CN106619603A

CN106619603A - 芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途

Info

Publication number: CN106619603A
Application number: CN201610773225.XA
Authority: CN
Inventors: 祝之明; 刘道燕; 魏星
Original assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Third Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2017-05-10

Abstract

发明涉及一种芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途。该药物用于纤维化前期的治疗，改善肾脏纤维化进展，且无明显的不良反应，安全、毒副作用小，特别适合纤维化前期患者。

Description

芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途。

背景技术

肾纤维化是所有肾脏疾病发展到终末期肾衰竭的共同变化，所有慢性肾脏疾病最终可发展为肾脏纤维化。其主要发病机制为：肾脏纤维化过程中，细胞变化会激活成纤维细胞及系膜细胞，促使T淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞发生浸润以及小管上皮细胞向系膜质细胞的转变(EMT)。多种浸润细胞和自身细胞相互影响，共同参与肾脏纤维化的形成过程。当肾脏受损后，其组织会发生一系列修复反应，产生大量ECM，而激活产生的ECM效应细胞通常被是肾脏纤维化的核心。ECM持续性沉积通过形成纤维瘢痕，破坏正常肾组织，导致肾实质塌陷、肾功能丧失。分子机制肾主要包括4个阶段:①细胞的活化与损伤，由炎症损伤所致的肾小管上皮细胞的活化及肾间质中单核细胞或巨噬细胞的浸润；②生长因子、细胞因子、趋化黏附因子及血管活性因子等促纤维化因子的释放；③纤维化的形成，主要表现为基质蛋白降解减少、合成增多，肾间质出现沉积；④肾结构和功能受到损伤，此阶段，肾小管周围毛细血管出现堵塞，有效肾单位急剧减少，且肾小球过滤明显降低。

目前，临床上主要通过控制加剧肾功能恶化的危险因素的方法来治疗肾脏纤维化。主要包括：1.TGF-β阻滞剂或拮抗剂：研究表明一种小型富含亮氨酸的蛋白多糖，Decorin(DCN)通过直接阻止TGF-β1生物活性来调整胶原的原纤维生成，显著减少尿蛋白，缓解ECM沉积，有效抑制肾脏纤维化形成。2.血管紧张素转换酶抑制剂与血管紧张素2受体阻滞剂：此类药物可改善肾功能，减轻肾间质纤维化。其机制可能与肾脏组织中TGF-β1信号蛋白Smad2/3活性受到抑制有关。3.酪氨酸激酶特异性受体阻滞剂：PDGF酪氨酸激酶受体阻滞剂AG1295能抑制PDGF酪氨酸激酶受体，减少成纤维细胞及巨噬细胞的数量，降低纤连蛋白的表达，从而阻止肾脏纤维化。4.基因治疗:目前，基因治疗肾脏疾病主要采用反义技术，即连接特异性反义基因与表达载体，导入靶细胞后对反义RNA进行转录，而后者通过与其相应mRNA形成双链来抑制mRNA翻译，从而发挥治疗作用。研究发现TGF-β1反义寡脱氧核苷酸，导入肾间质成纤维细胞，单侧输尿管阻塞的大鼠肾脏纤维化明显改善。克老素(KL)基因表达上调能减轻糖尿病肾肥大，保护肾脏功能，延缓纤维化进程。基因治疗肾脏纤维化前景开阔，但目前尚缺少有效的方法向人体肾脏进行基因转导。5.胶原合成抑制物，抑制赖氨酰氧化酶和脯氨酰4-羟化酶活性及胶原转录后的进程能有效缓解肾脏纤维化。己酮可可碱、己可可碱、γ-干扰素等药物也可降低纤连蛋白的合成及α-SMA表达，抑制胶原合成及肾纤维细胞的增殖，从而阻止肾脏发生纤维化。6.中药治疗：近年来，中药治疗慢性肾脏纤维化的研究越来越受到人们的关注，其中研究最多的为大黄、黄芪、丹参等药。大黄素通过抑制肾脏固有细胞的异常变化及利尿作用来发挥保护肾脏的作用。丹参具有抗氧化、清除自由基的功效，可增加c-myc蛋白表达，抑制肾成纤维细胞增殖，诱导细胞凋亡，改善肾间质纤维化。黄芪甲苷通过使肾小管及间质单核细胞趋恶化因子蛋白I表达下调来缓解肾缺血-再灌注损伤所致大鼠肾脏的长期损害。7.终末期肾病可选择血液、腹膜透析或移植，进而延长患者生命，但终未解决根本问题。患者预后改善并不显著。因此，寻找能有效延缓肾功能不全进展的药物，有效防治肾脏纤维化成为肾内科医生面临的一个重要难题，及早阻止甚至逆转肾纤维化对防治终末期肾衰竭有重大意义。

