CN1897932A - 含有芹菜素作为软骨再生剂用于治疗骨关节炎的组合物 - Google Patents

含有芹菜素作为软骨再生剂用于治疗骨关节炎的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1897932A
CN1897932A CNA200480030411XA CN200480030411A CN1897932A CN 1897932 A CN1897932 A CN 1897932A CN A200480030411X A CNA200480030411X A CN A200480030411XA CN 200480030411 A CN200480030411 A CN 200480030411A CN 1897932 A CN1897932 A CN 1897932A
Authority
CN
China
Prior art keywords
apigenin
osteoarthritis
cartilage
therapeutic agent
synovial fluid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA200480030411XA
Other languages
English (en)
Inventor
朴昌信
姜柱惠
金京美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yuhan Corp
Original Assignee
Huang Chengwan
KMSI Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huang Chengwan, KMSI Co Ltd filed Critical Huang Chengwan
Publication of CN1897932A publication Critical patent/CN1897932A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了芹菜素作为软骨再生剂的新用途，所述芹菜素具有降低升高含量的软骨破坏标志物，改进滑液细胞状况，并使软骨再生的作用，其中所述软骨破坏标志物包括总的滑液体积和滑液内的蛋白多糖，总的蛋白质和前列腺素作用。此外，本发明公开了用于骨关节炎的治疗剂，其包括芹菜素作为再生关节软骨的试剂，和使用该治疗剂治疗骨关节炎的方法。

