报告基因绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察和流式细胞术检测,分析HIV潜伏感染细胞的激活效率,获得药物对HIV潜伏诱导激活的影响;
结果显示, HIV潜伏感染细胞经控涎丸处理后绿色荧光阳性的细胞比例达高达66.2%;未加诱导剂处理的HIV-1潜伏感染细胞,其荧光阳性的细胞比例仅有3.80%背景激活;
结果表明,所述控涎丸具有对HIV-1潜伏感染细胞的激活作用;
(2)控涎丸的不同浓度对HIV潜伏诱导激活效率的影响试验
本发明以浓度为0.25μg/mL-250 μg/mL的药物处理HIV潜伏感染细胞模型C11,在药物处理后的3天,通过流式细胞术检测,分析HIV潜伏感染细胞的激活效率,从而获得药物作用的剂量效应关系;
结果显示,随着控涎丸浓度的升高, C11细胞模型中表达绿色荧光的细胞数目增多;当控涎丸浓度从0.25μg/mL增加到250 μg/mL时,GFP阳性细胞所占比例从5.01%增加到70.40%;
结果表明,所述控涎丸对HIV-1潜伏感染细胞的激活作用具有剂量效应关系;
(3)控涎丸与核苷类逆转录酶抑制剂或非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂等多种抗HIV药物联合使用,对HIV感染病毒的影响试验,结果表明,所述控涎丸与抗 HIV药物或免疫抗体或基因修饰的免疫细胞结合具有激活清除潜伏病毒并最终清除或降低病毒库的作用。
本发明的实验结果证实,所述控涎丸对潜伏感染细胞模型不仅具有高的诱导激活作用,且其激活作用具有剂量依赖效应;因而,所述控涎丸与核苷类逆转录酶抑制剂或非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂等多种抗HIV药物联合使用,将为HIV潜伏感染病毒诱导激活和最终清除提供了一个新途径和手段,可用于制备新的抗HIV潜伏的药物。
为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1 显示了控涎丸对HIV潜伏诱导激活状况,其中,
A 控涎丸对HIV潜伏诱导激活荧光显微镜下观察,未加药物组(图1-1为荧光照片,图1-2为同一视野白光照片),控涎丸(图1-3为荧光照片,图1-4为同一视野白光照片);
B控涎丸对HIV潜伏诱导激活流式细胞术检测。
图2 控涎丸激活潜伏HIV-1的剂量效应关系,其中,药物终浓度分别为0μg/mL,0.25μg/mL,2.5μg/mL,25μg/mL,250μg/mL,1μM JQ1(阳性对照);处理细胞72小时后进行流式细胞术检测,分析荧光细胞所占比例。
具体实施方式
实施例1. 控涎丸在在C11细胞上诱导潜伏HIV-1的表达
按每孔2×104个将C11细胞接种于96孔板中,每孔加入100 μL含10%FBS(Gibco)的1640培养基(Gibco),按药物与培养基1:200比例加入终浓度为25μg/mL的控涎丸;药物处理72 h后,在荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况,并收集细胞进行流式细胞术检测,分析荧光细胞所占比例;
结果显示,所述控涎丸可诱导潜伏HIV-1的表达;HIV-1潜伏感染细胞C11经控涎丸处理后绿色荧光阳性的细胞比例高达66.2%,而未加诱导剂处理的HIV-1潜伏感染细胞,其荧光阳性的细胞比例仅有3.80%背景激活;结果表明,所述控涎丸具有对HIV-1潜伏感染细胞的激活作用。
实施例2 控涎丸诱导潜伏HIV-1的表达具有剂量依赖效应,
按每孔2×104个将C11细胞种植于96孔板中,每孔加入100 μL含10%FBS(Gibco)的1640培养基(Gibco),按药物与培养基1:200比例加入不同浓度的控涎丸;药物处理72 h后,收集细胞进行流式细胞术检测,分析荧光细胞所占比例;
结果显示,HIV-1潜伏感染细胞C11经控涎丸处理后,随着所述控涎丸浓度的升高,表达绿色荧光的细胞数目增多;当控涎丸浓度从0.25μg/mL增加到250 μg/mL时,GFP阳性细胞所占比例从5.01%增加到70.40%;而未加诱导剂处理的HIV-1潜伏感染细胞,其荧光阳性的细胞比例仅有3.80%背景激活;结果表明,所述控涎丸对HIV-1潜伏感染细胞的激活作用具有剂量效应关系。
实施例3 控涎丸与抗逆传录病毒药物及其他免疫制剂或修饰细胞联合使用
进一步分别采用实施例1或实施例2的控涎丸处理方案与抗逆传录病毒药物及其他免疫制剂或修饰细胞联合使用,观察对HIV-1潜伏感染细胞的影响,结果表明,所述控涎丸具有诱导HIV潜伏细胞激活或干预HIV潜伏的作用,与抗逆传录病毒药物及其他免疫制剂或修饰细胞联合使用,可杀死被激活的潜伏感染的细胞,加速潜伏病毒储藏库的清除,进一步将为艾滋病的彻底治愈提供新的干预途径。
Claims (7)
1.中成药控涎丸在制备抗HIV潜伏药物中的用途,其中,所述的控涎丸由醋甘遂,红大戟和白芥子及药物辅料制成;
所述的抗HIV潜伏药物是诱导激活HIV的药物;
所述的控涎丸由下述重量配比的中药材制备:醋甘遂300g,红大戟300g,白芥子300g;以上三味,粉碎成细粉,过筛,混匀;另取米粉或黄米粉240g,调稀糊;取上述粉末,用稀糊泛丸,干燥,即得。
2.按权利要求1所述的用途,其特征在于,所述控涎丸激活艾滋病病毒潜伏感染细胞、抗HIV潜伏。
3.按权利要求2所述的用途,其特征在于,所述控涎丸对HIV-1潜伏感染细胞的激活作用具有剂量效应关系。
4.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述艾滋病病毒潜伏感染细胞为人单个核细胞,人巨噬细胞,人CD4T淋巴细胞,人肥大细胞,人树突细胞,人滤泡样树突细胞,人造血祖细胞,人自然杀伤细胞、人神经元或少突神经胶质细胞。
5.按权利要求1所述的用途,其特征在于,由控涎丸与抗 HIV药物或免疫抗体或基因修饰的免疫细胞组成的药物组合物在制备激活清除潜伏病毒,并最终清除或降低病毒库的制剂中的用途,其中,所述控涎丸与抗 HIV药物或免疫抗体或基因修饰的免疫细胞结合。
6.按权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的抗 HIV药物为:
核苷类逆转录酶抑制剂:①齐多夫定zidovudine;②地丹诺辛didanosine;③扎西他滨Zalcitabine;④司他夫定Stavudine;⑤拉米夫定Lamivudine;⑥阿巴卡韦abacavir;
非核苷类逆转录酶抑制剂:①奈韦拉平nevirapine;②地拉韦啶delavird;③依非韦伦efavirene;
蛋白酶抑制剂:①沙奎那韦saguinavir;②茚地那韦indinavir;③利托那韦ritonavir;④奈非那韦nelfinavirr;⑤安普那韦amprenavir。
7.按权利要求6所述的用途,其特征在于,所述抗 HIV免疫治疗抗体或基因修饰的免疫细胞为:抗 HIV免疫治疗抗体是中活性抗体;基因修饰的免疫细胞是针对HIV感染细胞的嵌合抗原受体T细胞或NK细胞或造血干细胞。
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