CN110448548B - Ifitm2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了IFITM2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。本发明还公开了一种治疗乙型肝炎的药物，它是以IFITM2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。本发明最后提供了一种治疗乙型肝炎的联合用药物。本发明实验数据表明：敲除IFITM2基因或抑制IFITM2基因的表达，一方面将增强内源性干扰素的表达水平，从而显著降低HBV的复制水平，能有效治疗乙型肝炎；另一方面还会提高肝细胞对外源性干扰素的敏感性，改变"对干扰素治疗无应答的乙型肝炎患者"对外源性干扰素不敏感性的状态，而对干扰素治疗有应答，使得外源性干扰素能有效治疗"对干扰素治疗无应答"的乙型肝炎。

Description

IFITM2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途
技术领域
本发明涉及IFITM2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。
背景技术
乙型肝炎系乙型肝炎病毒(HBV)所感染的一种传染病，病毒的持续复制和免疫功能紊乱是发病的重要因素，现阶段临床医学关于乙型肝炎的治疗多以抗病毒治疗为主。全球有超过4亿人感染HBV，而中国为感染HBV患者最多的国家之一。HBV感染可引起急慢性肝炎，严重者可能发展为肝硬化和肝细胞癌，严重威胁人类健康，降低人们生活质量。
干扰素(interferon，IFN)是机体细胞受病毒感染后释放出来的免疫物质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。人干扰素是由多种亚型组成的家族，包括β干扰素、ε干扰素、κ干扰素、ω干扰素和12种α干扰素，一般用于乙肝治疗的是α干扰素(又称I型干扰素)。干扰素作为兼具抗病毒与免疫调节两种效果的临床用药，在阻断病情发展上具有良好的临床表现，成为治疗乙型肝炎最有效的药物之一。然而，有研究指出，有接近50％的患者对该药仍无有效应答，因此在临床应用上缺乏稳定性。
人体感染HBV后，将通过激活内源性干扰素通路中的基因发挥免疫防御作用，这些基因主要包括：IFN基因，IFN受体基因，IRF基因(interferon regulated gene)，ISG基因(interferon stimulated gene)等，它们的表达水平对干扰素抗病毒疗效有很大影响。其中，某些ISG基因对干扰素通路有较强的负调控作用，当HBV感染人体后，在不同个体中不同程度地激活这些关键ISG基因，将抑制干扰素通路中的关键基因(IFN基因，IFN受体基因，IRF基因)的表达，同时，也抑制外源性干扰素的药效，从而表现出对干扰素治疗无应答。
介于HBV对干扰素治疗无应答患者的危害较大，找出合适的治疗靶点和药物，对预测干扰素抗HBV疗效和优化干扰素治疗方案有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗乙型肝炎的药物。
IFITM2：人类干扰素诱导跨膜蛋白2(interferon-induced transmembraneprotein 2)，为干扰素诱导跨膜蛋白家族(IFITM)家族成员之一，IFITM属于ISG基因。
IFITM2抑制剂：抑制人类干扰素诱导跨膜蛋白2的活性或者表达的物质。
本发明提供了IFITM2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。
其中，所述乙型肝炎为对干扰素治疗无应答的乙型肝炎。
其中，所述药物是增强内源性干扰素的表达水平的药物，和/或提高肝细胞对外源性干扰素的敏感性的药物。
其中，所述IFITM2抑制剂为敲除IFITM2基因或降低IFITM2活性/表达量的药物。
其中，所述降低IFITM2活性/表达量的药物为2-bromopalmitate，其结构式如下：
Figure BDA0001654182310000021
本发明提供了一种治疗乙型肝炎的药物，它是以IFITM2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
其中，所述乙型肝炎为对干扰素治疗无应答的乙型肝炎。
其中，所述IFITM2抑制剂为敲除IFITM2基因或降低IFITM2活性/表达量的药物。