Description

含有芹菜素作为软骨再生剂用于治疗骨关节炎的组合物
技术领域
本发明涉及芹菜素(apigenin)作为软骨再生剂的新用途，所述芹菜素具有降低升高含量的软骨破坏标志物(marker)，改进滑液细胞状况，并使软骨再生的作用，其中所述软骨破坏标志物包括总的滑液体积和滑液内的蛋白多糖，总的蛋白质和前列腺素，。此外，本发明涉及用于骨关节炎的治疗剂，其包括芹菜素作为再生关节软骨的制剂，和使用该治疗剂治疗骨关节炎的方法。
背景技术
关节炎是一种常见病，它可影响任何年龄段的任何人，且随着年龄增加其发病率增加。在韩国，占总人口约20％的人患有关节炎。有多于100种的不同类型的关节炎，并且骨关节炎是所有关节炎疾病中最常见的一类。
骨关节炎牵涉在关节内软骨的退化。覆盖关节内骨头的软骨随着时间的流逝开始破损并可完全磨损掉，并且骨头相互摩擦，从而引起疼痛。由于关节内的疼痛，因此周围肌肉较少使用，和因此肌肉强度受到削弱。在过去被称为变性关节炎的骨关节炎是一种经常出现的关节疾病，这种疾病在关节的异常或损坏之后或者在没有关节损坏的情况下发生。
骨关节炎的流行在男女中是类似的。然而，在女性中，较多数量的人关节会受到影响，而男性的髋关节病发病频率较高。骨关节炎的风险因素包括年龄、肥胖、髋部的先天性发育不良、创伤、关节炎病史、特殊工种和遗传。骨关节炎本身不会大大地影响人们的寿命，但持续长时间段的慢性骨关节炎引起疼痛和关节变形，并因此降低生活质量。特别地，在膝盖内的骨关节炎被认为是慢性残疾的主要原因。最近，许多研究成功地开发了各种药物和治疗方法，这些能减轻因骨关节炎导致的疼痛和关节变形。
在骨关节炎中，关节内的软骨受到损坏并被磨损掉。这使得在软骨下的骨头相互摩擦。随着时间流逝，骨头受到损坏，且还可能变形，从而引起疼痛和其它数种症状。在骨关节炎的病因学和病理学方面，两个因素可能是重要的：一个是在关节上施加额外应力并因此损坏关节内组织的过大重量，其中关节中软骨或骨头的状况正常；和另一个是在正常负载下关节内软骨或骨头虚弱。此外，骨关节炎在约50％超过60岁的人群中和在约70％超过65岁的老年人中出现。因此，最重要的风险因素可能是年龄。
骨关节炎主要在膝盖、髋部、脊柱和手指内的关节中发病。主要症状包括疼痛和关节变形，和被感染的关节出现水肿、潮热和关节的异常增大。
最近，已开发了各种药物和治疗方法并用于治疗骨关节炎。治疗的主要目的是减轻疼痛，维持关节的功能并防止因关节的功能性病变导致残疾。
由于骨关节炎在早期仅仅表现出疼痛，因此治疗方法集中在通过施用简单的止痛药来减轻疼痛。当骨关节炎随着长期疼痛发展时，使用具有强消炎作用的消炎剂。然而，一旦长期施用，这些消炎剂负面影响胃、肝脏和肾脏并且还抑制软骨细胞再生的能力。由于这些副作用，应当谨慎使用消炎剂。
具体地，使用如氢化可的松和倍他米松的皮质甾类消炎物质治疗骨关节炎，它们起到抑制前列腺素合成的作用。然而，一旦口服施用，这些类固醇激素可具有暂时的治疗作用，但由于它们严重的副作用，应当谨慎使用，并且基本上不通过口服施用而是通过关节内注射给药。
治疗关节炎的最常用的方法是给药。迄今为止，已开发了具有止痛和消炎作用的许多药物，包括例如双氯酚酸钠、阿司匹林和布洛芬的非类固醇类消炎药(NSAIDs)。
然而，常用于治疗关节炎的NSAIDs，通过同时抑制环氧合酶1(COX-1)和环氧合酶2(COX-2)而有损坏胃肠道，特别是胃的副作用，其中环氧合酶1(COX-1)起到保护胃壁的作用，环氧合酶2(COX-2)引起疼痛和炎症。另外，当用于长期给药时，NSAIDs引起在胃或肠内酸痛或溃疡，最终导致穿孔。所形成的溃疡可阻止胃的排空，从而引起呕吐和体重损失，以及胃和十二指肠出血。除了NSAIDs以外，还开发了不同类的治疗剂治疗关节炎，例如不能抑制COX-1的COX-2抑制剂，其具有优良的止痛作用并且相对于引起形成溃疡和出血具有温和的副作用。
另一方面，骨关节炎是一种因年龄引起的最常见的现象，在过去它的治疗仅仅集中在减轻疼痛和炎症上，没有根本的治疗方法。最近，基于减少软骨细胞破坏的与延迟或抑制关节炎发展有关的研究具有良好的结果。
例如，美国专利No.6,610,750公开了一种通过使用大黄酸及其酯衍生物，双醋瑞因，延迟关节软骨的破坏进展，从而治疗骨关节炎的方法。
美国专利No.5,591,740公开了通过使用从多孔海绵(marine sponge Hymeniacidon)中分离的debromohymenialdisine，减慢关节恶化和软骨退化，从而治疗骨关节炎的方法。
另外，基于蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，例如金雀异黄素(genistein)、核比霉素A(herbimycin A)、4，5-二苯胺基邻苯二甲酰亚胺、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG82和酪氨酸磷酸化抑制剂AG556，可减慢白介素-1-诱导的软骨退化的发现，美国专利No.6,552,066公开了使用蛋白质酪氨酸激酶抑制剂治疗骨关节炎的方法。
此外，对应于日本专利公开No.07-025761)的美国专利No.5,650,433公开了一种软骨保护剂，其含有类黄酮化合物，其糖苷或其立体异构体，对作为软骨基质的主要组分的蛋白多糖的消耗具有抑制作用，和通过施用软骨保护剂，减少软骨的破坏，从而治疗关节病的方法。
然而，前述专利中公开的方法和使用迄今为止已知的药物治疗骨关节炎的其它方法都是延迟或抑制软骨破坏的进展，但都不包括具有软骨再生作用，并因此能恢复受损软骨的治疗剂。
最近，为了避免与采用具有副作用的药物治疗骨关节炎从而保护软骨相关的难点，尝试不使用药物的方法。例如，尝试使用间充质干细胞使软骨组织再生(EP早期公开No.0989855A1和美国专利申请早期公开No.20020110544A1)。
迄今为止，在骨关节炎的治疗中，仅仅使用提供消炎和止痛作用或者延迟或抑制软骨破坏的治疗方法以减慢骨关节炎的临床进展。因此，需要开发一种新型方法治疗因软骨退化引起的骨关节炎，所述方法能使软骨组织再生或者改进软骨组织的状况。
这一需求受到下述事实的影响：软骨组织由约95％水和胞外软骨基质和仅仅5％的软骨细胞组成，并且软骨细胞在体内具有最长的细胞周期，因此非常难以增殖(骨关节炎和神经原性关节病，第487和492页，Merck Manual，英文第17版/韩国第1版，2003)。因此，可通过寻找能促进软骨再生且在体内试验中没有副作用的物质，使用增殖诱导剂使从骨关节炎患者中分离的软骨细胞增殖，并将增殖的软骨细胞植入到患者体内，从而实现医学领域的重大进展。
本发明人发现自然存在的类黄酮化合物，芹菜素，具有作为促进软骨细胞增殖并因此使软骨组织再生的新用途，以及具有延迟软骨细胞破坏的已知作用，从而导致完成本发明。
发明公开
第一方面，本发明提供使软骨再生的组合物，它包括芹菜素和药学上可接受的载体，其中芹菜素的用量有效地促进软骨细胞增殖且没有细胞毒性。
在所述的第一方面，根据本发明使软骨再生的组合物包括芹菜素，其含量使患者的关节软骨和滑液内达到0.1μM-100μM的浓度。在这一剂量范围内，芹菜素具有降低骨关节炎的指示剂或标志物的生化作用：升高的关节滑液体积和在滑液内升高含量的蛋白多糖，总蛋白质和前列腺素，且通过改进滑液细胞状况具有改进关节软骨的额外作用。
优选地，施用有效量的包含在本发明中使软骨再生的组合物内的芹菜素，使其含量导致在患者的关节软骨和滑液内有1μM-80μM的浓度。
第二方面，本发明提供使软骨再生的用于骨关节炎的治疗剂，其包括根据所述第一方面的使软骨再生的组合物和药学上可接受的赋形剂。
在所述的第二方面中，用于骨关节炎的治疗剂为可口服给药的制剂形式，例如溶液、胶囊、颗粒、片剂或丸剂；局部可施涂的制剂，例如药膏或经皮给药的制剂；或注射剂。
当根据本发明的用于骨关节炎的治疗剂为口服制剂形式时，芹菜素每日给药剂量为10mg-1000mg。
当根据本发明的用于骨关节炎的治疗剂为药膏配方时，芹菜素每日给药剂量为1mg-100mg。
当根据本发明的用于骨关节炎的治疗剂为可注射配方时，芹菜素每日给药剂量为0.1mg-10mg。
第三方面，本发明提供通过使关节软骨再生治疗骨关节炎的方法，该方法包括给骨关节炎患者施用用于骨关节炎的治疗剂，所述用于骨关节炎的治疗剂包括所述第一方面使软骨再生的组合物和药学上可接受的赋形剂。
附图简述
根据下述详细说明，并结合附图，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的，特征和其它优点，其中：
图1图示了骨关节炎诱导的兔子的软骨，其中对照组(A)用生理盐水治疗，和试验组(B)用本发明的芹菜素治疗；
图2是显示在骨关节炎诱导的兔子中，根据本发明通过芹菜素给药时总的滑液体积的变化的图表(正常：在正常兔子中总滑液体积；OA：在骨关节炎诱导之后立即测量的总滑液体积；+：在用芹菜素或生理盐水治疗的右腿内的结果；-：在未治疗的左腿内的结果)；
图3是显示在骨关节炎诱导的兔子中，根据本发明通过芹菜素给药时在关节滑液内总的蛋白多糖含量的变化的图表(正常：在正常兔子中在关节滑液内总的蛋白多糖含量；OA：在骨关节炎诱导之后立即测量的在关节滑液内总的蛋白多糖含量；+和-：与图2中的含义相同)；
图4是显示在骨关节炎诱导的兔子中，根据本发明通过芹菜素给药时在关节滑液内总的蛋白质含量的变化的图表(正常：在正常兔子中在关节滑液内总的蛋白质含量；OA：在骨关节炎诱导之后立即测量的在关节滑液内总的蛋白质含量；+和-：与图2中的含义相同)；
图5是显示在骨关节炎诱导的兔子中，通过芹菜素给药时在关节滑液内总的前列腺素E2(PGE2)含量的变化的图表(正常：在正常兔子中在关节滑液内总的PGE2含量；OA：在骨关节炎诱导之后立即测量的在关节滑液内总的PGE2含量；+和-：与图2中的含义相同)；
图6是显示在骨关节炎诱导的兔子中，通过芹菜素给药时在关节滑液内的胶原蛋白含量的变化的图表(正常：在正常兔子中在关节滑液内总的胶原蛋白含量；OA：在骨关节炎诱导之后立即测量的在关节滑液内总的胶原蛋白含量；+和-：与图2中的含义相同)；
图7是显示在骨关节炎诱导的兔子中，通过芹菜素给药时Mankin分数变化的图表(+和-：与图2中的含义相同)；
图8A和8B图示了采用芹菜素(图8A)和生理盐水(图8B)给药的骨关节炎诱导的兔子的关节内软骨染色的结果(H&E：用苏木精和曙红染色的治疗组；Saf-O：用沙黄O染色的治疗组)；
图9图示了用芹菜素(A)和生理盐水(B)给药的骨关节炎诱导的兔子的关节内滑液膜的染色结果；