芹菜素是一种黄酮类化合物，又称芹黄素、洋芹素，广泛分布于温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高，既往研究表明，芹菜素具有多种生物学作用，如降血压、扩张血管、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等。但芹菜素用于治疗肾脏纤维化，国内外文献均未见报道。

发明内容

发明的目的是提供一种芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途。该药物用于纤维化前期的治疗，改善肾脏纤维化进展，且无明显的不良反应，安全、毒副作用小，特别适合纤维化前期患者。

本发明的技术方案是：

芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途。

所述芹菜素通过激活TRPV4通道，增肌细胞内Ca²⁺内流。

所述芹菜素通过TRPV4介导的Ca²⁺内流，激活AMPK/SITR1信号通路，抑制肾脏纤维化。

所述药物的用量为每公斤体重每天150-300mg。

本发明所述芹菜素与药用载体或赋形剂组成用于预防和治疗肾脏纤维化的药物组合物，其中芹菜素为预防和治疗肾脏纤维化的有效剂量。

本发明所述芹菜素(apigenin)的分子式为C15H10O5，其分子量为270.24，化学式为4',5,7-三羟基黄酮(5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one).

其结构式为：

本发明具有以下有益效果：

所以药物的有效成分——芹菜素为植物来源的天然化合物，非人工合成，无明显毒副作用、安全有效。该药物能改善肾脏纤维化，特别适合肾脏纤维化患者和用于治疗肾损害，效果尤其明显。

经实验验证，本发明所述药物用于预防、治疗肾脏纤维化，能延缓肾脏纤维化进程，且无明显的不良反应。

附图说明

图1为肾脏HE染色，膳食芹菜素减轻大鼠肾脏肾小球硬化指数，其中，a，b，c和d分别为普食组，芹菜素组，DOCA(醋酸皮质酮)组和DOCA加芹菜素组示意图，e为统计图；

图2为PAS糖原染色，芹菜素膳食减少肾脏胶原纤维，其中，a，b，c，d和e分别所示为普食组，芹菜素组，DOCA(醋酸皮质酮)组和DOCA加芹菜素组；

图3为Masson染色，膳食芹菜素减少肾脏纤维化产生，其中，a，b，c，d和e分别所示为普食组，芹菜素组，DOCA(醋酸皮质酮)组和DOCA加芹菜素组；

图4为膳食芹菜素改善DOCA所致肾脏形态增大，其中，a，b，c，d和e分别所示为普食组，芹菜素组，DOCA(醋酸皮质酮)组和DOCA加芹菜素组；

图5为膳食芹菜素减少DOCA所致肾脏重量及肾脏/体重比值增大。a为肾脏重量，b为肾脏重量比体重；

图6为膳食芹菜素降低DOCA所致的尿蛋白增加，增加肌酐清除率，其中，a为肌酐清除率，b为尿微量白蛋白；

图7为免疫荧光染色，TRPV4可以定位于大鼠肾小球；

图8为PTI钙荧光比率测定，芹菜素可以增加细胞Ca²⁺内流的，其中a为荧光比率示意图，b为统计图；

图9为膜片钳单通道检测，芹菜素激活HBZY-1肾小球系膜细胞上表达的特异性TRPV4通道，其中，a为电压依赖示意图，b为TRPV4通道电导图；

图10为蛋白免疫印迹，醛固酮加高盐刺激能使SIRT1和p-AMPK表达下降，芹菜素能逆转这一效应，其中，a为蛋白免疫印迹示意图，b为SIRT1统计图，c为p-AMPK统计图；