其中，所述降低IFITM2活性/表达量的药物为2-bromopalmitate，其结构式如下：
Figure BDA0001654182310000022
本发明最后提供了一种治疗乙型肝炎的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的IFITM2抑制剂和干扰素，以及药学上可接受的载体。
其中，所述HBV为对干扰素治疗无应答的HBV。
其中，所述IFITM2抑制剂为敲除IFITM2基因或降低IFITM2活性/表达量的药物。
本发明实验数据表明：过表达IFITM2不仅能抑制内源性干扰素的产生，还会导致机体对外源性干扰素不敏感，引起干扰素治疗乙型肝炎的效果不佳。因此，敲除IFITM2基因或抑制IFITM2基因的表达，一方面将增强内源性干扰素的表达水平，从而显著降低HBV的复制水平，能有效治疗乙型肝炎；另一方面还会提高肝细胞对外源性干扰素的敏感性，改变"对干扰素治疗无应答的乙型肝炎患者"对外源性干扰素不敏感性的状态，而对干扰素治疗有应答，使得外源性干扰素能有效治疗"对干扰素治疗无应答"的乙型肝炎。本发明提供的IFITM2抑制剂能有效治疗乙型肝炎，并可以使得外源性干扰素能有效治疗"对干扰素治疗无应答"的乙型肝炎，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1当机体感染HBV病毒以后，内源性干扰素及抗病毒蛋白的产生示意图；
图2过表达IFITM2将显著降低DC细胞中TBK1和IRF3的总蛋白的表达水平和磷酸化水平；其中，代表不进行处理即空白对照组，vec代表质粒的空载体组vector,即阴性对照，+即转染了过表达IFITM2质粒的实验组；
图3随着Huh-7细胞中的IFITM2增高，将引起干扰素诱导剂(Poly:IC)诱导DC细胞生成IFN-α的水平减弱；
图4过表达IFITM2后检测下游通路的变化，发现IFITM2显著抑制了ERK和p38的磷酸化，而对JNK无影响；
图5ERK抑制剂U0126处理细胞后，ERK磷酸化被抑制，TBK1，IRF3磷酸化活性也被抑制，表明ERK磷酸化活性对于TBK1和IRF3活化是必要的；
图6P38抑制剂SB203580处理细胞后，p38磷酸化被抑制，而TBK1，IRF3磷酸化活性基本未变，表明p38通路不影响TBK1和IRF3磷酸化；
图7完整外泌体结构；
图8免疫荧光显示外泌体可被DC细胞吸收；
图9western检测，western显示Huh7中过表达IFITM2可以增加培养基中外泌体IFITM2表达水平；
图10western实验证明,10uM GW4869可显著抑制外泌体分泌，并减少其中IFITM2的水平；
图11有DC细胞在Huh-7细胞中过表达的IFITM2，会通过外泌体进入共培养DC细胞共培养；
图12IFITM2上为70，71号位点的两个半胱氨酸残基，是其跨膜区域；
图13IFITM2的棕榈酰化位点；
图14 2-BP处理细胞抑制IFITM2棕榈酰化，IFITM2蛋白上70，71位点半胱氨酸的棕榈酰化水平影响IFITM2被整合至外泌体的量；
图15 2-BP处理细胞抑制IFITM2蛋白上70，71位点棕榈酰化，则会抑制细胞分泌的外泌体中IFITM2水平；
图16 2-BP处理细胞抑制IFITM2棕榈酰化，可抑制IFITM2的合成；
图17荧光共聚焦实验验证CRPISPR-Cas9系统对Huh-7中IFITM2的敲除效率；
图18过表达IFITM2的Huh-7细胞系中转染HBV质粒并与DC细胞共培养，则会抑制DC细胞中的ERK/TBK1/IRF3通路的磷酸化，从而抑制内源性干扰素通路，同时还会抑制Huh-7细胞中的STAT1/2/MX1/OAS1等抗病毒因子；当DC细胞的内源性干扰素通路被过表达的IFITM2抑制后，若再使用外源性干扰素，将无法完全激活Huh-7细胞中的(STAT1/STAT2)通路，从而导致无法合成相应的抗病毒蛋白(2’，5’-OAS/MX1)，导致宿主对外源性干扰素不敏感，引起干扰素治疗HBV感染应答不佳；然而，若敲除Huh-7细胞中IFITM2，当感染HBV后，DC中ERK/TBK1/IRF3不会被抑制，内源性干扰素会得到表达；另外，当加入外源性干扰素时，还会刺激Huh-7细胞中的(STAT1/STAT2)通路，从而增强抗病毒蛋白(2’，5’-OAS/MX1)的表达，会增强Huh-7细胞对外源性干扰素的敏感性，因此，敲除IFITM2基因将抑制HBV复制；
图19利用crispr技术对Huh-7细胞中IFITM2进行敲除，会上调干扰素通路中关键因子的活化程度，从而抑制HBV复制；进行回补后HBV复制再次升高；当机体内的内源性干扰素通路被HBV诱导的IFITM2抑制后。