图10是显示通过芹菜素给药的骨关节炎诱导的兔子中滑液膜衬细胞数量变化的图表；
图11示出了在LPS诱导的发炎过程中，根据本发明通过芹菜素给药时，从小鼠中得到的巨噬细胞衬内iNOS、COX-2和IκBα的表达水平变化的Western印迹的结果，其中β-肌动蛋白用作内部标志物；
图12是显示根据本发明通过芹菜素给药时，检测从小鼠中得到的巨噬细胞衬RAW264.7内转录因子NFκB和特异基因之间结合的EMSA(电泳迁移率变动分析)的图表；和
图13图示了根据时间诱导骨关节炎并收集滑液的过程。
实施本发明的最佳方式
本发明提供用于治疗骨关节炎的芹菜素的新用途，这是基于芹菜素能延迟软骨细胞的破坏并通过刺激软骨细胞增殖使软骨再生的作用。
已知芹菜素具有抗癌作用，例如具有细胞毒性和细胞增殖抑制活性。与芹菜素的这些已知作用相反，本发明人发现芹菜素通过刺激软骨细胞增殖，具有使软骨再生的作用，同时在特定浓度范围内的有效剂量下没有细胞毒性。也就是说，发现芹菜素的软骨再生作用作用与施加到靶向位点上的精确剂量和最终用量直接相关。具体地，当以导致在关节软骨和滑液内0.1-100μM，和优选1-80μM的浓度的量使用芹菜素时，当对关节炎诱导的动物模型进行组织学检查时，发现芹菜素具有使关节软骨再生的总作用，所述总作用包括在细胞试验中抑制与炎症有关的酶的活性和抑制产生疼痛诱导剂的作用，在使用关节炎诱导的动物模型中的试验中减少关节滑液和滑液内蛋白多糖，总的蛋白质和前列腺素含量的生化作用，和使软骨再生并改进滑液细胞的状况的作用。这些结果表明芹菜素具有作为使关节软骨再生的试剂的优良活性。基于这一发现，本发明提供芹菜素作为预防或抑制骨关节炎的试剂，以及作为改进或治疗骨关节炎的试剂的新用途。
下文将更详细地描述本发明。
骨关节炎是一种退化的关节疾病，它是最古老和最常见类型的关节炎，并且以关节软骨的破坏为特征。骨关节炎是老龄的必然结果，并且肥胖可导致膝盖关节内骨关节炎。若通过诸如运动或工作之类的活动反复使用关节或者因事故使关节受伤的话，则形成骨关节炎的风险可增加。此外，在膝盖骨关节炎中，当在一个膝盖中出现骨关节炎时，患者更加依赖于另一个膝盖以避免疼痛，从而增加在另一膝盖内进一步形成骨关节炎的几率。因此，在两个膝盖均有骨关节炎的患者中，改善一个膝盖中骨关节炎可减少施加到另一膝盖上的重量，从而降低了在另一膝盖内骨关节炎状况恶化的风险，从而获得减轻以前已经形成的骨关节炎的积极作用。
由于骨关节炎具有不同于风湿性关节炎的病因，风湿性关节炎是因炎症引起的自身免疫疾病，在风湿性关节炎中有效的物质在骨关节炎中是无效的(Ziolkowska等人，TheJournal of Immunology，164：2832-2838(2000))，且可恶化软骨损伤的损害程度。由于这一原因，不能预期对风湿性关节炎有效的物质对骨关节炎具有治疗作用，并且它们对软骨再生的作用更加难以预测。
在引起骨关节炎的软骨破坏的过程中，可部分地诱导炎症并导致释放与炎症有关的酶，从而加速软骨的退变。在骨关节炎的进展过程中，滑液体积随着炎症加重而增加。这一现象涉及由于软骨受到破坏导致蛋白多糖释放到滑液内。因此，降低滑液内蛋白多糖的水平是骨关节炎改善的重要指示剂。
另外，当诱导骨关节炎时，随着关节的炎症加重疼痛增加。这种增加的疼痛是由于前列腺素E2的升高的浓度导致的，前列腺素E2的升高的浓度是与增加的疼痛有关的重要因素。因此，降低滑液内的前列腺素E2的浓度从而改善骨关节炎也是重要的。
随着骨关节炎的进展，在关节滑液内滑液膜衬细胞的数量增加，和滑液的衬里层表面不光滑且变厚(Asari，A.等人，Arch.Histol.Cytol.61(2)：125-35(1998))。
此外，已知胶原蛋白与关节炎的发病率有关。特别地，胶原蛋白是含关节软骨的材料，且它的过量产生促进软骨硬化且与关节炎的发病率有关。因此，比正常水平高的胶原蛋白含量用作骨关节炎发病率的指示剂。此外，这种增加的胶原蛋白水平的下降可用作骨关节炎改善的指示剂。
因此，在骨关节炎的治疗中非常重要的是降低这些组织的生化标志物，且这种下降是受损组织改善的间接证据。
典型地，在炎症位点处生成过量的NO并刺激细胞组织的坏死(Moncada，S.等人，Pharmacol.Rev.43：109-142(1991))。因此，在许多炎症疾病的治疗中，重要的是抑制造成NO生成的iNOS(可诱导型一氧化氮合成酶)的活性或表达。iNOS在短时间内产生过量NO防御身体遭受外部刺激，但在如关节炎的疾病中，过量产生NO引起坏死和继发性的副作用，例如疼痛。因此，抑制iNOS的过度表达对于治疗骨关节炎来说是重要的。
环氧合酶2(COX-2)是一种酶，它合成疼痛诱导剂，前列腺素。通过NO或其它刺激剂刺激前列腺素的合成。因此，抑制COX-2的表达或活性也是治疗骨关节炎的重要指示剂。
另外，NFκB是通过相关的信号路径被激活并起始前述iNOS和COX-2的基因表达的转录因子。NFκB以失活形式结合到抑制因子IκBα上而被螯合在细胞质中。当受到如炎症的外部刺激时，IκBα抑制因子磷酸化并降解。这使得NFκB转运到其中它起始iNOS基因转录的细胞核上。因此，抑制存在于细胞质内的IκBα的磷酸化或降解是评价治疗骨关节炎的重要指示剂。
如上所述，由于NFκB在细胞质内以失活形式螯合，且一旦受到如炎症的外部刺激时，进入细胞核内，并起始iNOS和COX-2的基因转录，因此，抑制NFκB进入细胞核内并结合到靶基因的转录调控元件上是评价在患有骨关节炎的患者中骨关节炎改善的重要指示剂。
衍生于植物的天然存在的类黄酮化合物是酚类化合物，根据其结构可分成四组：黄酮醇类，黄烷酮类，黄烷醇类和黄烷类。已知类黄酮以各种形式存在于植物、水果、茶叶、中草药和类似物中，且在体内具有各种作用，其中包括抗病毒活性(例如，Kaul，T.N.等人，J.Med.Virol.15：71-79(1985))，抗癌活性(例如，Miller，A.B.等人，Rev.Oncol.3：87-95(1990))，消炎活性(例如，Ferrandiz，M.L.等人，J.Natl.CancerInst.85：1038-1049(1993))，和抗氧剂活性(例如，Cao，G.等人，FreeRadi.Biol.Med.，22：749-760(1997))。
类黄酮之一的芹菜素(4’，5，7-三羟基黄酮)的分子量为270.24，具有下述化学结构，且是在大量的植物和水果中发现的天然存在的化合物，包括欧芹(含有大于0.05％的芹菜素)和百里香(含有大于0.05％的芹菜素)。已知芹菜素具有各种生物活性，包括消炎、血管扩张(vasordilatory)、抗氧化、抗病毒和抗癌作用。
Figure A20048003041100101
关于其抗癌活性，芹菜素甚至在非常低浓度，例如低于约50μM下有效地起作用。在细胞增殖和血管生成过程中，芹菜素通过引起细胞凋亡和坏死机理显示出抗增殖和细胞毒性作用，从而导致抑制癌细胞的增殖，其中细胞增殖和血管生成是各种癌细胞的主要特征，其中包括前列腺癌、乳癌、肺癌、直肠癌、血癌(白血病)、皮肤癌、甲状腺癌和肝癌。
另外，芹菜素具有细胞毒性和增殖抑制作用作用，例如在非肿瘤细胞如鼠的胚胎成纤维细胞以及癌细胞内累积肿瘤抑制因子蛋白质p53，并诱导细胞凋亡，且还对人类正常的前列腺上皮细胞具有轻微的增殖抑制作用(Plaumann B.等人，Oncogene13(8)，1605-14(1996)和Gupta，S.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.287(4)：914-920)。
然而，根据最近的研究报道，芹菜素在其中用各种浓度的芹菜素治疗肺癌和直肠癌细胞系的体外试验中显示出优良的效率，但在体内几乎没有作用(Engelmann，C.等人，Phytomedicine 9(6)：489-495(2002))。特别地，基于其增殖抑制活性的芹菜素的作用同时包括增殖抑制和细胞毒性，且在低浓度芹菜素下非常敏感。相反，基于其中包括芹菜素在内的类黄酮的抗氧化作用的各种试验表明，类黄酮对细胞毒性具有保护或预防作用(Wang，C.N.等人，J.Biol.Chem.276(7)：5287-5295(2001))。
在美国专利No.5,650,433及其相应专利中提及了在关节炎中芹菜素与软骨的关系。所引用的专利表明包括芹菜素和糖苷化合物的类黄酮化合物可用于治疗关节炎，这是因为它们延迟关节软骨的破坏。然而，在其中用类黄酮化合物和蛋白多糖消耗剂PMA(佛波醇肉豆蔻乙酸酯)治疗软骨细胞的这一精神和范围内的实施方案中，仅仅评价了类黄酮化合物对蛋白多糖消耗的抑制作用。也就是说，所引用的专利公开了类黄酮化合物仅仅作为软骨保护剂的用途，而不是用于软骨再生，且也没有证明芹菜素具有软骨再生作用作用。此外，在所引用的专利中，仅仅通过体外试验测量蛋白多糖消耗的程度，并且没有具体地证明类黄酮化合物对软骨保护和软骨再生的实质性体内效果。此外，所引用的专利公开了关节病，所述关节病包括骨关节炎和类风湿关节炎，但仅仅描述了类风湿关节炎，其中类黄酮化合物的前述软骨保护作用涉及抑制蛋白多糖的消耗。
迄今为止，没有出版物涉及芹菜素对关节内软骨细胞增殖和软骨再生的作用或者施加精确浓度的芹菜素以实现这些作用。
当因骨关节炎导致受损的软骨再生时，由于应当产生与抗癌剂作用的抗增殖和细胞毒性机理相反的作用，因此应当主要在体外试验中确定在软骨细胞上实现细胞毒性和抗增殖作用的芹菜素的精确浓度。此外，通过其中芹菜素施加到骨关节炎患者上的体内试验，应当确定芹菜素能起到增殖软骨细胞作用且没有毒性的基本上有效的浓度。
为了确定芹菜素作为用于骨关节炎治疗剂的可能性与常规地确认芹菜素的细胞毒性和抗增殖相反的作用之间的关系，发明人首先检验了芹菜素在体外是否对软骨细胞具有细胞毒性和抗增殖作用。结果，在用低于10μM的非常低浓度的芹菜素治疗1-2天的软骨细胞中，芹菜素几乎没有显示出细胞毒性和抗增殖作用。在2天和6天培养时，芹菜素对软骨细胞的50％抑制浓度(IC50)值分别为约100μM和约30μM。另外，在1-10μM的浓度下，发现芹菜素具有约10-20％的增殖作用。
基于这些体外试验结果，本发明人研究了在骨关节炎诱导的动物模型中芹菜素的软骨细胞增殖作用。
使用新西兰白兔作为骨关节炎诱导的动物模型，检验在骨关节炎患者中芹菜素的各种作用，其中包括生化作用、组织学作用和软骨再生和滑液膜改善作用，新西兰白兔进行前交叉韧带切断术(ACLT)并强制它在密闭的空间内保持运动，以诱导严重的骨关节炎。