图11为蛋白免疫印迹，芹菜素使SIRT1和p-AMPK表达增加，而EDTA可以抑制芹菜素这一效应，说明芹菜素该效应主要是通过TRPV4介导的Ca²⁺内流起作用，其中，a为蛋白免疫印迹示意图，b为p-AMPK统计图，c为SIRT1统计图；

图12为蛋白免疫印迹，芹菜素抑制肾脏纤维化进程能够被EX-527(SIRT1特异性抑制剂)逆转，提示明芹菜素通过TRPV4介导的Ca²⁺内流可以激活AMPK/SITR1信号通路。其中，a为蛋白免疫印迹示意图，b为TRPV4统计图，c为p-AMPK统计图，d为SIRT1统计图；

图13芹菜素抑制肾脏纤维化进程的机制图。

具体实施方式

主要仪器和试剂

1.大鼠，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心；

2.芹菜素(98％纯度，杭州天草科技有限公司，中国)

3.醋酸脱氧皮质酮(Sigma公司，美国)

4.乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司)；

5.盐酸(重庆川江化学试剂厂)

6.甲醛(成都科龙化工试剂厂)

7.harris苏木素染液(北京中杉生物技术公司)

8.碳酸锂(生工生物工程有限公司)

9.盐酸(重庆川江化学试剂厂)

10.二甲苯(成都科龙化工试剂厂)

11.水性伊红染液(北京中杉生物技术公司)

12.中性树胶(中国上海标本模型厂)

13.去离子水过滤器(Millipore，德国)

14.倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)

15.冰冻切片机(Leica公司，德国)

16.电子天平(CAV31020，美国)

17.比率荧光成像系统(PTI104B，PTI公司，美国)

28.HEKA EPC-10膜片钳系统(HEKA公司，德国)

本发明的整个机制如图13所示。

实施例1DOCA-盐致肾脏纤维化动物模型

1.DOCA-盐致肾脏纤维化动物模型：

健康雄性2月龄SD大鼠24只(由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供)，体重250g～300g，鼠分笼喂养，自由进食饮水。自然昼夜采光，室温18℃-26℃，每日早晚喂食，隔日换水。湿度50％左右。手术前适应性饲养1周，然后行左侧肾脏摘除术。大鼠称重后腹腔注射10％的乌拉坦溶液麻醉(1m1/kg)，然后背部术区剪毛，俯卧位固定于手术板上，严格消毒后于脊柱左侧、第十二肋下缘作一长约2cm的切口，分离肌肉，游离肾包膜，暴露左肾，紧贴肾门处结扎肾动、静脉，切除左侧肾脏，清除淤血后缝合肌肉层和皮肤。

2.术后给予青霉素钠腹腔注射3天，1周后将大鼠随机分成4组：第一组为对照组(Cont组，n＝6)，皮下注射植物油，饲饮自来水；第二组为芹菜素组(Api组，n＝6)，皮下注射植物油，饲饮自来水，喂食含0.2％芹菜素的饲料；第三组为DOCA组(n＝6)，每周皮下注射DOCA油剂(11-去氧皮质酮三甲基醋酸)(40mg/kg)一次，饲饮水含有10g/L的NaC1和2g/L的KC1；第四组为DOCA+芹菜素组(DOCA+Api组，n＝6)，每周皮下注射DOCA油剂(40mg/kg)一次，饲饮水含有10g/L的NaC1和2g/L的KC1，喂食含0.2％芹菜素的饲料。术后干预时间4周，期间每周测一次体重。