具体实施方式
1、前言
当机体感染HBV病毒以后，会通过以下两种途径来抑制HBV病毒的复制：
(1)HBV病毒会激活免疫细胞的TLR4信号通路，从而增强
TBK1/IRF3/IKK的表达水平，引起内源性干扰素的产生，从而抑制HBV病毒的复制。
(2)肝细胞的干扰素感受器会受到内源性/外源性干扰素的刺激，从而活化(STAT1/STAT2)通路，增强抗病毒蛋白(OAS/MX1/PKR)的表达，从而抑制HBV病毒的复制。具体过程，详见图1。
实验例1IFITM2抑制TBK1/IRF3活化及IFNα合成
1、实验材料
细胞系：Huh-7细胞系
2实验方法：
将Huh-7细胞系分为3组，组1为空白对照，组2中转染入EGFP空载体质粒，组3中转染如EGFP-IFITM2过表达质粒，然后收集3个组的细胞备用。
将Huh-7细胞系培养基中加入Poly:IC(聚肌胞苷酸)干扰素诱导剂使终浓度为1μg/ml，培养72小时，然后收集细胞备用。
已有文献报道TBK1和IRF3蛋白及磷酸化水平与MAPK通路相关(PMID:15502830)。因此通过ERK还是p38的特异性抑制剂来进一步确认是哪一条通路发挥作用。
ERK抑制剂U0126处理细胞、P38抑制剂SB203580处理细胞，具体是将抑制剂溶解于DMSO中，按推荐剂量加入培养基中处理72小时，收集细胞。
2.1总RNA抽提
(1)细胞培养皿中细胞样品用1×PBS洗两次，将PBS吸干，加入1ml Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；
(2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，室温静置3-5min；
(3)4℃下，14000g离心15min，将上层RNA，移至另一个新的RNase free EP管；
(4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10min；
(5)4℃下，14000g离心10min，收集RNA沉淀；
(6)75％乙醇洗涤两次，超净台风干。
(7)视沉淀量加入适量DEPC水溶解沉淀。
2.2利用两步法进行逆转录PCR，所用试剂盒为擎科GoldenstarTMRT6cDNASynthesis Kit。
按如下体系配制逆转录PCR系统(20μl)：
Figure BDA0001654182310000051
配制好混匀后，按如下反应条件进行逆转录反应
50℃30分钟
85℃5分钟
所得cDNA样本可用于接下来的实时荧光定量PCR实验，若暂时不用则冻存于-20℃中保存。
2.3QPCR
体系配制(15ul体系)：
SYBR Green PCR Master Mix 7.5ul(ROCHE)(使用前需振荡均匀)
上游引物0.5ul(10uM)
下游引物0.5ul(10uM)
H2O 4ul
IFNA2-F:TCTGGCTGTGAGGAAATACTTC/IFNA2-R:GAGCTGGCATACGAATCAATG
GAPDH-F:GACCTGACCTGCCGTCTA/GAPDH-R:AGGAGTGGGTGTCGCTGT。
总体系配好后，然后15ul每管分装至8连管中。灭菌纯水稀释cDNA至100ng/ul后按100ng/孔加入8连管仲。加至上述反应体系中吹打混匀，离心上机。
95℃1min
95℃10s
55℃5s
72℃15s(采集荧光信号)
2.4Western印迹
2.4.1试剂准备/蛋白样品制备
(1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液；
(2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液，重复以上操作两次，将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM)，摇匀置于冰上；
(4)每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min；
(5)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中；
(6)于4℃下12000rpm离心5min；
(7)将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于－20℃保存。
2.4.2蛋白含量的测定/制作标准曲线