当将各种浓度的芹菜素直接注射到骨关节炎诱导的兔子的感染位点时，发现芹菜素在约0.1-100μM，和优选1-80μM的剂量下具有软骨再生作用且没有细胞毒性。芹菜素的这一浓度范围与体外细胞毒性试验的结果不相关，因此仅仅通过体外试验难以预测芹菜素使软骨再生的有效量。在本发明的实施例1中，使用约80μM的芹菜素溶液(通过在50μl DMSO内溶解50μg芹菜素并将所得溶液与450μl生理盐水混合而制备)，评价芹菜素对骨关节炎的影响。
具体地，采用前述用量的芹菜素总计4次(每周1次)注射试验组，和采用PBS注射对照组。每2周收集滑液，并测量作为骨关节炎的指示剂滑液体积的变化。
另外，进行生化试验。在所收集的滑液内，测量用作骨关节炎标志物的蛋白多糖、总蛋白质，前列腺素和胶原蛋白含量的变化。此外，通过测量滑液内氮氧化物(NO)水平的变化作为炎症指示剂并在巨噬细胞细胞系RAW 264.7内测量芹菜素对LPS-诱导的NO产生的影响，从而评价芹菜素对炎症的影响。此外，评价在巨噬细胞系内芹菜素对前列腺素的产生的影响。
为了确定芹菜素是否在基因水平上调节骨关节炎标志物蛋白质，评价芹菜素对iNOS、COX-2和IκBα基因表达的影响。此外，评价芹菜素对NFκB结合到其细胞核靶基因上的抑制作用。
在组织学试验中，根据用于骨关节炎进展的标准计分体系，Mankin分数，评价退化变化，例如软骨的结构变化，软骨的细胞数量变化和通过用染料使软骨染色时表面的染色分布(Mankin，H.J.等人，Orthopedic Clinics of North America，2：19-30(1971))。在本发明中，根据Mankin标准，由两个检查员进行盲试验。
上述评价导致下述发现：在关节软骨和滑液内导致0.1μM-100μM浓度的剂量下，芹菜素在降低骨关节炎常见的前述生化指示剂方面具有优良的生物活性，且更重要的是，具有刺激软骨再生以及软骨保护的组织学作用。基于这些结果，本发明提供了具有软骨再生作用的作为软骨再生剂的芹菜素的新用途以及含有芹菜素用于骨关节炎的治疗剂。
本说明书中所使用的术语具有下述含义。
此处所使用的术语“药学上可接受的载体”是指在医学上合理的范围内适合于与人类或动物组织接触同时不引起不可预测的毒性、疼痛和过敏的载体。药学上可接受的载体的实例可包括蒸馏水、等渗盐水、林格液和可注射用水，它们中的每一种含有小量允许芹菜素在其内溶解的有机溶剂，例如DMSO。
此处所使用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指无毒的惰性固体、半固体或液体填料、稀释剂、胶囊材料或一些类型的配方助剂。药学上可接受的赋形剂的实例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；龙须胶；麦芽；明胶；滑石；可可油；天然植物油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇，如聚丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲液，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；蒸馏水；等渗盐水；林格液；乙醇；和磷酸盐缓冲液，和可进一步包括适合于在药物配方中使用的其它无毒的物质。
另外，赋形剂的实例可进一步包括保湿剂、乳化剂和润滑剂；以及着色剂、脱模剂、胞衣剂、甜味剂、芳香剂和香料。
此处所使用的术语“软骨再生作用”是指芹菜素刺激软骨细胞增殖以及抑制软骨细胞破坏且没有细胞毒性或细胞增殖抑制的本发明所述的作用。
关于软骨再生作用，术语“刺激软骨细胞增殖且没有细胞毒性的芹菜素的有效量”是指当给要求软骨细胞增殖的患者施用芹菜素时，刺激受损软骨细胞增殖且没有引起患者毒性的芹菜素的有效量。根据本发明，在约0.1-约100μM，优选约1-约80μM，和更优选约1-约10μM的浓度下，芹菜素诱导关节软骨再生。
关于骨关节炎的治疗，术语“治疗有效量的用于使软骨再生的组合物”是指用于使软骨再生的组合物，它含有当给要求软骨再生的骨关节炎患者施用芹菜素时，通过使受损的关节软骨再生，有效改善骨关节炎的有效量的芹菜素。
在本发明的组合物或配方中，可通过主治医生的判断在医学可接受的范围内确定“治疗有效量”。对于特定的患者来说，特定的治疗有效量可根据各种因素而变化，这些因素包括组合物或配方的类型；患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食；给药的持续时间和途径；治疗期；共施用的药物；和医学领域众所周知的其它因素。例如，当在一周的时间间隔内每天一次给药时，对于口服给药来说，本发明的组合物可典型地以10mg-1000mg/天的单位剂量形式给药，在可注射配方的情况下，以0.1mg-10mg/天的单位剂量形式给药，和在使用药膏的情况下，以1mg-100mg/天的单位剂量形式给药，但本发明不限于这些实例。上述剂量说明平均情况，但可根据个体之间的差异减少或增加，并且这一改变也包括在本发明的范围内。
可将本发明的组合物或配方施用给易于患骨关节炎的所有动物，其中包括人类上。
以含用于软骨再生的本发明组合物的单位剂量形式提供本发明用于骨关节炎的治疗剂。在可注射制剂情况下，例如可根据本领域已知的方法，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，配制无菌的可注射的含水或油状悬浮体。无菌的可注射制剂可以是在无毒、非口服的可接受载体或溶剂内的无菌的可注射溶液、悬浮液或乳液。可接受的载体和溶剂包括水、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，可使用典型地用作溶剂或悬浮介质的无菌的硬化油。可注射制剂可静脉内、体腔内、肌内、皮下和管内注射。
对于肠胃外给药来说，最优选无菌的水溶液形式。为了与血液等渗，该溶液可含有例如诸如盐或糖，例如葡萄糖和甘露醇之类的材料。
用于口服给药的固体剂量形式包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂量形式当中，活性化合物可与例如一种或多种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。此外，除了惰性稀释剂，可包括添加剂，例如，润滑剂和其它助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂量形式可包括缓冲剂。片剂和丸剂可进一步使用肠衣剂和其它持续释放的胞衣材料。在软质和硬质明胶胶囊中，赋形剂如乳糖或牛奶糖和高分子量的二元醇可用作填料。
可使用胞衣和制壳系统，制备包括片剂、糖衣片剂、胶囊、丸剂和颗粒剂在内的固体剂量形式。
用于口服给药的液体剂量形式可包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮体、糖浆和酏剂，它们含有在本领域中常用的惰性稀释剂，例如水。这些组合物可包括润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和调味剂与香料。
另外，本发明的配方可制备成在局部或经皮给药剂量形式的药膏、糊剂、软膏、洗剂、凝胶或贴剂。经皮贴剂的额外优势是调节输送到身体的组合物用量。可通过在合适的介质内溶解或分散化合物，从而制备这些剂量形式。可使用吸收刺激剂增加化合物经皮吸收。对于经皮给药来说，本发明的组合物可配制成含有聚丙烯酸钠、甘油和对羟基苯甲酸甲酯的药学上可接受的泥敷剂，或者含有丙二醇、液体石蜡和肉豆蔻酸异丙酯的膏剂。
通过下述实施例可获得本发明的更好理解，其中列出所述实施例阐述本发明，而不是解释为限制本发明。
实施例1：芹菜素的抗增殖和细胞毒性作用
已知芹菜素对肿瘤细胞以及正常细胞具有抗增殖和细胞毒性作用。因此，为了实现本发明芹菜素的软骨细胞的增殖作用，在体外评价芹菜素对软骨细胞的细胞毒性。
为了确定发挥其对软骨细胞的抗增殖和细胞毒性作用有效的芹菜素浓度，在从新西兰白兔中分离的软骨细胞中测量IC50值。简而言之，通过胶原蛋白酶处理，从兔子的正常软骨中分离软骨细胞，并用各种浓度1、10、20、30、40、50、100和200μM的芹菜素(含有小于0.05％DMSO)处理。在培养过程中，在第1、2、4和6天时，通过MTT分析，基于细胞的存活测量IC50值。
结果，下表1给出了在兔子的软骨细胞的原代培养物上芹菜素的IC50值，从而表明芹菜素的抗增殖作用。
表1：在软骨细胞上芹菜素的IC50值
  治疗时间   IC50值
  1天   约200μM
  2天   约100μM
  4天   约40μM
  6天   约30μM
特别地，在非常低浓度，低于约10μM的芹菜素存在下培养1和2天的软骨细胞中，观察到没有显著的增殖抑制或细胞毒性。相反，在1μM-10μM的浓度下，芹菜素在软骨细胞上显示出约10-20％的细胞增殖作用。因此，认为低于10μM浓度的芹菜素在体外具有软骨再生作用同时刺激软骨细胞增殖并使其细胞毒性最小化。
这些结果证明，在使用芹菜素治疗骨关节炎时，确定芹菜素的有效浓度是实现芹菜素的消炎和软骨再生作用同时避免芹菜素的抗增殖和细胞毒性作用的重要因素。
实施例2：在实验动物中诱导骨关节炎
为了制备骨关节炎模型，使新西兰白兔在其两条后腿的关节内进行前交叉韧带切断术(ACLT)。3天后，强制兔子在5×5m3的空间内运动4周，以诱导严重的骨关节炎。总计4次将50μg芹菜素(A3145，Sigma)(每周一次共4周)施用到骨关节炎诱导的兔子的感染的右腿内。通过在50μl DMSO(二甲亚砜)和450μl生理盐水的混合物内溶解50μg芹菜素，制备可注射的制剂。已感染的左腿用作已感染的右腿的对照，并注射含有50μl DMSO的450μl生理缓冲液PBS，以便比较芹菜素的作用。在骨关节炎诱导后的第2周和第4周中，施用芹菜素之后1周时，收集关节滑液和软骨并用于试验。图13示出了骨关节炎诱导和滑液收集的过程。全部使用与该实施例2一样制备的骨关节炎诱导的新西兰白兔关节，进行以下的实施例3-10。
图1图示了试验和对照组的感染关节。如图1所示，在用本发明有效量的芹菜素给药的兔子中，关节软骨的表面肉眼看是光滑的。相反，在PBS对照组中，关节软骨的表面由于关节软骨的损伤，因此是非常粗糙的。另外，发现在用芹菜素给药的试验组的左关节内的软骨在一定程度上得到改善，这是因为在右关节内软骨的改善导致的重量减轻所致。
实施例3：测量总的关节滑液体积
典型地，当骨关节炎进展时，滑液体积随炎症加重而增加。在骨关节炎(OA)诱导之前(正常状态)和在骨关节炎诱导之后的第2周和第4周时，施用芹菜素之后1周时，收集滑液并离心，以除去血细胞和其它细胞。在本试验中使用上清液。