按照分组情况，分别配制普通饲料和芹菜素饲料。饲料配方如下：普通饲料，脂肪10％，蛋白质22％，碳水化合物68％。饲料中各成分所占比例(％)

普辣饲料中芹菜素的添加方法为每100g普通饲料中加入0.2g的芹菜素。

实施例2动物实验

1.体重的测定：普通称量法。

2.尿白蛋白和肌酐测定，其结果如图6所示。

2.1 24小时尿标本的采集

饮食干预结束后，清晨将大鼠置于代谢笼中，分笼喂养，每笼1只，禁食，自由饮水。自然昼夜采光，室温18℃-26℃，湿度50％左右。专人添加饲料，每日定时用天平称取饲料重量，计算每日每只大鼠进食量。收集24小时尿量，4000r/min，常温下离心10min后，-70℃冰箱保存备用。

2.2试剂配制、使用方法和保存

Alb.标准品：各标准品分别准确加入0.5ml缓冲液溶解，溶解15分钟后摇匀。溶解后其浓度分别为1、2、5、10、20、50μg/ml。保存于4℃冰箱。¹²⁵I-Alb.：将全部样品用10ml缓冲液溶解，保存于4℃冰箱。兔抗-ALB.抗体：用缓冲液溶解，保存于4℃冰箱。

2.3取圆底聚苯乙烯试管若干，用记号笔编号NSB、S1-S6和待测样品管等，然后用微量取样器加样。充分摇匀后，室温放置15分钟，3500转/分钟离心15分钟，吸弃上清，测各沉淀管的放射性计数(cpm)

3.肾脏重量的测量和肾脏/体重比值的计算，其结果如图5所示。

饮食干预结束后，动物禁食12小时。将动物称重，10％乌拉坦溶液液(0.1ml/10g小鼠体重)腹腔注射麻醉，处死大鼠并取材。大鼠处死后滤干水分后肾脏称重。

肾脏/体重比值＝KW(g)/BW(g)×100％；KW为肾脏重量，BW为体重。

4.组织切片染色，其结果如图1，图2，图3和图4所示。

4.1石蜡切片

4.1.1已取材的肾脏用滤纸片吸干水分。

4.1.2取出组织支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂，速放于冷冻台上，-20℃冰冻1小时。

4.1.3将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

4.1.4调好厚度至10um，调好防卷板。

4.1.5切片。

4.1.6固定标本1小时。

4.2HE染色

4.2.1切片苏木精染色10min，自来水冲洗，3次。

4.2.21％盐酸酒精分化，自来水冲洗，3次。

4.2.3稀碳酸锂水溶液中促蓝，自来水冲洗，3次。

4.2.4伊红5min。

4.2.5入80％乙醇1次，数秒。

4.2.6入95％乙醇一次，数秒。

4.2.7入无水乙醇三次，每次1min。

4.2.8入二甲苯两次，每次5min。

4.2.9晾干，中性树胶封片。

4.3肾小球硬化指数(Glomerulosclerosis index，GSI)

肾小球硬化指数(GSI)采用半定量计分法评估，放大倍数为200。每个肾取20个视野进行检查，评分标准为：没有变化，被评为0分；病变涉及25％肾小球，被评为1分；病变涉及25％至50％肾小球，评为2分；病变涉及50％以上肾小球，评为3分。每个动物的肾小球硬化指数为平均每个视野的平均得分。所有评分有2位实验者独立检测。

4.4糖原(PAS)染色

4.4.1石蜡切片脱蜡至水(细胞涂片，冰冻切片直接水洗)

4.4.2蒸馏水洗

4.4.3过碘酸酒清夜10min

4.4.4自来水冲洗10min

4.4.5Schiff氏液10min

4.4.6流水冲洗5min

4.4.7用哈瑞苏木精或迈耶苏木精染核3min(细胞核染色过深可用盐酸酒精分化)

4.4.8流水冲洗5min

4.4.9常规脱水、透明、封固

4.5Masson染色

4.5.1组织固定,切片,脱蜡至水.