(1)从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用；
(2)取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg；
(3)按顺序在各管中加入8μl双蒸水，2μ样本液体，200μl考马斯亮蓝buffer，
(4)吹打混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上570nm波长处比色分析。
(5)根据所得各样本吸光度和浓度绘制标准曲线。
2.4.3检测样品蛋白含量
(1)取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml，室温放置30min后即可用于测蛋白；
(2)取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
(3)弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用无菌水洗一次；
(4)取一管考马斯亮蓝加95ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中，按sample键测样品。
2.4.4SDS-PAGE电泳
(1)在同一玻璃板中先配含有TEMED的10％分离胶，待胶凝固后，再配含有TEMED的4％浓缩胶，补入剩余空间。胶制备好后，用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中；
(2)测完蛋白含量后，计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量，取出上样样品至0.5ml离心管中，根据上样体积加入5×SDS-PAGE上样缓冲液至终浓度为1×；混匀后将样品于金属浴中100℃5min使蛋白变性；
(3)将蛋白上样，电泳4-5h，电压40V或60V，电泳至溴酚兰刚跑出，终止电泳；
(4)转膜：60V转移2h或40V转移3h，转完后将膜用1×丽春红染液染5min，用水冲洗掉没染上的染液，将膜晾干备用；
(5)免疫反应：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温，封闭1h。将一抗用TBST稀释至适当浓度(1：1000稀释)；将一抗溶液与膜，室温，孵育1-2h，用TBST洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。同上方法准备二抗，稀释液并与膜接触，室温，孵育1-2h后，用TBST洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
(6)化学发光、显影、定影，得到胶片，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
2.5荧光共聚焦成像实验
铺板，PBS洗板，新鲜配制的4％多聚甲醛固定20分钟。设定一、二抗的浓度，一抗4度孵育过夜(时间8～12h)；二抗(荧光抗体)孵育时要避光，孵育好后用PBS充分冲洗，滴加抗荧光淬灭剂。到激光共聚焦观察室后，再将爬片取出，在干净的载玻片上滴一滴50％的甘油，然后将爬片取出来倒扣在滴过甘油的载玻片上，显微镜下观察，采图。
3实验结果
由图2可知，过表达IFITM2将显著降低DC细胞中TBK1和IRF3的总蛋白的表达水平和磷酸化水平。
由图3可知，随着Huh-7细胞中的IFITM2增高，将引起干扰素诱导剂(Poly:IC)诱导DC细胞生成IFN-α的水平减弱。
由图4可知，过表达IFITM2后检测下游通路的变化，发现IFITM2显著抑制了ERK和p38的磷酸化，而对JNK无影响。
由图5可知，ERK抑制剂U0126处理细胞后，ERK磷酸化被抑制，TBK1，IRF3磷酸化活性也被抑制，表明ERK磷酸化活性对于TBK1和IRF3活化是必要的。
由图6可知，P38抑制剂SB203580处理细胞后，p38磷酸化被抑制，而TBK1，IRF3磷酸化活性基本未变，表明p38通路不影响TBK1和IRF3磷酸化。
由上述可知，IFITM2可以通过抑制MAPK通路中的ERK磷酸化抑制其下游TBK1/IRF3活化，从而抑制宿主内源性IFNα合成。
实施例2IFITM2被整合至外泌体并被树突细胞接收从而抑制I型干扰素的验证
1、实验材料