据报道，由于滑液体积随骨关节炎进展而变化，因此测量总的滑液体积，以研究滑液随骨关节炎诱导和药物治疗的变化。使用Arsenazo III络合(complexion)方法，通过测量滑液内Ca2+的浓度，从而测定滑液体积(Michaylova V.等人，Anal.Chim.Acta，53：194(1971))。使用Donnan平衡方程式，计算总的滑液体积。将0.01ml滑液和1mlArsenazo III试剂(588-3，Sigma)混合并使之在室温下静置5分钟，使用分光光度计(DU650，Beckman)，在600nm下测量吸光度。
下表2和图2中给出了结果。在注射药物之后4周时，在PBS对照组中，约0.25ml正常的总滑液体积(在OA诱导之前)增加到约1.7ml。相反，芹菜素治疗组显示出总滑液体积较小的增加，在注射药物之后4周时，增加到约1.16ml，这表明芹菜素对滑液体积的增加具有强烈的抑制作用。另外，在芹菜素治疗组中，(没有用芹菜素治疗的)感染左关节在芹菜素注射之后4周时显示出较小的滑液体积，约1.58ml，相比之下，PBS对照组具有约1.91ml的滑液体积。在感染左关节内的这种改善是由于右关节通过芹菜素注射得到改善导致的重量减轻所致。
表2：总的滑液体积(ml)
  正常   在OA诱导之后4周时   芹菜素治疗   在药物注射之后2周时   在药物注射之后4周时
  芹菜素治疗组   0.25±0.12   1.59±0.32   +(右腿)   1.13±0.08   1.16±0.03
  -(左腿)   1.17±0.08   1.58±0.24
  PBS对照组   0.26±0.09   1.75±0.11   +(右腿)   1.5±0.22   1.7±0.05
  -(左腿)   1.2±0.16   1.91±0.34
实施例4：测量关节滑液内的蛋白多糖水平
在实施例3所制备的关节滑液内，使用1，9-二甲基亚甲基蓝分析法，测量蛋白多糖水平(Houselmann H.J.等人，Am.J.Physiol.271：C742-752(1996))。将50μl滑液样品与250μl 1，9-二甲基亚甲基蓝(34，108-8，Aldrich)混合，并使用分光光度计(Power Wave X340，BioTek)，在530nm下测量吸光度。
下表3和图3中给出了结果。在注射药物之后4周时，在PBS对照组中，约3.79μg/ml正常的蛋白多糖水平(在OA诱导之前)增加到约59.65μg/ml。相反，与对照组相比，芹菜素治疗组显示出蛋白多糖水平的急剧下降，在注射药物之后4周时，为约12.22μg/ml，这表明在OA诱导的关节内芹菜素具有降低蛋白多糖水平的强烈的作用。另外，在芹菜素的治疗组中，(没有用芹菜素治疗的)感染的左关节比PBS对照组显示出较低的蛋白多糖水平。
表3：在关节滑液内的蛋白多糖水平(μg/ml)
  正常   在OA诱导之后4周时   芹菜素治疗   在药物注射之后2周时   在药物注射之后4周时
  芹菜素治疗组   3.79±0.07   5.84±0.44   +(右腿)   10.32±0.66   12.22±0.4
  -(左腿)   22.90±0.86   34.09±0.24
  PBS对照组   3.38±0.29   3.24±0.42   +(右腿)   24.42±0.40   59.65±0.52
  -(左腿)   22.25±0.22   48.47±0.49
实施例5：测量在关节滑液内的总蛋白质水平
随着骨关节炎的进展软骨被破坏时，包含在其内的蛋白质释放到滑液内。关于这一点，测量在滑液内总的蛋白质水平。使用实施例3中制备的关节滑液，使用Bradford方法测量在滑液内总的蛋白质水平。将50μl滑液与200μl蛋白质分析剂(500-0006，Bio-Rad)混合并使之在室温下静置5分钟，和在595nm下测量吸光度。
下表4和图4中给出了结果。在注射药物之后4周时，在PBS对照组中，约4.27mg/ml正常的总蛋白质水平(在OA诱导之前)增加到约39.74mg/ml。相反，与对照组相比，芹菜素治疗组显示出总蛋白质水平的显著下降，在注射药物之后4周时，为约24.91mg/ml。
表4：在关节滑液内的总蛋白质水平(mg/ml)
  正常   在OA诱导之后4周时   芹菜素治疗   在药物注射之后2周时   在药物注射之后4周时
  芹菜素治疗组   4.27±0.24   53.24±0.24   +(右腿)   16.64±0.3   24.91±0.35
  -(左腿)   20.36±0.69   36.37±0.
  PBS对照组   4.29±0.68   53.64±0.47   +(右腿)   28.02±0.83   39.74±0.52
  -(左腿)   34.69±0.36   35.28±0.53
实施例6：测量在关节滑液内的前列腺素E2(PGE2)的水平
使用实施例3中制备的关节滑液，使用酶免疫分析(EIA)试剂盒(DE0100，R&DSystems)，测量在滑液内的前列腺素E2(PGE2)的水平。在试剂盒内提供的平板内，将100μl 1∶10稀释的滑液样品与50μl缀合物和50μl抗体混合，并在室温下在搅拌下培养2小时。然后，用洗涤缓冲液洗涤该平板，并向其中添加200μl pNPP溶液，接着在室温下培养1小时。之后，在405nm下测量吸光度。
下表5和图5中给出了结果。在注射药物之后4周时，在PBS对照组中，约88.05pg/ml正常的PGE2水平(在OA诱导之前)增加到约862.72pg/ml。相反，在芹菜素治疗组中，从正常的PGE2水平略微增加到约196.71pg/ml，因此与对照组相比大大地下降。这些结果表明，芹菜素对PGE水平的增加具有强烈的抑制作用。另外，在芹菜素治疗组中，(没有用芹菜素治疗的)感染的左关节显示出约753.2pg/ml显著下降的PGE2水平，相比之下对照组具有约509.3pg/ml的PGE2水平。
表5：在关节滑液内的PGE2水平(pg/ml)
  正常   在OA诱导之后4周时   芹菜素治疗   在药物注射之后2周时   在药物注射之后4周时
  芹菜素治疗组   88.05±2.08   503.98±1.41   +(右腿)   183.26±0.2   196.71±0.52
  -(左腿)   543.3±1.13   509.2±9.2
  PBS对照组   90.6±0.71   503.51±0.72   +(右腿)   685.7±0.54   862.7±0.36
  -(左腿)   571.7±0.57   753.2±0.31
实施例7：测量关节滑液内的胶原蛋白水平
通过Sirius Red染色，测量总的胶原蛋白水平(Heide T.R.等人，Histochem.Cell Biol.，112：271-276(1999))。将100μl滑液样品放置在96孔平板内的每一孔中并在干燥烘箱中，在34℃下培养24小时，以涂布孔底。100μl通过在苦味酸内溶解Sirius Red(1mg/ml，36，554-8，Aldrich)而制备的染料溶液加入到每一孔内，并振荡平板30分钟。使用0.01NHCl(H7020，Sigma)除去剩余的染料，并使用100μl 0.1N的NaOH(S8045，Sigma)溶解胶原蛋白。然后，通过在550nm下测量吸光度，确定总的胶原蛋白水平。通过测量不同浓度0、100、200、300、400和500μg下的I型胶原蛋白(C1188，Sigma)在550nm处的吸光度，获得标准曲线。使用该标准曲线，测定在滑液内的胶原蛋白水平。
下表6和图6中给出了结果。在注射药物之后4周时，在PBS对照组中，约118.64μg/ml正常的胶原蛋白水平增加到约1912.54μg/ml。相反，芹菜素治疗组显示出406.56μg/ml大大地下降的胶原蛋白水平，从而表明芹菜素显著抑制胶原蛋白水平。另外，在芹菜素治疗组中，(没有用芹菜素治疗的)感染的左关节显示出约1019.2μg/ml在滑液内显著下降的胶原蛋白水平，相比之下对照组具有约1551μg/ml的PGE2水平。
表6：在关节滑液内的胶原蛋白水平(μg/ml)
  正常   在OA诱导之后4周时   芹菜素治疗   在药物注射之后2周时   在药物注射之后4周时
  芹菜素治疗组   118.64±0.64   233.18±1.03   +(右腿)   397.4±0.69   406.6±0.63
  -(左腿)   749.4±0.46   1019.2±0.79
  PBS对照组   119.7±0.44   233.38±0.93   +(右腿)   805.9±0.19   1912.5±0.7
  -(左腿)   734.2±0.71   1551±0.64
实施例8：关节的Mankin评分
从实验动物的膝关节的内侧副髌骨(parapatella)滑膜中横切30mm的滑液组织，用10％甲酸(F0507，Sigma)固定24小时，并包埋在石蜡中，制备4mm的蜡块。对这4mm的部分进行H&E(苏木精和曙红)染色，并在光学显微镜下观察，以确定Mankin分数。在评价骨关节炎发展程度所使用的数种方法中，最常用的方法是Mankin评分。这一方法基于在每一项目上以等级形式用数字表达退化变化，其中包括软骨的结构变化，软骨内细胞数量的增加或减少，通过用沙黄O染色软骨得到的表面的染色分布和潮线的持续。通过由两个检查员进行的盲试验，进行Mankin评分，和根据退化的进展程度确定Mankin分数，和范围为0(所有项目正常)到最大分数14，从而计算退化变化指数。
图7中给出了结果。在骨关节炎诱导之后，在对照组和芹菜素治疗组中的平均分数分别为12.5和6.6。也就是说，与对照组相比，芹菜素治疗组在退化变化指数方面显示出两倍的改进。
实施例9：关节的H&E染色和沙黄O染色
从实验动物上收集远端股骨，并用4％福尔马林(F8775，Sigma)固定24小时以上。将待分析的远端股骨区域横切成5mm的厚度，用5％硝酸(25，811-3，Sigma)脱钙24小时以上，并包埋在石蜡内，以提供蜡块。横切该蜡块，并对所得4μm的部分进行H&E染色，并用软骨特异的染料沙黄O(S2255，Sigma)染色并在光学显微镜下观察，以评价软骨的状况。
图8A和8B给出了结果，图8A和8B分别示出了在芹菜素治疗组和用生理盐水治疗的对照组中H&E染色和沙黄O染色的结果。当沙黄O染色时，观察到所有的骨关节炎特征，但在芹菜素治疗组中，软骨破坏足够低可用肉眼识别，且与对照组相比，显示出蛋白多糖相对高的染色。当对芹菜素治疗组进行组织学分析用以肉眼评价软骨特异的ECM合成，例如蛋白多糖和细胞形态时，发现软骨的受损区域得到恢复。