4.5.2Masson复合染色液5分钟.

4.5.3 0.2％醋酸水溶液稍洗.

4.5.4 5％磷钼酸5～10分钟.

4.5.5 0.2％醋酸水溶液浸洗2次.

4.5.6亮绿染色液5分钟,0.2％醋酸水溶液洗2次.

4.5.7无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片.

5.免疫荧光染色，其结果如图7所示。

5.1将肾脏组织埋于冰冻包埋剂。

5.2冰冻切片机将组织切成厚度为4-6μm，并将其吸附于盖玻片上。

5.3将组织浸泡在10％中性甲醛溶液(甲醛用0.1M PBS溶液稀释10倍)中，固定40-60min。

5.4在双氧水甲醇溶液(双氧水：甲醇＝1：50)中浸泡30min，以去除组织内源性过氧化物。

5.5蒸馏水清洗2遍后，用5％牛血清封闭20min。

5.6加1：200稀释的兔抗小鼠TRPV4抗体，室温2h或4℃过夜。PBS洗3次，每次5min。

5.7加1：200稀释的TRITC标记二抗(抗兔)，室温避光染30min。PBS洗3次，每次5min。

5.8在TE2000-U倒置荧光显微镜下观察，结合NIS-Elements成像软件照相和分析。

实施例3分子实验

1.蛋白免疫印迹，其结果如图10，图11和图12所示。

1.1组织和细胞总蛋白提取方法

1.1.1取100mg组织加入适量预冷的RIPA裂解液(蛋白质匀浆缓冲液1ml加PMSF50ug，Leuptin 5ug)，匀浆机匀浆，收集匀浆液于1.5ml的离心管中；如为细胞样品，则将适量裂解液直接加入到培养瓶或六孔板中，用细胞刮刀收集细胞。

1.1.2-20℃放置20min以沉淀蛋白。

1.1.3 4℃12000rpm离心20min，收集上清液即组织蛋白，用于蛋白定量及免疫印迹实验，或者于-70℃冻存备用。

1.1.4蛋白定量方法(Bradford法)

1.1.5蛋白标准液的配制：用双蒸水配制1mg/ml的牛血清白蛋白作为浓缩标准液，按下表加样制作标准曲线。

管号	1	2	3	4	5
						浓缩标准液ul	0	5	10	20	80
H20ul	80	75	70	60	0
						蛋白定量试剂ml	3	3	3	3	3

1.1.6上述试剂加完后，混匀，室温静置3min，以空白管调零，用Beckman DU-640分光光度计在595nmol/L处读取各管的吸光光度值。

1.1.7在干净试管中加入1ml蛋白定量试剂，准确吸取2ul待测蛋白样品或蒸馏水(空白对照)加入试管中(即1:500稀释)，混匀后比色，记录各样品的浓度。

1.1.8取500ug样品于干净EP管中，用蛋白加样缓冲液定容至200ul，混匀，置于沸水中变性6分钟。4℃保存，Western blot上样备用。

1.2蛋白免疫印迹操作步骤

1.2.1灌制聚丙烯凝胶：先灌下层的分离胶(检测不同分子量的蛋白，分离胶浓度不同)，再灌上层的4％浓缩胶，然后上样，每孔上样量为50ug，每个样本至少上二块平行胶；

1.2.2蛋白电泳：电泳电压浓缩胶为90V，分离胶为140V，电泳液为甘氨酸缓冲液；

1.2.3转膜：电泳结束后，将凝胶与大小相同的PVDF膜(事先用95％乙醇固定)置于上下各三层滤纸中间，置入转移槽，加满转移液，4℃95mA电泳转膜14h左右；

1.2.4封闭：取出PVDF膜，自然晾干后，置于95％乙醇中固定；0.01mol/L PBST洗15min×3次；5％脱脂奶粉中封闭非特异性蛋白，37℃摇床中封闭约4h；