100,000×gexosome沉淀或富集的外泌体、2％or4％(w/v)PFA、PBS、1％戊二醛、草酸双氧铀,pH 7、甲基纤维素-UA，pH 4:9份2％甲基纤维素+1份4％乙酸双氧铀，用前混合、Formvar-carbon载样铜网、封口膜、5号镊子、玻璃培养皿、不锈钢环，比铜网略大、1号滤纸、铜网储存盒、透射电镜。
2、实验方法
(1)收集细胞培养基上清中外泌体：利用MN试剂盒纯化上清中的外泌体。收集细胞培养基上清，4℃离心4000rpm×10min，弃沉淀。
(2)电镜观察外泌体：利用试剂盒
①重悬100,000×g离心的exosome沉淀溶于50μl 2％PFA(四氟乙烯)；
②将5μlexosome悬液加到Formvar-carbon载样铜网上，每份exosome样品准备2-3个铜网。盖上盖子，在干燥环境中让Formvar膜吸收20min。*注：也可将5到10μl exosome悬液滴加到封口膜上，将铜网Formvar膜面朝下放在悬液上；
③将100μl PBS加到封口膜上，用镊子将铜网(Formvar膜面朝下)放在PBS液滴上清洗(保持Formvar膜面湿润，而另一面干燥)；
④将铜网放在50μl 1％戊二醛液滴上5min；
⑤将铜网放在100μl ddH2O 2min(洗8次)。
(3)反差增强及包埋样本
①将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上pH 7,5min；
②将铜网放在50甲基纤维素-UA液滴上10min，冰上操作；
③用不锈钢环移开铜网，在滤纸上轻轻吸去多余液体，留下一薄层甲基纤维素膜；
④铜网仍在不锈钢环上，空气中干燥5到10min；
⑤将铜网处在在盒子里；
⑥80kV下拍摄电镜照片。
(4)Huh-7细胞、DC细胞共培养
①胰酶消化Huh—7细胞，含血清培养基终止消化后离心1000rpm×4min,弃去培养液，培养基重悬后调整细胞密度至5×105/ml，取2ml/孔铺于六孔板中。
②铺板后24小时内对Huh-7细胞进行转染(方法如前述)，转染24小时后安置0.4μmTranswell小室(Merck)，向小室中接种1ml 5×105ml的DC细胞，共培养48小时后分别刮取上层DC细胞和下层Huh-7细胞，裂解液处理后提取总蛋白，测定浓度western blot检测各因子水平。
(5)GW4869处理细胞
取不同浓度GW4869浓度(1/5/10μM)分别处理过表达IFITM2的Huh-7细胞，24h后收集细胞总蛋白和上清中的外泌体，western blot检测细胞内和外泌体中IFITM2水平。
3、实验结果
3.1如图7、图8，电镜图显示Huh7细胞培养基中存在大量完整外泌体结构，免疫荧光显示外泌体可被DC细胞吸收。
3.2收集培养基中外泌体进行western检测，如图9，western显示Huh7中过表达IFITM2可以增加培养基中外泌体IFITM2表达水平，提示若细胞内IFITM2水平增高，可引起其分泌的外泌体中IFITM2水平相应增加。
3.3要证明IFIMT2通过外泌体发挥作用，还需通过单独抑制外泌体分泌来反证。选择GW4869(外泌体分泌抑制剂)处理Huh7细胞，收集单位体积上清中外泌体，检测细胞上清中的外泌体含量及IFITM2表达水平。如图10，western实验证明，10uM GW4869可显著抑制外泌体分泌，并减少其中IFITM2的水平。
3.4结果如图11，在Huh-7细胞中过表达的IFITM2，会通过外泌体进入共培养DC细胞共培养。
由上述可知：IFITM2可以被整合至外泌体中被分泌至胞外进行细胞间通讯。抑制细胞外泌体合成途径可以抑制外泌体中IFITM2的含量。IFITM2先在肝细胞内被HBV激活，再通过外泌体被分泌至胞外，作用于免疫细胞发挥对干扰素通路的抑制作用。
实施例3突变抑制70C,71C位点的棕榈酰化反应会抑制IFITM2被包装至外泌体的验证
1、实验材料
IFITM2-EGFP质粒(wt)，突变引物，PCR试剂盒
2、实验方法
2.1构建IFITM2点突变质粒：分别合成包含70C，71C点突变及上下游各20碱基的突变引物序列，PCR法扩增，挑单克隆菌落扩增测序。
突变引物为：引物序列：
70C/A-F:CCTCTTCATGAACACCGCCTGCCTGGGCTTCATA
70C/A-R:TATGAAGCCCAGGCAGGCGGTGTTCATGAAGAGG
71C/A-F:CCTCTTCATGAACACCTGCGCCCTGGGCTTCATA
71C/A-R:TATGAAGCCCAGGGCGCAGGTGTTCATGAAGAGG
70,71CC/AA-F:TCTTCATGAACACCGCCGCCTGGGCTTCATAGCAT