实施例10：评价滑液细胞的分布与数量
根据与实施例9相同的方法制备组织并评价细胞数量和其表面状况。在深度为120微米的位点处测量细胞数量。
图9和10给出了结果。正如图9所示，与用生理盐水治疗的对照组相比，芹菜素治疗组在右腿截面内具有相对光滑的表面。另外，如图10所示，在骨关节炎诱导之后，在对照组内的滑液细胞数量为632.3个，而在芹菜素治疗组内为406.6个。也就是说，与对照组相比，芹菜素治疗组具有显著下降的滑液细胞数量，下降约34.5％。
实施例11：测量在滑液内的一氧化氮(NO)水平
为了测定滑液内的NO水平，将硝酸还原成最稳定的形式，亚硝酸盐，和使用Griess反应，测量亚硝酸盐。滑液和Griess试剂以1∶1的比值混合(100μl∶100μl)，并在室温下放置10分钟，和使用分光光度计(Power Wave X340，Bio-Tek)，在540nm处测量吸光度。使用0.1g磺胺(S9251，Sigma)、0.5ml磷酸(P6560，Sigma)和0.01gN-萘基-二胺-H-盐酸盐(102397，ICN)，制备最终体积为10ml的Griess试剂。使用亚硝酸钠(S2252，Sigma)获得亚硝酸盐的定量曲线。
下表7中给出了结果。在骨关节炎诱导之后，在PBS对照组中，约4.48μM的正常NO水平(在OA诱导之前)增加到约12.1μM，而在芹菜素治疗组中略微增加到约6.01μM。这些结果表明芹菜素具有良好的消炎作用。
表7：在滑液内的NO水平(μM)
  正常   在OA诱导之后4周时   芹菜素治疗   在药物注射之后2周时   在药物注射之后4周时
  芹菜素治疗组   4.48±3.18   12.11±0.88   +(右腿)   7.53±4.66   6.01±0.88
  -(左腿)   0.65±0.06   5.5±4.59
  PBS对照组   4.48±3.18   12.11±0.88   +(右腿)   10.58±2.33   12.1±6.66
  -(左腿)   0.65±0.05   6±0.88
实施例12：芹菜素对巨噬细胞的NO产生的抑制作用
从小鼠得到的巨噬细胞系RAW 264.7(KCLB 40071)购于韩国细胞系库(Cell LineBank)。将密度为3×106个细胞的RAW 264.7细胞在60mm的培养皿内接种，所述培养皿含有DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基，12800-017，Gibco)并补加10％FBS(胎牛血清，26140-079，Gibco)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(15140-122，Gibco)，且在5％二氧化碳和湿度下在37℃下培养24小时。为了诱导NO产生，用500ng/ml大肠杆菌细胞壁组分，即脂多糖(LPS，L2654，Sigma)处理RAW 264.7细胞。仅仅用DMSO处理对照组，和用浓度为10、20、40和80μM芹菜素处理试验组16小时。此处，将LPS溶解在蒸馏水内，和将芹菜素溶解在DMSO内。然后，将培养基和Griess试剂以1∶1的比值混合(100μl∶100μl)，并使之在室温下放置10分钟。之后，使用分光光度计(Power WaveX340，Bio-Tek)，在540nm下测量吸光度。
下表8中给出了结果。未处理组产生2μM一氧化氮，和仅仅用LPS处理的组生成40μM一氧化氮。相反，在用LPS和芹菜素处理的组中，随芹菜素的浓度不同，NO的生成下降到最大9μM，从而表明芹菜素在体外具有优良的消炎作用。
表8：在RAW 264.7细胞内的一氧化氮水平
  处理   亚硝酸盐(μM)
  未处理   2
  LPS(500ng/ml)   40
  LPS+芹菜素(10μM)   32.2
  LPS+芹菜素(20μM)   22.2
  LPS+芹菜素(40μM)   10.1
  LPS+芹菜素(80μM)   9
实施例13：芹菜素对巨噬细胞产生前列腺素E2(PGE2)的抑制作用
在与实施例12相同的条件下处理RAW 264.7细胞。使用PGE2免疫分析试剂盒(DE0100，R&D Systems)测量PGE2水平。在试剂盒内，使100μl培养基与50μl缀合物和50μl抗体反应2小时，然后使之与200μl展开剂，pNPP反应1小时。之后，使用分光光度计(Power Wave X340，Bio-Tek)，在405nm下测量吸光度。
下表9给出了结果。未处理组产生71pg/ml PGE2，和仅仅用LPS处理的组生成4156pg/ml PGE2。相反，在用LPS和芹菜素处理的组中，随芹菜素的浓度不同，PGE2的产生下降到最大300pg/ml。
表9：在RAW 264.7细胞内的PGE2水平
  处理   PGE2(pg/ml)
  未处理   71
  LPS(500ng/ml)   4156
  LPS+芹菜素(10μM)   3935
  LPS+芹菜素(20μM)   3918
  LPS+芹菜素(40μM)   1057
  LPS+芹菜素(80μM)   300
实施例14：评价芹菜素对巨噬细胞内iNOS、COX-2、IκBα的表达的影响
在与实施例12相同的条件下处理RAW 264.7细胞。为了研究芹菜素对巨噬细胞内iNOS、COX-2和IκBα的表达的影响，进行Western印迹法。此处对于IκBα的表达来说，用LSP处理细胞仅仅2小时。在除去培养基之后，收集细胞并用抽提缓冲液(0.32M蔗糖(S0389，Sigma)、0.2M Hepes(H3375，Sigma)，1mM EDTA(808288，BM)、1mMPMSF(P7626，Sigma)、10μg/ml抑蛋白酶肽(A1153，Sigma)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽(L0649，Sigma)、10μg/ml SBTI(T9128，Sigma))裂解。在测量细胞裂解物内的蛋白质浓度之后，在8-16％SDS(十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶(EC60452，NOVEX)上分离40mg蛋白质样品。将分离的蛋白质转移到PVDF(聚偏二氟乙烯，IPVH00010，Millipore)上。在5％NFDM(非脂肪干乳)内封阻(block)该印迹并使之与初级抗体反应，然后与二级抗体反应。然后使用ECL(增强化学发光)的试剂盒(RPN2106，Amersham)形成印迹，并暴露于X-射线薄膜(AGFA)下。使用下述初级抗体：0.13μg/ml抗-iNOS(N32020，Transduction)、2μg/ml抗-COX-2(sc-1745，Santacruz)、1μg/ml抗-β-肌动蛋白(A5441，Sigma)和0.4μg/ml抗-IκBα(sc-371，Santacruz)。80ng/ml抗小鼠IgG-HRP(sc-2005，Santacruz)用作抗-iNOS和抗-β-肌动蛋白的二级抗体。80ng/ml抗兔子IgG-HRP(sc-2004，Santacruz)用作抗-COX-2和抗-IκBα的二级抗体。
图11中给出了结果。在没有外部刺激的正常条件下，没有观察到iNOS的表达。当LPS处理时增加的iNOS的表达水平用100％表示。当芹菜素处理时，增加的iNOS的表达水平从100％下降到0％。在没有外部刺激的正常条件下，没有观察到COX-2的表达。当LPS处理时增加的COX-2的表达水平用100％表示。当芹菜素处理时，增加的COX-2的表达水平从100％下降到0％。
在没有外部刺激的正常条件下，IκBα的表达水平用100％表示。LPS处理导致下降到18.56％。当用仅仅10μM的芹菜素处理时，下降的IκBα的表达水平恢复到75.82％。
实施例15：评价芹菜素对巨噬细胞内NFκB结合到特异基因上的影响
在与实施例12相同的条件下处理RAW 264.7细胞，所不同的是处理持续2小时而不是16小时。为了研究芹菜素对巨噬细胞内NFκB和特异基因之间结合的影响，进行EMSA(电泳迁移率变动分析)。在除去培养基之后，收集细胞，用缓冲液A(10mMHepes，pH7.9(H3375，Sigma)、10mM KCl(P9541，Sigma)、1.5mM MgCl2(M2393，Sigma)、0.5mM二硫代苏糖醇(D0632，Sigma)、0.2mM PMSF(P7626，Sigma)、0.5％NonidetP-40(N3268，Sigma))裂解，并在5000rpm下离心15分钟。在缓冲液B(20mMHepes，pH7.9(H3375，Sigma)、300mM KCl(P9541，Sigma)、1.5mM MgCl2(M2393，Sigma)、10％甘油(G7757，Sigma)、0.5mM二硫代苏糖醇(D0632，Sigma)、0.2mMEDTA(808288，BM)、0.2mM PMSF(P7626，Sigma))内悬浮颗粒物，以破坏细胞膜，并在13000rpm下离心30分钟，获得核蛋白质。用[γ-32P]ATP(PB10218，Amersham)标记能结合到NFκB上的合成的核酸低聚物(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’，GenoTech)。使10mg蛋白质样品与0.5ng标记的核酸低聚物反应。然后，为了评价探针与NFκB之间的结合，使反应溶液进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，并干燥该凝胶，并暴露于X-射线薄膜下。
图12中给出了结果。在没有外部刺激的正常条件下，NFκB的表达水平用100％表示。LPS处理导致增加到186。相反，当同时用LPS和芹菜素处理时，正常的NFκB的表达水平下降到最大111(当用20μM的芹菜素处理时)。
工业实用性
如前所述，本发明提供芹菜素作为软骨再生剂的新用途，所述芹菜素具有降低升高含量的软骨破坏标志物，改善滑液细胞的状况，并使软骨再生的作用，其中软骨破坏标志物包括总的滑液体积和滑液内的蛋白多糖、总的蛋白质和前列腺素。此外，本发明提供用于骨关节炎的治疗剂，其包括单一化合物芹菜素作为再生关节软骨的试剂，和使用该治疗剂治疗骨关节炎的方法。