1.2.5抗原抗体反应：分别加一抗和内参照β-actin抗体(用PBST稀释成1：1000的浓度)，37℃摇床中结合3～4h或置于4℃过夜，PBST洗15min×3次；加IgG二抗(用PBST稀释成1：1000)，37℃摇床中结合1～2h，PBST洗15min×3次；

1.2.6显影：将PVDF膜置于化学发光试剂中反应1～3min；在暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影；

1.2.7定量：凝胶成像系统扫描分析条带光密度值(OD值)。计算每个蛋白条带光密度值与内参照β-actin光密度值的比值，代表各样品的蛋白表达水平。

2.细胞内钙离子的测定,其结果如图8所示。

2.1接种在六孔板内2×2cm玻片上的HBZY-1肾小球系膜细胞，测定前去除培养基，用PSS洗两次；每孔加入1ml含4umol/LFura-2/AM和0.02％Pluronic F-127的PSS，于37℃孵箱中避光孵育40min，用PSS洗两次，去除细胞外残余的Fura-2/AM；将负载了Fura-2/AM的细胞玻片置于荧光显微镜下(PTI104B)，钙荧光的激发波长为340nm/380nm，发射波长为510nm；荧光信号经Felix专用软件处理，以细胞内游离钙荧光强度F(340nm/510nm)与结合钙荧光强度F380nm/510nm之比反映细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]i)的变化，该比值(以F340nm/380nm表示)升高表明[Ca²⁺]i升高。总记录时间为300s-600s，系统每秒钟采集数据1次。

2.2先测定基础状态下HBZY-1细胞F 340nm/380nm，若曲线平稳则说明[Ca²⁺]i基线稳定，在50s后加不同浓度辣椒素刺激，记录细胞F 340nm/380nm的变化，计算F340nm/380nm曲线的瞬时升高幅度，即(瞬时最高值-基础值)/基础值×100％，每种浓度的辣椒素刺激重复3-6次。

3.膜片钳记录TRPV4通道，其结果如图9所示。

3.1电极内外液的配制

K gluconate 140,KCl 2.5,MgCl₂ 1,HEPES 5,EGTA 1.5,使用KOH溶液将pH调至7.4，电极液和细胞外液一致。

3.2电极的制备

根据实验的目的而设置电极拉制仪的参数，通常情况下，电极分两步拉制，第一次粗拉制使玻璃管中间拉成一细窄的管状，第二次将窄细部位拉断成两根，其尖端直径一般为1-5μm，在显微镜下观察时其尖端应光滑而不呈断裂状，并用抛光仪对电极进行抛光，电极必须保持清洁，在实验当日拉制，避免电极尖端有灰尘进入，充入电极内液时电极的电阻在5-10M。

3.3电流的记录

我们应用HEKA EPC-10膜片钳系统，采用细胞粘附式膜片钳技术记录被检测的通道活性，用Clampfit10.0分析所得数据。当电极尖端轻轻压在细胞膜的表面后，用连接在电极把持器上的注射器轻轻地回吸，而使电极与细胞膜密切接触形成千兆欧姆封接。该方法是在细胞内成分保持不变的情况下研究离子通道的活动，进行单通道电流的记录。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的实质性技术内容范围，本发明的实质性技术内容是广义的定义于申请的权利要求范围中，他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：芹菜素通过激活TRPV4通道，增肌细胞内Ca² ⁺内流。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：芹菜素通过TRPV4介导的Ca2+内流，激活AMPK/SITR1信号通路，抑制肾脏纤维化。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物的用量为每公斤体重每天150‐300mg。

5.用于预防和治疗肾脏纤维化的药物组合物，包括治疗肾脏纤维化的有效量的芹菜素和药用载体或赋形剂。