70,71CC/AA-R:ATGCTATGAAGCCCAGGCGGCGGTGTTCATGAAGA
2.2ABE法：
2.2.1实验所用试剂如表1
表1：实验试剂
Figure BDA0001654182310000111
2.2.2准备试剂
①准备裂解液(LB)，加入蛋白酶抑制剂，每10ml裂解液中，加入0.1ml PMSF至终浓度为10mM,加入一片蛋白酶抑制剂；
②准备NEM溶液。室温中用100％乙醇溶解NEM粉；
③混合裂解液和NEM。取0.5ml 2M NEM加入到50ml离心管中，加入20ml裂解液，4℃充分混匀5min(注意先加NEM/乙醇溶液，再加入裂解液)；
④在冰上移除细胞培养基，用冰PBS轻柔润洗两次。加入300μl裂解液+NEM,收集液体至离心管中；
⑤将裂解液收集到预冷的1.5ml离心管中，4℃静置1h；
⑥14,000rcf离心30min,收集上清到新的预冷过的1.5ml离心管中，BCA法定量，取1g蛋白，用LB+NEM补齐液体量至500μl；
⑦取1-5μg检测蛋白一抗到每一份蛋白样本中，静置抗体-蛋白混合物4℃过夜。
⑧准备50％的beads，加入与抗体-蛋白混合物等体积的beads,4℃静置>1h。
2.2.3ABE法：HAM cleavage
①准备有不同pH值的裂解液，每个样本准备2ml Ph 7.2的裂解液，以及0.5ml的Stringent Buffer.以及0.5ml的LB+10mM NEM,同样加入PMSF和蛋白酶抑制剂。；
②单独准备一排1.5ml离心管置于冰板上，标注为-HAM，将第二步后的样本轻微离心，0.5g/1min，4℃，置于冰板上，弃去上清，将beads重悬于600μlLB+10mM；
③在重悬beads后，迅速取200μl悬浊液到-HAM管中，并在-HAM管中加入300μl LB+10mM NEM,在余下的400μl悬浊液中加入100μl LB+10mM NEM,标为+HAM,这样每管中均有500μl.在冰上孵育10min；
④–HAM和+HAM的每个样本中轻柔加入500μl stringent buffer(尽快完成，因为SDS会导致抗体解构)；
⑤每个样本用0.5ml LB PH7.2润洗，0.5g/1min，4℃条件下离心；
⑥准备HAM buffer。用LB PH7.2加入适量体积的羟胺配成1M的HAM buffer，每个+HAM样本中加入0.5ml LB PH7.2+HAM液体。在每个-HAM样本中加入0.5ml LB PH7.2；
⑦所有样本室温静置1h，但不要超过1h；
2.2.4ABE:biotin-BMCC标记
①按每个样本2ml准备LB PH6.2，将其在冰板上预冷。室温秤取2.1mg biotin-BMCC,然后轻柔加入0.5ml DMSO，配制成8mM的浓度；
②在ABE法步骤完成后，在冰上用LB PH6.2轻柔润洗beads来移除HAM buffer；
③按每个样本0.5ml准备biotin-BMCC buffer(工作液浓度为0.5-5μM),混匀后4℃静置1h,但不要超过1h。
2.2.5洗脱生物素连接物和SDS-PAGE
①在完成上述步骤后，用LB PH6.2轻柔润洗所有样本，用no reducing agents移除掉所有2×SDS sample buffer；
②用LB PH7.5+PMSF/Inhibitor清洗所有样本各三次，保证所有样本都在冰上；
③最后一遍清洗时下端保留少量液体，用最小的枪头小心吸掉残留的液体；
④用2×SDS sample buffer配制成5mM的DTT溶液，每个样本中加入40-50μl 2*SDS sample buffer+5mM DTT.涡旋混匀瞬离，使其沉在底部；
⑤所有样本75-80℃煮10min,让所有样本在室温冷却10min以上，14，000rcf/3min；
⑥将所有样本通过SDS-PAGE电泳。
3实验结果
3.1通过在线CSS-PALM数据库，将IFITM2编码区蛋白序列导入，预测IFITM家族中有保守的棕榈酰化位点，其中IFITM2上为70，71号位点的两个半胱氨酸残基(70C，71C)，这也是其跨膜区域，结果如图12、图13所示。
3.2 2-BP处理细胞抑制IFITM2棕榈酰化(CoIP-ABE法)，可抑制IFITM2的合成和被整合至外泌体上，也可抑制外泌体的总量，结果如图14、15、16所示。
由上述结果可知：IFITM2蛋白上70，71位点半胱氨酸的棕榈酰化水平影响其被整合至外泌体的量。若抑制上述两位点棕榈酰化，则会抑制细胞分泌的外泌体中IFITM2水平。
实施例4敲除IFITM2导致HBV复制水平受到抑制的验证