Claims (8)

1.一种使软骨再生的组合物，它包括芹菜素和药学上可接受的载体，其中所述的芹菜素的有效用量使关节软骨和滑液内的芹菜素形成1μM-80μM的浓度。
2.如权利要求1所述的使软骨再生的组合物，其中所述组合物具有降低关节滑液体积，和在滑液内的蛋白多糖，总蛋白质和前列腺素水平，并改善滑液细胞的状况。
3.使软骨再生的用于骨关节炎的治疗剂，其包括如权利要求1所述的使软骨再生的组合物和药学上可接受的赋形剂。
4.如权利要求3所述的用于骨关节炎的治疗剂，其中该治疗剂为溶液、胶囊、颗粒、片剂或丸剂的口服给药制剂形式；局部可施涂的药膏制剂或经皮给药的制剂；或注射剂。
5.如权利要求4所述的用于骨关节炎的治疗剂，其中治疗剂为口服给药的制剂形式，其含有每日10mg-1000mg有效量的芹菜素。
6.如权利要求4所述的用于骨关节炎的治疗剂，其中治疗剂为药膏形式，其含有每日1mg-100mg有效量的芹菜素。
7.如权利要求4所述的用于骨关节炎的治疗剂，其中治疗剂为注射剂形式，其含有每日0.1mg-10mg有效量的芹菜素。
8.通过使关节软骨再生治疗骨关节炎的方法，该方法包括给骨关节炎患者施用用于骨关节炎的治疗剂，所述用于骨关节炎的治疗剂包括如权利要求1所述的使软骨再生的组合物和药学上可接受的赋形剂。
CNA200480030411XA 2003-10-15 2004-10-15 含有芹菜素作为软骨再生剂用于治疗骨关节炎的组合物 Pending CN1897932A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020030071777 2003-10-15
KR1020030071777A KR100437274B1 (ko) 2003-10-15 2003-10-15 연골재생제로서 아피제닌을 함유하는 골관절염 치료 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1897932A true CN1897932A (zh) 2007-01-17