1、实验材料
Crispr-Cas9/HDR质粒，其中，Crispr-Cas9的货号是sc-429826，HDR质粒的货号是sc-429826-HDR；X-TREME转染试剂，购自SantaCruz。
2、实验方法
Crispr-Cas9/HDR系统基因敲除:向24孔板内铺5×104的Huh-7细胞，铺板后24小时内转染购买的Crispr-Cas9/HDR质粒，第二天更换新鲜培养基培养至72小时。此后用含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM完全培养基进行筛选，筛选得到的阳性细胞。Western和荧光共聚焦实验验证是否敲除成功。向IFITM2-/-细胞系中转染HBV 1.2wt质粒，western blot观察IFITM2及相应免疫通路因子和抗病毒蛋白的蛋白表达水平。
DC共培养。在转染IFITM2过表达质粒24小时后的Huh-7细胞系或敲除了IFITM2的Huh-7细胞系上，放置TRANSWELL小室，将DC细胞接种于TRANSWELL小室上，使初始铺板覆盖度为60-70％，共培养72小时后，分别收集下层Huh-7细胞和上层DC细胞总蛋白，WesternBlot检测蛋白表达水平。
3、实验结果
3.1荧光共聚焦实验验证CRPISPR-Cas9系统对Huh-7中IFITM2的敲除效率。结果如图17所示。
3.2由图18、19可知：过表达IFITM2的Huh-7细胞系中转染HBV质粒并与DC细胞共培养，则会抑制DC细胞中的ERK/TBK1/IRF3通路的磷酸化，从而抑制内源性干扰素通路，同时还会抑制Huh-7细胞中的STAT1/2/MX1/OAS1等抗病毒因子。
当DC细胞的内源性干扰素通路被过表达的IFITM2抑制后，若再使用外源性干扰素，将无法完全激活Huh-7细胞中的(STAT1/STAT2)通路，从而导致无法合成相应的抗病毒蛋白(2’，5’-OAS/MX1)，导致宿主对外源性干扰素不敏感，引起干扰素治疗HBV感染应答不佳。
然而，若敲除Huh-7细胞中IFITM2，当感染HBV后，DC中ERK/TBK1/IRF3不会被抑制，内源性干扰素会得到表达。另外，当加入外源性干扰素时，还会刺激Huh-7细胞中的(STAT1/STAT2)通路，从而增强抗病毒蛋白(2’，5’-OAS/MX1)的表达，会增强Huh-7细胞对外源性干扰素的敏感性。因此，敲除IFITM2基因将抑制HBV的复制。
进一步地，往敲除IFITM2基因的Huh-7细胞中，回补IFITM2基因，HBV复制水平会再次升高。
因此，敲除IFITM2基因或抑制IFITM2基因的表达，一方面将增强内源性干扰素的表达水平，从而显著降低HBV的复制水平，能有效治疗乙型肝炎；另一方面还会提高肝细胞对外源性干扰素的敏感性，改变“对干扰素治疗无应答的乙型肝炎患者”对外源性干扰素不敏感性的状态，而对干扰素治疗有应答，使得外源性干扰素能有效治疗“对干扰素治疗无应答”的乙型肝炎。
综上，过表达IFITM2不仅能抑制内源性干扰素的产生，还会导致机体对外源性干扰素不敏感，引起干扰素治疗乙型肝炎的效果不佳。因此，敲除IFITM2基因或抑制IFITM2基因的表达，一方面将增强内源性干扰素的表达水平，从而显著降低HBV的复制水平，能有效治疗乙型肝炎；另一方面还会提高肝细胞对外源性干扰素的敏感性，改变“对干扰素治疗无应答的乙型肝炎患者”对外源性干扰素不敏感性的状态，而对干扰素治疗有应答，使得外源性干扰素能有效治疗“对干扰素治疗无应答”的乙型肝炎。本发明提供的IFITM2抑制剂能有效治疗乙型肝炎，并可以使得外源性干扰素能有效治疗“对干扰素治疗无应答”的乙型肝炎，临床应用前景良好。
                         序列表
<110>  四川大学华西医院
<120>  IFITM2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途
<130>  GY026-18P1216
<160>  10
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  IFNA2-F（aitificial）
<400>  1
tctggctgtg aggaaatact tc                                           22
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  IFNA2-R（aitificial）
<400>  2
gagctggcat acgaatcaat g                                            21
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  GAPDH-F（aitificial）
<400>  3
gacctgacct gccgtcta                                                18
<210>  4
<211>  18
<212>  DNA
<213>  GAPDH-R（aitificial）
<400>  4
aggagtgggt gtcgctgt                                                18
<210>  5
<211>  34
<212>  DNA
<213>  70C/A-F（aitificial）
<400>  5
cctcttcatg aacaccgcct gcctgggctt cata                              34
<210>  6
<211>  34
<212>  DNA
<213>  70C/A-R（aitificial）
<400>  6
tatgaagccc aggcaggcgg tgttcatgaa gagg                              34
<210>  7
<211>  34
<212>  DNA
<213>  71C/A-F（aitificial）
<400>  7
cctcttcatg aacacctgcg ccctgggctt cata                              34
<210>  8
<211>  34
<212>  DNA
<213>  71C/A-R（aitificial）
<400>  8
tatgaagccc agggcgcagg tgttcatgaa gagg                              34
<210>  9
<211>  35
<212>  DNA
<213>  70,71CC/AA-F（aitificial）
<400>  9
tcttcatgaa caccgccgcc tgggcttcat agcat                             35
<210>  10
<211>  35
<212>  DNA
<213>  70,71CC/AA-R（aitificial）
<400>  10
atgctatgaa gcccaggcgg cggtgttcat gaaga                             35

Claims (6)

1.IFITM2抑制剂在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途；所述IFITM2抑制剂为降低IFITM2活性/表达量的药物；所述降低IFITM2活性/表达量的药物为2-bromopalmitate，其结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述乙型肝炎为对干扰素治疗无应答的乙型肝炎。
3.一种治疗乙型肝炎的药物，其特征在于：它是以IFITM2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂；所述IFITM2抑制剂为降低IFITM2活性/表达量的药物；所述降低IFITM2活性/表达量的药物为2-bromopalmitate，其结构式如下：
。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述乙型肝炎为对干扰素治疗无应答的乙型肝炎。
5.一种治疗乙型肝炎的联合用药物，其特征在于：它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的IFITM2抑制剂和干扰素，以及药学上可接受的载体；所述IFITM2抑制剂为降低IFITM2活性/表达量的药物；所述降低IFITM2活性/表达量的药物为2-bromopalmitate，其结构式如下：
。
6.根据权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述乙型肝炎为对干扰素治疗无应答的乙型肝炎。
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