Family

ID=36480979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200480030411XA Pending CN1897932A (zh) 2003-10-15 2004-10-15 含有芹菜素作为软骨再生剂用于治疗骨关节炎的组合物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20070154540A1 (zh)
EP (1) EP1680104A4 (zh)
JP (1) JP2007508371A (zh)
KR (1) KR100437274B1 (zh)
CN (1) CN1897932A (zh)
AU (1) AU2004279260B2 (zh)
CA (1) CA2548578A1 (zh)
WO (1) WO2005034937A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106619603A (zh) * 2016-08-31 2017-05-10 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途
CN109925334A (zh) * 2019-03-05 2019-06-25 江西华普康明生物科技有限公司 异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5424904B2 (ja) * 2007-03-15 2014-02-26 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 安定化されたヘマトキシリン
CN102711743A (zh) 2009-10-22 2012-10-03 Api起源有限责任公司 含有黄酮类的组合物的制备和使用方法
KR101817635B1 (ko) 2010-10-22 2018-01-11 비쭈리 헬스 사이언스 엘엘씨 난용성 화합물의 용해도를 증가시키는 방법과 이와 같은 화합물의 제형을 제조하는 방법 및 사용하는 방법
KR101301253B1 (ko) 2011-12-09 2013-08-28 한국원자력연구원 방사선을 이용한 크로메논 유도체의 제조방법
WO2014138372A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 Primavera Biosciences, Inc. Composition and method for treating osteoarthritis
KR20220042403A (ko) * 2019-08-02 2022-04-05 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 연골 재생 촉진용 조성물
US11642360B2 (en) * 2019-09-03 2023-05-09 BioRelief, LLC Compositions for improving joint health
JP7457353B2 (ja) * 2020-04-28 2024-03-28 学校法人北陸大学 軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤
WO2023105103A1 (es) 2022-06-17 2023-06-15 Mesoestetic Pharma Group, S.L Composición cosmética sinérgica despigmentante de la piel

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4268517A (en) * 1979-08-30 1981-05-19 Continental Pharma Pharmaceutical composition and therapeutical method for treating degenerative affections of the articular cartilage
JPH0725761A (ja) * 1993-07-09 1995-01-27 Kureha Chem Ind Co Ltd 軟骨保護剤
KR100599934B1 (ko) * 1998-12-22 2006-11-30 주식회사 엘지생활건강 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2002076241A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 N.V. Nutricia Preparation for the prevention and/or treatment of altered bone metabolism
DE60313754T2 (de) * 2002-03-06 2008-01-24 The Medical Research and Education Trust, San Diego Botanischer extrakt mit antikrebs-aktivität enthaltend isoliquiritigenin

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106619603A (zh) * 2016-08-31 2017-05-10 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 芹菜素在制备预防和治疗肾脏纤维化的药物中的用途
CN109925334A (zh) * 2019-03-05 2019-06-25 江西华普康明生物科技有限公司 异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007508371A (ja) 2007-04-05
WO2005034937A1 (en) 2005-04-21
EP1680104A4 (en) 2008-09-03
AU2004279260A1 (en) 2005-04-21
AU2004279260B2 (en) 2008-04-17
EP1680104A1 (en) 2006-07-19
KR100437274B1 (ko) 2004-06-24
CA2548578A1 (en) 2005-04-21
US20070154540A1 (en) 2007-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1193751C (zh) 一种含有五羟黄酮衍生物活性成分的骨质疏松症治疗剂
Qian et al. Downregulating PI3K/Akt/NF-κB signaling with allicin for ameliorating the progression of osteoarthritis: in vitro and vivo studies
Mével et al. Olive and grape seed extract prevents post-traumatic osteoarthritis damages and exhibits in vitro anti IL-1β activities before and after oral consumption
Gu et al. Akebia Saponin D suppresses inflammation in chondrocytes via the NRF2/HO-1/NF-κB axis and ameliorates osteoarthritis in mice
Hu et al. Hydroxysafflor yellow A (HSYA) targets the NF-κB and MAPK pathways and ameliorates the development of osteoarthritis
JP2014520864A (ja) 代謝経路を変調させるための組成物および方法
CN1140994A (zh) 2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物作为结肠癌化学预防剂和化学治疗剂的用途
Jin et al. Isofraxidin targets the TLR4/MD-2 axis to prevent osteoarthritis development
CN1897932A (zh) 含有芹菜素作为软骨再生剂用于治疗骨关节炎的组合物
JP2023512791A (ja) 軟骨細胞、細胞外マトリックス、関節軟骨及び関節炎の表現型の恒常性を調節するための組成物及び方法
WO2023076937A1 (en) Methods of treating endometriosis and other non-cancer gynecological disorders with hemp extract
Chen et al. Oroxylin A attenuates osteoarthritis progression by dual inhibition of cell inflammation and hypertrophy
Xue et al. Nomilin targets the Keap1‐Nrf2 signalling and ameliorates the development of osteoarthritis
Zhang et al. α-Cyperone (CYP) down-regulates NF-κB and MAPKs signaling, attenuating inflammation and extracellular matrix degradation in chondrocytes, to ameliorate osteoarthritis in mice
Xue et al. Troxerutin suppresses the inflammatory response in advanced glycation end-product-administered chondrocytes and attenuates mouse osteoarthritis development
CN1745747A (zh) 原花青素在制备治疗结肠炎药物的新用途
Ballur et al. Influence of pinealectomy and long-term melatonin administration on inflammation and oxidative stress in experimental gouty arthritis
CN115515614B (zh) 用于改进关节健康和治疗关节炎的包含山姜属和其它植物提取物的组合物
Yang et al. Roles of extrahepatic lipolysis and the disturbance of hepatic fatty acid metabolism in TNF-α-induced hepatic steatosis
Yu et al. Asiatic acid ameliorates obesity-related osteoarthritis by inhibiting myeloid differentiation protein-2
Zhang et al. Genistein inhibits osteolytic bone metastasis and enhances bone mineral in nude mice
JP2012520301A (ja) エストロゲン化合物及びその使用方法
Yang et al. Norcantharidin ameliorates estrogen deficient-mediated bone loss by attenuating the activation of extracellular signal-regulated kinase/ROS/NLRP3 inflammasome signaling
WO2016073326A2 (en) Methods and compositions for treating and preventing arthritis
Yu et al. Time-Dependent Effect of Eggshell Membrane on Monosodium-Iodoacetate-Induced Osteoarthritis: Early-Stage Inflammation Control and Late-Stage Cartilage Protection

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: LIUHAN CO.,LTD.; APPLICANT

Free format text: FORMER OWNER: KAMS CO., LTD.; APPLICANT

Effective date: 20071019

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20071019

Address after: Seoul, South Kerean

Applicant after: Yuhan Corporation

Co-applicant after: Huang Chengyuan

Address before: Inchon, South Korea

Applicant before: Kmsi Co., Ltd.

Co-applicant before: Huang Chengyuan

Co-applicant before: Huang Chengwan

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication