CN102711743A - 含有黄酮类的组合物的制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新颖的微粒和可溶形式的黄酮类及其合成。本发明还包括这些黄酮类的新颖的制剂。进一步地，本发明包括制造该黄酮类制剂的新颖的方法。本发明还涉及该黄酮类制剂的广泛应用。

Description

含有黄酮类的组合物的制备和使用方法

本申请要求于2009年10月22日提交的美国临时申请No.61/253,857的优先权，其全部内容通过引用而并入本申请中。

技术领域

本发明涉及黄酮类的新颖的微颗粒和可溶的形式及其合成。本发明还包括这种黄酮类的新颖的制剂和生产该黄酮类制剂的新颖的方法。本发明还涉及该黄酮类制剂的各种应用。

背景技术

黄酮类

被认为可提供防癌作用的原理性植物衍生剂是黄酮类和膳食纤维(Patel，D,et al.,Apigenin and cancer chemoprevention:Progress,potential,and promise,Int1.J Oncology2007Jan;30(1):233-45)。化学预防是肿瘤学的一个方面，其专注于通过自然存在的或合成的试剂来预防癌症。

黄酮类已被证实可充当自由基清除剂、抗氧化剂、超氧阴离子、UV吸收剂和脂质过氧自由基。黄酮类化合物也已知能有效地强化胶原蛋白结构。此外，黄酮类已被证明可展示出抗诱变、抗炎和抗病毒的作用。

所有黄酮类具有相同的基本化学结构，即三环分子。同族群中的各个黄酮类在取代基（羟基、甲氧基或糖类基团）的数量和位置方面各不相同。

黄酮类具有如下通式（式I）：

黄酮类包括大约5000种自然存在的化合物。可发生大量的其他取代，产生了多种类型的黄酮类。

皮肤癌

皮肤癌的发展是一项主要的全球性公众健康威胁。紫外线如太阳紫外线B(UVB)和太阳紫外线A(UVA)的辐射是皮肤癌的主要诱因。尽管具有高SPF成分的防晒霜的出现和使用，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤的发病率仍持续上升。早期检测和治疗对于提高存活率是必要的，然而皮肤癌很大程度上是可预防的癌症。当前的防晒霜制剂已证明了不足以使人体完全免受UV辐射的DNA损害作用。当个体过度暴露于阳光下时，防晒霜的使用可能有时会造成安全的错觉。

研究表明，黄酮具有抗氧化、抗诱变、抗癌、抗炎症、抗增殖和抗恶化的特性(Patel，D,et al.,Apigenin and cancer chemoprevention:Progress,potential, and promise,Intl.JOncology 2007Jan;30(1):233-45)。此外，Birt及其团队用活体小鼠模型证明了在UVB照射前外用涂敷芹菜素可将皮肤癌的发病率显著地减少90%(Birt et al.,Anti-mutagenesisand anti-promotion by apigenin,robinetin and indole-3-carbinol,Carcinogenesis,June 1986；7:959-963)。其他课题组已证明了芹菜素的保护老鼠免受结肠癌的能力(Wang et al，Cellcycle arrest at G2/M and growth inhibition by apigenin in human cell colon carcinoma celllines,Molecular Carcinogenesis,28:102-110(2000))。

研究者已发现，芹菜素在细胞周期的G1和G2/M阶段可诱导可逆的细胞周期阻滞。还发现了芹菜素通过多种机制在细胞周期中介导抑制，包括对有丝分裂激酶p34cdc2的直接和间接的抑制，以及以依赖于p53的方式对细胞周期抑制剂p21WAF1的诱导(LepleyDM，et al.,The chemopreventative flavonoid apigenin induces G2/M arrest in keratinocytes,Carcinogenesis,17,2367-75(1996))。

G1/S和/或G2/M细胞周期检查点调控的丧失导致了转化和癌症发展。细胞周期的开始和发展主要受促使细胞增殖的原癌基因和用于减缓或中断细胞生长的抑癌基因的控制。原癌基因和/或抑癌基因中的突变会通过缩短花费在G1或G2/M上的时间长度而使细胞易产生受损的G1/S检查点。

其他皮肤病

Kang、Ecklund、Liu和Datta (Arthritis Research&Therapy 2009,Vol.11)教导了增加诸如芹菜素等源于食用植物的COX-2和NF-κB抑制剂的生物利用率可对抑制狼疮中的发炎和诸如银屑病等的其他Th17介导的疾病很有意义。作为非诱变性食用黄酮类，芹菜素通过抑制针对自身反应性的Th1和Th17细胞的扩张的自身抗原表达而抑制了狼疮。

二甲基亚砜(DMSO)已被广泛用于活体研究中，作为包括芹菜素等的许多不溶于水的黄酮类的溶剂。然而，出于毒性的考虑，当考虑用于人类的外用制剂时，不推荐用二甲基亚砜作为溶剂。几乎所有的致力于抗皮肤癌外用治疗的芹菜素研究都用二甲基亚砜(DMSO)来作为选择的溶剂，这是因为芹菜素在水（小于0.005毫克/毫升(mg/ml)）和其他水性溶剂中的溶解性较差(Li et al，Evaluation of Apigenin and[G-³H]，Apigenin andanalytical method development, J. of Pharmaceutical Sciences.Vol.86，No.6，June 1997)。

此外，许多黄酮类几乎不溶水和大致所有适用于药物、化妆品和食品添加剂的溶剂中，从而阻碍了其直接用作外用组合物的组分。因此，需要提供一些方法，通过利用可用于外用的、药物的、腹膜的、保健品和医疗食品应用的可接受成分来增强包括黄酮的这些黄酮类的生物利用率。

其他疾病

作为酚类化合物的典型特征，黄酮类可充当有效的抗氧化剂和金属螯合剂。它们也在很久之前就已被公认为具有抗炎、抗诱变、保肝、抗血栓、抗病毒和抗癌的活性。

黄酮和儿茶酚是用于保护人体不受活性氧(ROS)侵害的非常有效的黄酮类。人体细胞和组织不断地受到由自由基和ROS引起的伤害的威胁，所述自由基和ROS在正常的氧代谢中产生，或者由外源损害所诱发。黄酮类在许多动物模型中的抗炎活性已被报导。黄酮/黄酮类如芹菜素、木犀草素、山萘酚、槲皮素、杨梅酮、非瑟酮已被报导具有脂加氧酶(LO)和环加氧酶(COX)的抑制活性(Jachak SM.Natural products:Potential source ofCOXinhibitors.CRIPS 2001;2(1):12-15)。

形成纳米颗粒的方法

Petersen的美国专利申请US2010/0047297公开了用于外用化妆品制剂的化合物如芹菜素的纳米晶体。

Liversidge等人的美国专利5145684公开了通过产生剪切、冲击、气蚀和磨耗力的机械手段来形成药物的纳米晶体的方法。

Bosch等人的美国专利5510118类似地公开了通过产生剪切、冲击、气蚀和磨耗力的机械手段来形成药物的纳米晶体的方法。

Muller等人的美国专利5510118公开了用于形成纳米颗粒悬浮液的高压均质化方法。

美国专利4826689描述了固体的无定形颗粒的制备方法，其中在温度和注入速率的受控条件下向有机液体中的该固体的溶液中注入水性沉淀液，由此控制颗粒尺寸。

固体材料的水性悬浮液可通过机械碎裂来制备，例如通过碾磨。美国专利5145684描述了难溶化合物在水介质中的悬浮液的湿磨法。

在本领域中已经知道，由沉淀直接得到的晶体分散体系会受到溶液搅动的影响。本领域公知各种搅动方法，例如机械混合、振动、微波处理和声波法（例如见于WO01/92293）。搅动可通过包括超声波搅动等的多种技术来实现。得到的晶体通常具有1-6微米的质量中位直径。

US 5314506描述了一种结晶化方法，其中将含有物质的溶液的喷射流与含有该物质的抗溶剂的另一喷射流相互撞击。相比于常规的缓慢结晶化方法，由撞击的喷射流产生的快速混合导致了所形成的晶体的缩小。所公开的最小晶体是大约3微米，而大多数在3到20微米的范围内。

EP 275607描述了一种方法，其中将超声波能量应用在液相中的晶体的悬浮液中，并使用超声波来使预成型晶体碎裂。在通常情况下，所得晶体的体积平均直径为10到40微米。

WO 03/059319描述了小颗粒的形成，其中通过向模板水包油乳状液中加入溶解在与水不相溶的有机溶剂中的药物溶液，然后将该与水不相溶的有机溶剂蒸发掉。然后例如用喷雾干燥法除去水，获得粉末。

美国专利6197349描述了一种形成无定形颗粒的方法，其中通过将结晶化合物熔融并将其与例如为磷脂的稳定剂混合，然后用高压均质化法在升高的温度下将该混合物分散至水中，之后降低温度。

Doseff的PCT/US2006/020905公开了用芹菜素或其衍生物来治疗炎症的方法。

Hammerstone的美国专利申请US 2008/0227829公开了用包括芹菜素的神经性化合物来治疗患者的方法。

Park等人的美国专利申请US2007/0154540公开了使用芹菜素作为软骨再生剂来治疗骨关节炎。

Bing-Hua等人的美国专利申请US2007/0189680公开了芹菜素与治疗剂相结合以用于化学预防和化学治疗。

Lintnera等人的美国专利申请US2006/0067905公开了使用芹菜素作为血管扩张剂以用于治疗脱发。

透明质酸(HA)

透明质酸是广泛遍布于结缔组织、上皮组织和神经组织中的带负电荷的、非硫酸化的糖胺聚糖。它在糖胺聚糖类中是独特的，因为它是非硫酸化的，在质膜中而不是在高尔基体中形成，并且它可以非常大，分子量通常可达到数百万。作为细胞外基质的主要成分中的一种，透明质酸可显著地促进细胞增殖和迁移。

诸如HA的多糖是相对复杂的糖类。多糖是由许多单糖通过糖苷键结合起来而构成的聚合体。因此，糖苷键是较大的、通常为分枝状的大分子。多糖在化妆品和医药应用中很有用处。例如，HA在皮肤应用中被用作结构稳定化填充剂。

Gervasio-Nugent等人的美国专利申请2005/0271692公开了含有黄酮类和透明质酸的外用化妆品组合物。

Morariu的美国专利申请2006/021625公开了用于改善老化皮肤的外观的外用制剂及其使用方法。优选的组分包括例如芹菜素的黄酮类和透明质酸。

表面活性剂

聚山梨醇酯（商业上也称为吐温类）是衍生于聚乙氧基山梨聚糖和脂肪酸的非离子表面活性剂和乳化剂。它们通常用于食品和化妆品中，以使精油在水基产品中增溶。聚山梨醇酯是粘性的、水溶性的淡黄色液体。聚山梨醇酯还可通过减少待乳化物质的表面张力来有助于形成乳状液。聚山梨醇酯被公认具有这样的能力，即有助于一些成分溶解在它们通常情况下不能溶解的溶剂中。聚山梨醇酯用于分散水包油而不是油包水。

通过将多元醇、山梨醇和环氧乙烷反应来制备聚山梨醇酯。聚氧乙烯山梨聚糖随后与从例如硬脂酸、月桂酸和油酸等的植物油脂中获得的脂肪酸进行反应。作为单纯（非聚乙二醇化的）山梨聚糖和脂肪酸的酯的表面活性剂通常称为司盘。

Gupta的美国专利7329797公开了抗衰老化妆品输送系统，包括使用如芹菜素等黄酮类作为抗炎剂和使用聚山梨醇酯表面活性剂作为乳化剂的应用。

Higuchi等人的美国专利申请2006/0229262公开了用于治疗具有耐药菌的传染病的药物组合物，包括作为活性成分的诸如芹菜素的黄酮类和作为乳化剂的聚山梨醇酯。

研究已经证实，芹菜素在减缓哮喘发病的过程中起关键的作用。近来的流行病学研究报道了在黄酮类高摄入的人群中，明显观察到哮喘的低发病率。

鉴于以上所述情况，非常希望将黄酮类、例如芹菜素和木犀草素等黄酮作为外用制剂的一部分以帮助预防和/或治疗由阳光暴晒作用导致的皮肤损害或皮肤癌，并且还提供可用于治疗各种皮肤病症状的皮肤治疗组合物。

发明内容

本发明涉及一种包含水合的微颗粒黄酮类和载体的组合物。通常情况下，该黄酮类在水中的溶解度小于1mg/ml，或小于0.1mg/ml。该微颗粒黄酮类的平均尺寸为200-500纳米，或者有利的是平均尺寸为250纳米。在一个优选的实施方案中，该组合物是药物组合物，而所述载体是药学上可接受的载体。该组合物可包括透明质酸，而载体典型地包括可防止或减少微粒聚集的化合物、分散剂或促渗剂。在一个实施方案中，该组合物是胶体、纳米悬浮液或乳状液的形式。该组合物可以是营养食品、膳食补充剂、食品补充剂或者医疗食品。

本发明的另一个实施方案涉及一种包含黄酮类和例如为表面活性剂的热稳定的黄酮类增溶化合物的组合物，其中所述组合物通过将该黄酮类和该化合物混合至使所述黄酮类溶解在所述化合物中的温度来形成。通常情况下，该组合物进一步包含选自乙醇、异丙醇和苯甲醇、乙氧基二甘醇和二甲基异山梨醇中的醇。在一个优选的实施方案中，该组合物是药物组合物，所述载体是药学上可接受的载体。该组合物可包含透明质酸和/或促渗剂。在一个实施方案中，该组合物是乳状液或微乳状液的形式。该组合物可以是营养食品、膳食补充剂、食品补充剂或者医疗食品。

本发明的另一个实施方案是用于透皮式施加黄酮类的膏药，该膏药由具有两个面的基片组成，第一面具有本发明的组合物和粘合剂，而另一面带有不能渗透到第一面上的组合物和粘合剂的材料。

本发明的另一个实施方案是制备水合黄酮类的方法，包括：将黄酮类与碱金属的氢氧化物混合，以形成碱金属黄酮类盐的水溶液；用酸性剂将碱金属黄酮类盐的水溶液酸化至pH值低于7，以形成水合黄酮类沉淀物，其中，酸化步骤通常在产生具有50-1000纳米、更有利的是200-500纳米的平均尺寸且长宽比测得为大于20的纳米纤维的条件下进行。在酸化步骤之后可以是调节pH值至小于7和过滤沉淀物的步骤。然后可将沉淀物洗涤并干燥。

本发明的另一个实施方案是制备水合黄酮类的方法，包括：将黄酮类溶解在非毒性的有机溶剂中，以形成混合物；以及向混合物中添加水以形成水合黄酮类沉淀物，其中，添加水的步骤在产生具有50-1000纳米、更有利的是200-500纳米的平均尺寸且长宽比测得为大于20的纳米纤维的条件下进行。通常情况下，溶解步骤在比有机溶剂的沸点低约20℃的温度下进行。有机溶剂可选自二甲基异山梨醇、乙氧基二甘醇和二甲基亚砜。

本发明的另一个实施方案是形成水合黄酮类的外用制剂的方法，包括：将黄酮类与碱金属的氢氧化物在水中混合，以形成碱金属黄酮类盐溶液；将碱金属黄酮类盐溶液加入到皮肤病学上可接受的载体中；以及将该制剂的pH值调节至皮肤病学上可接受的pH值（例如4-8），其中，pH值调节步骤在产生具有50-1000纳米的平均尺寸的黄酮类纳米纤维的条件下进行。

本发明的另一个实施方案是制备水合黄酮类的外用制剂的方法，包括：将黄酮类溶解在醇中；将醇溶解的黄酮类加入到皮肤病学上可接受的载体中；调节该制剂的pH值至皮肤病学上可接受的pH值（例如4-8），其中，调节pH步骤在产生具有50-1000纳米的平均尺寸的黄酮类纳米纤维的条件下进行。

一种制备黄酮类外用制剂的方法，包括：将黄酮类加入到乳状液载体中，以形成混合物；加热（例如至大约120°F-170°F）该混合物，直到其具有与水近似的粘度（或者是可以获得分散体系的粘度）；在混合物中形成微粒的分散体系。通常情况下，该乳状液是水包油或者油包水的乳状液，并且该乳状液含有稳定剂、分散剂或表面活性剂，或者另外的稳定剂，以抑制微粒的聚集。在一个实施方案中，形成分散体系的步骤通过超声处理或高压均质化来完成。

本发明的另外一个实施方案是制备增溶的黄酮类组合物的方法，包括：将黄酮类颗粒与诸如表面活性剂的热稳定的黄酮类增溶化合物混合，以形成混合物；加热该混合物至使黄酮类颗粒溶解的温度；以及冷却溶液。在一个优选的实施方案中，热稳定的黄酮类增溶化合物是非离子表面活性剂。通常情况下，在加热混合物的时候进行搅拌，并且添加多达10wt%的黄酮类化合物。在一个优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯。在加热或冷却步骤之后是将溶液加入到皮肤病学的、口服的、可注射的、皮肤膏药或者气雾剂载体中的步骤。通常情况下，向溶液中加入小支链的醇以形成粘度减小的溶液，该醇选自乙醇、异丙醇、苯甲醇、乙氧基二甘醇和二甲基异山梨醇。

本发明还涉及一种减少和/或防止阳光暴晒后果的方法，包括：涂敷治疗有效量的防晒霜制剂于皮肤上，该防晒霜包含水合的或增溶的黄酮类，以及可使黄酮类传输至云角质和上皮的载体。在另一个实施方案中，该制剂还含有矿物氧化物，以提供额外的紫外线阳光暴晒保护。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗阳光暴晒后果的方法，包括在阳光损害的皮肤上涂敷治疗有效量的制剂，该制剂含有水合的或增溶的黄酮类，以及可使黄酮类输送至云角质和上皮的载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及减少哺乳动物患癌症的可能性或治疗哺乳动物的癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予预防性剂量或治疗有效量的本发明的制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物的炎症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的本发明的制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物的诸如痤疮、脱发、皮肤致敏和过敏、干燥皮肤（干燥病、鱼鳞癣）、真菌感染和酒渣鼻、接触性皮肤病等的皮肤疾病或皮肤不适的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的本发明的制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物的诸如银屑病、狼疮、关节炎等的自身免疫疾病的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的本发明的制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗变应性疾病过敏症、哮喘、过敏性皮炎/湿疹的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的本发明的制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物中的TNFα相关疾病或者减少其可能性的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量或预防性量的本发明的黄酮类制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物中的IL-1β相关疾病或者减少其可能性的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量或预防性量的本发明的黄酮类制剂。

本发明的另一个实施方案是形成维生素黄酮的均质固体混合物的方法，包括：将维生素加热至熔化，其中维生素是选自维生素B3、维生素B5以及包含至少一种前述维生素的结合物；将黄酮溶解在熔化的维生素中，以形成维生素黄酮液体混合物；以及冷却该维生素黄酮液体混合物，以形成均质的固体混合物。

附图说明

图1是在10,000X的放大倍率下放大显示了未加工的芹菜素粉末的晶体形状的典型的扫描电子显微镜(SEM)图。

图2显示了未加工的芹菜素粉末的典型的“体积频率”颗粒分布图。

图3显示了未加工的芹菜素的典型的“累积细化体积”颗粒分布图。

图4是水合芹菜素样品的典型的扫描电子显微镜(SEM)图。该典型的水合芹菜素样品展示出来的形态和如图1所示的未加工样品所展示出来的形态有很大差异。

图5和图6是来自3批分别生产的“水相乳液”的颗粒尺寸分布图。几乎所有的芹菜素颗粒都小于1微米。

图7是在水相乳液中含有12.5%黄酮类浓度的芹菜素、木犀草素、芸香苷和槲皮素的“累积颗粒尺寸分布”图。

图8显示了在水中的1.25%的未加工槲皮素相比于通过实施例2中所述方法制备的、包含在水相乳液中的1.25%的“水合芹菜素”的颗粒尺寸分布的比较。

图9是表明了在未加工的聚山梨醇酯80对照样品和热处理的聚山梨醇酯80样品之间的微小化学组成差异的质谱图。

图10是显示了对于含有1.5%芹菜素浓度的几种所施加的外用制剂来说，沉积在人体组织的表皮、真皮和接收液区域的芹菜素含量的图示。

图11是显示了对于含有1.5%芹菜素浓度的几种所施加的外用制剂来说，沉积在鼠科动物组织的表皮、真皮和接收液区域的芹菜素含量的图示。

具体实施方式

本发明涉及黄酮类、制剂、食品补充剂和药物组合物的新形式及其制备和使用方法。

I－本发明的化合物

一些常见的植物黄酮类的化学结构列于表1中。

表1一些常见的植物黄酮类化合物的化学结构

黄酮类包括黄酮（例如芹菜素、木犀草素）、黄酮醇（例如槲皮素、杨梅酮）、二氢黄酮（例如柚皮素、橘皮苷）、黄烷醇（或儿茶酚）（例如表儿茶素、没食子儿茶素）、花色素（例如花青色素、花葵素），以及异黄酮（例如染料木黄酮、大豆甙元）。

芹菜素是黄酮结构种类中的一员，化学上称为4’,5,7-三羟基黄酮。芹菜素具有如下的结构式（式II）：

木犀草素也是黄酮结构种类中的一员，化学上称为3’,4’,5,7-四羟基黄酮。木犀草素具有如下的结构式（式III）：

芹菜素和木犀草素均几乎不溶（即溶解度小于1mg/ml）于水和大致所有适用于药物、化妆品和食品添加剂制剂的溶剂中。

在本文中使用的术语“水合黄酮类”涉及黄酮类的沉淀物，所述沉淀物通过向该黄酮类的碱金属（例如Na⁺或K⁺）盐形式中添加酸来形成，或者通过向增溶于无毒（例如不是DMSO）有机溶剂中的黄酮类中添加水来形成。有利的是，该沉淀物在可产生具有50-1000纳米、更有利的是200-500纳米的平均尺寸且长宽比测得为大于20的纳米纤维的条件下形成。

类似地，在本文中使用的术语“水合黄酮”（例如“水合芹菜素”）涉及黄酮（例如芹菜素）的沉淀物，所述沉淀物通过向黄酮的盐形式（例如芹菜素的盐）中添加酸来形成，或者通过向增溶于无毒的（例如不是DMSO）有机溶剂中的黄酮中添加水来形成。有利的是，该沉淀物在可产生具有50-1000纳米、更有利的是200-500纳米的平均尺寸且长宽比测得为大于20的纳米纤维的条件下形成。

本发明的教导可适用于在水中的溶解度小于1mg/ml、尤其小于0.1mg/ml的难溶性黄酮类化合物。

在一个实施方案中，水合黄酮类是处于孤立的状态，即处于充分纯化的形式，也就是纯度大于95%，优选大于98%，并且最优选大于99%。

II–制备水合黄酮类微粒的方法

在此公开了用于生产例如芹菜素和/或木犀草素的相对不溶于水的黄酮类的水合黄酮类的方法。例如，水合黄酮可包括水合芹菜素、水合木犀草素或其结合物，或者前述水合黄酮中的一种和另外一种黄酮或生物黄酮。这些水合黄酮类的制备导致了黄酮类的提高的生物利用率，允许向各种可接受的药物或化妆品载体、例如含水性醇溶剂中添加黄酮类。

在一个实施方案中，水合黄酮类或黄酮如下所述地形成：将黄酮类与碱金属成分（例如碱金属氢氧化物和/或碱金属盐）混合，以形成碱金属黄酮类盐；用试剂（例如酸性剂）将碱金属黄酮类盐调节（例如酸化）至pH值低于或等于7.5，得到凝胶状的黄酮类沉淀物；将水合黄酮类过滤出来；以及洗涤该水合黄酮类（例如用水、如蒸馏水）以除去碱盐和过量的酸化剂；以及可选地干燥该水合黄酮类。

为形成精细的亚微米颗粒，需要控制酸化的过程。这包括酸化剂的快速加入和将酸化剂与碱性黄酮类盐溶液混合，直至微颗粒均匀地分散。酸化剂与碱盐溶液的混合优选在1到10℃的温度下进行，这样可使混合时间与沉淀时间之比率最小（该比率优选为1-5，最优选为1-2）。这些比率有助于增加成核速率和限制晶体生长的速率。一般地，该微颗粒水合黄酮类具有50-1000、优选200-500纳米的平均尺寸，例如平均为250nm。

示例性的黄酮包括例如芹菜素、木犀草素或其结合物。因此，该方法可制备包括水合芹菜素、水合木犀草素或其结合物的水合黄酮。

示例性的碱金属氢氧化物包括氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化锂(LiOH)，以及包含至少一种前述氢氧化物的结合物。

示例性的碱金属盐包括柠檬酸盐（例如柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸锂）和碳酸盐（例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂），以及包含至少一种前述盐的结合物。

水合黄酮类和水合黄酮由于其抗癌、抗氧化、抗炎、UV皮肤保护和其他优良的活性而格外适合作为外用的、口服的和可注射的制剂的添加剂。

过滤

意想不到的是，发现当溶液的pH被酸化至pH值小于7、优选小于6时，从溶液中分离出水合黄酮类沉淀物的过滤过程可相对容易地完成，而不用添加表面活性剂/分散剂。在这些条件下，几乎所有的纳米颗粒（或纳米纤维）被截留在2微米的过滤器上，使得相对而言少量的纳米纤维出现在滤出液中。如果沉淀过程在弱碱性的pH值和在表面活性剂/分散剂的存在下进行，则在从液体溶液中分离水合黄酮类时会遇到困难。

纳米颗粒的过滤先前被用来纯化纳米颗粒分散体系；然而，滤出液的移除速率被限制在小于0.05ml/min*cm²，而分散体系只以~1/5的因子被浓缩。较长的过滤时间可通过奥斯特瓦尔德熟化和凝结而允许颗粒生长。从分散溶液中可得到过滤速率大于1ml/min*cm²，并且具有凝胶状水合黄酮类沉淀物的1/15的浓缩因子。

从纳米颗粒中完全除去分散介质通常需要分离过程，如离心、冻干（冷冻干燥）和/或闪蒸喷雾干燥处理。对于本发明的几种应用/制剂来说，水合黄酮/黄酮类沉淀物直接加入到化妆品和保健品制剂中，而不用进一步处理以完全除去残留的水含量。

本发明满足了有效除去分散介质的需要，不需采取额外的蒸发或其他处理方法来为不需要完全除水的应用作进一步地除水。在本发明之前，纳米颗粒从溶液中复原和固态下的纳米晶体的进一步处理是一项艰巨的挑战。本发明为颗粒复原和溶剂移除提供了新颖和快速的技术，以用于后续处理。因此，不需要包括喷雾干燥、冷冻干燥和超滤的用于移除溶剂和分散媒介的常用技术。

通过机械法的纳米颗粒的生产

高压均质化法

高压均质化法(HPH)是在含有难溶于水的颗粒的悬浮液中制备亚微米尺寸的颗粒的机械方法。形成纳米悬浮液的原理是基于在高压均质器中产生的空化力。所获得的颗粒尺寸缩减基于几个因素，包括颗粒的性质、所施加的处理压力和循环数。

在本发明的一个实施方案中：(1)将小于20微米的黄酮类颗粒分散到稳定剂溶液中，以形成悬浮液；和(2)将悬浮液在高压下进行几个周期的均质化，直至制备出具有所期望尺寸的纳米悬浮液。在均质化过程中，颗粒被空化效应、高剪切力和颗粒之间的碰撞所碎裂。在均质化的间隙中，在室温下低于流体沸点的情况下，流体的动压随着静压的同时减小而增大。因此，液体在室温下开始沸腾并形成气泡，当悬浮液离开间隙且达到正常气压时，气泡将会内爆。内爆力大得足以将微粒分解成纳米颗粒。见以下的实施例18。

声裂法

由声裂法产生的分散和松团作用是超声波空化效应的结果。当使液体处于超声下时，传播进入液体的声波会导致交替的高压和低压循环。这将机械应力施加到单个颗粒之间的吸引力上。液体中的超声波空化效应促成了高达1000km/hr（大约600mph）的高速液体射流。这种射流推压颗粒之间的高压液体，从而将其彼此分开。较小的颗粒被液体射流加速，然后在高速下碰撞。这使得超声成为分散和碾磨微米尺寸和亚微米尺寸颗粒的有效方法。见如下的实施例17。

这种简单的声裂加工处理对黄酮类的保健品和药物应用很有价值。

生产纳米颗粒的其他方法包括如美国专利4826689和5314506所述的微沉淀法；如WO 01/92293、WO 96/32095、WO 00/44468和WO 00/38811所述的溶剂/反溶剂法；以及如WO 98/32095和WO 99/59709所述的熔化乳化法。

III–制备黄酮类制剂的方法

A.制备微粒黄酮类制剂的方法

在本发明的一个实施方案中，将诸如芹菜素的黄酮类以其盐的形式装载到载体中，该盐可溶于水相中，然后当搅动该制剂时pH值下降。当体系的pH值下降时，该黄酮类（例如芹菜素）开始以细密分散的微颗粒的形式沉淀出来。将pH值调至皮肤病学可接受的水平，即对皮肤无毒和无刺激。持续的搅动防止黄酮类形成大的晶体，并防止其聚集。最终的体系包含制剂中的可溶的和分散的微颗粒的黄酮类（例如芹菜素）。

悬浮的微颗粒形式可以渗透皮肤层，因此可作为储存器以用于补充已被消耗的溶解黄酮类、例如芹菜素，从而保持恒定的黄酮类的生物利用率。

本发明的另一个实施方案是制备组合物的方法，包括：将黄酮类溶解在无毒有机溶剂（非DMSO）、例如乙醇中；把产物加入到载体、例如皮肤病学上可接受的载体中，以形成含黄酮类的制剂；可选地，将制剂的pH值调节至4到8；以及混合该组合物，以便分散（例如均匀地分散以免形成潜在的聚集）黄酮类。

可用多种方法来制备制剂，例如：

1）将黄酮类形式溶解在水基溶剂（例如乙氧基二甘醇和/或二甲基异山梨醇）中，并作为外用运载体(vehicle)的组分被添加。

2）加入碱金属黄酮类盐作为运载体的组分，然后酸化至皮肤病学上可接受的pH值，即通常接近中性的pH值，产生增溶的黄酮类和分散的微颗粒的黄酮类。

另外一个实施方案是方法1和2的结合。

可通过顺序的添加来将制剂的各成分相结合，可以按一定顺序或不按顺序添加，随后搅拌，以形成混合物。例如，通常将水溶性的成分相结合，以形成水相，而通常将在水相中不易混合的成分相结合，以形成油相。之后，可将该两相乳化，然后将其结合。备选地，组合物可通过例如在一锅法系统中的掺合来制备。

生产组合物的方法可包括：将黄酮类溶解在溶剂中，以形成溶液；以及将该溶液加入到运载体中，以形成制剂。例如可在用力搅拌的同时将溶液加入到运载体中，这样可将所溶解的水合黄酮类均匀地分散在运载体中。

如果随着在溶剂或溶剂混合物中的溶解黄酮类的增加，超过了给定制剂中的黄酮类、例如芹菜素的溶解度极限，那么就会形成分散的微颗粒。载体中的分散剂、表面活性剂和/或聚合物增稠剂可减少微颗粒的聚集。

在通常情况下，当制剂的pH水平由弱碱性（pH值大约为8（例如pH值为7-9））减小到适度的酸性（pH值大约为4（例如pH值为3.5-5））时，例如芹菜素的黄酮类的悬浮和分散的微颗粒形式与运载体中的溶解形式之比会增大。

可通过将黄酮类增溶在醇中以形成浓缩的醇增溶溶液，并在调节pH值至5-8之前将浓缩的醇增溶溶液加入到运载体中来制备制剂。有利的是，在加入醇增溶溶液时，充分混合运载体以便均匀地分散黄酮类。任选地，该方法还可进一步包括向增溶溶液和/或运载体中加入添加剂。

在乳化载体的减小粘度下的原位法

先前的实践要求通过多种加工方法来首先形成亚微米颗粒，所述方法包括机械法（珠磨法、高压均质化法(HPH)）、沉淀法等。并且，在被纳入外用制剂中之前，需要用耗时、昂贵的过滤、蒸发技术（闪蒸干燥、冷冻干燥等）从亚微米尺寸颗粒中分离液体介质。

在本发明的另一个实施方案中，将未加工的芹菜素粉末或另一种相对不溶性的黄酮类直接加入到水包油或油包水的乳状液中，然后通过声裂法和/或HPH技术进行加工，以得到微颗粒的分散体系。该方法的要求是，乳状液的声裂法和/或HPH处理是在高温中进行的，使得液体混合物的粘度被减小到大约为水的粘度水平。当在约120°F-170°F的温度下对液体混合物进行超声处理时，可形成精细的亚微米颗粒。此外，乳化剂的稳定化添加剂如分散剂、表面活性剂和其他稳定剂用于抑制进一步的潜在的颗粒聚集。这种原位加工法省去了为获得在包括外用制剂的制剂中的亚微米尺寸颗粒的昂贵和耗时的加工步骤。见实施例20。

B.制备增溶的黄酮类制剂的方法

本发明涉及用热稳定的无毒的黄酮类增溶化合物来显著增加相对不溶于水的黄酮类的溶解性浓度的方法，所述化合物例如为包括聚山梨醇酯的非离子表面活性剂化合物，所述方法包括如下步骤：

a）将黄酮类化合物混合于热稳定的黄酮类增溶化合物中，以形成混合物；

b）在搅拌的同时加热混合物至黄酮类化合物颗粒被增溶的温度，所得的混合物形成透明的溶液；和

c）冷却增溶的黄酮类溶液。

在其他实施方案中，在步骤b）或c）之后进行将增溶的黄酮类混合物加入到皮肤病学的、口服的、可注射的、皮肤膏药的或气雾剂的载体中的步骤。

在另一个实施方案中是向增溶的黄酮类混合物中添加诸如乙醇的醇以形成具有减小粘度的可溶黄酮类溶液的步骤。用以减小增溶的黄酮类混合物的粘度水平的其他有利溶剂包括小支链的醇，例如异丙醇、苯甲醇、乙氧基二甘醇和二甲基异山梨醇。

在此所使用的“热稳定的黄酮类增溶化合物”是这样的化合物，其在至少高达200℃时保持稳定，并且当与黄酮类混合时在热处理（加热）下使黄酮类增溶，在冷却至环境温度下继续使黄酮类增溶。有利的是，黄酮类增溶化合物能够使黄酮类在环境温度下在延长的时间内持续地增溶。

除了聚山梨醇酯，可采用本发明的高温法以提高黄酮类的溶解性浓度水平的其他热稳定（即在高达200℃或更高温度下稳定）的增溶化合物包括：超支化或树枝状聚乙烯氧化物聚合物（包括山梨聚糖聚乙烯氧化物树形聚合物）、超支化聚乙烯乙二醇、超支化聚丙烯乙二醇、乙氧基脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙烯乙二醇酯、失水山梨醇酯及其乙氧基化衍生物、脂肪酸的乙二醇酯，以及脂肪胺乙氧基化物。

芹菜素/聚山梨醇酯80制剂可如下地制备：

·将芹菜素粉末和粘性的液体聚山梨醇酯80以大约5-10wt%的芹菜素对应于95-90wt%的聚山梨醇酯80的比例进行混合。任选地加入少量的（5-10wt%）去离子水和可选的丙酮和/或乙醇，以促进混合物的掺和。

·充分搅拌该混合物，以形成浓稠的糊状掺合物。

·然后在搅拌的同时将混合物缓慢加热至相对较高的温度（大约100-150℃）。随着加热，水和存在于聚山梨醇酯80中的挥发性成分通过煮沸而被除掉。

·在移除挥发物以及加热至超过约200-300℃的温度后，得到深褐色的透明液体，使得所有的固体芹菜素都被增溶在聚山梨醇酯80混合物中。

·在冷却至环境温度后，得到浓稠的粘性褐色液体。芹菜素的含量越高，得到的颜色就越深。

·基于在粘性的芹菜素聚山梨醇酯80液体中的芹菜素的4.05%的浓度，芹菜素的含量是40.5mg/ml或40500ppm。

未预料到的是，高温水平对于带来芹菜素和其他相对不溶于水的黄酮类的高溶解度水平是必要的。

在醇溶液中使用芹菜素/聚山梨醇酯80可以将芹菜素和其他相对不溶的黄酮类输送至所期望的目标位置。本发明包括将具有适当平衡量的极性特征的热稳定化合物、例如表面活性剂与其他黄酮类化合物结合，来获得该其他黄酮类的提高的浓度水平的方法。实施例14和15给出了其他黄酮类和聚山梨醇酯的制剂。

在实施例21中，本发明制剂向表皮和真皮皮肤层输送了显著的芹菜素浓度。

III本发明的黄酮类制剂

本发明包括配制具有广泛应用的黄酮类的多种方法。在此所使用的术语“药物组合物”或“药物制剂”指这样一种组合物，其中组合物或制剂的成分是药物级的。

表II列出了各种可作为输送目标黄酮类制剂的手段的剂量类型和形式。

制剂可方便地存在于单位剂型中，并可通过制药领域中已知的方法制备。制剂可用于扩散增强的化合物的快速或缓慢或可控的释放。缓释系统（也称为延时释放、可控释放等）相比于相同药物的其他制剂的优势在于，定量给药的频率可以减小，并且全身药物浓度在更长的持续时间内平稳。本发明的组合物的合适剂量将取决于所给化合物的新陈代谢和被治疗疾病的严重程度。

A.微颗粒黄酮类制剂

包括芹菜素和木犀草素的许多黄酮类几乎不溶于水和大致所有适合用于药物、化妆品和食品添加剂制剂的溶剂中。已经证明，在形成水合黄酮类中所使用的方法可导致能增强生物利用率的高度分散的微颗粒胶态悬浮液的形成。

局部给药

在此所公开的是将黄酮类配制成为外用制剂的方法，包括将黄酮类的精细微颗粒分散于外用制剂之中的方法。

在此提供的是用于治疗皮肤（包括人类皮肤和动物皮肤）的保护性和治疗性的外用制剂。这种制剂含有足量的微颗粒黄酮类（例如芹菜素和/或木犀草素）以达到预期的目的（例如足够的量输送进入皮肤中充当生物活性剂来预防和/或治疗皮肤癌）。所希望的芹菜素和/或木犀草素的具体量可取决于所用辅助成分的浓度和类型、使用者的皮肤状况，以及使用者皮肤损伤的严重程度和范围。

制剂可以是如下形式的外用组合物：喷雾、乳液、皂、膏霜、软膏、糊浆、乳剂（例如油包水乳状液、水包油乳状液、微乳液、纳米颗粒的乳状液）、胶体、悬浮剂（例如纳米颗粒的悬浮液）、粉剂、凝胶、泡沫、无水组合物等等，以及包含至少一种前述形式的结合物。制剂例如可为能够使黄酮类水合物（和该外用制剂的其他活性成分）与皮肤表面之间接触的任一种形式。见下面题为“运载剂和载体及添加剂”的章节。在此所用的术语“w/o/w乳状液”指双重乳状液，也称水包油包水乳状液，其中包住水(W)滴的油(O)滴分散在水中(W)。在此所用的术语“o/w乳状液”指油(O)滴分散在水(W)中的乳状液，也称水包油乳状液。

透皮给药

本发明包括透皮的药物输送方法，包括含有相对不溶黄酮类的纳米级颗粒的外用制剂。使用浸渍于水包油外用乳状液中的芹菜素纳米级颗粒的体外皮肤渗透测试表明，在表皮层和真皮层中沉积着出人意料的高浓度的芹菜素。在下面的章节B中将讨论适于微颗粒黄酮类的典型透皮制剂。也见实施例21。

口服给药

当制备黄酮类用于口服给药时，通常将其与药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂相结合，以形成药物制剂或单位剂型。为了口服给药，黄酮类可以粉剂、颗粒剂、汤剂、悬浮剂、乳状液的形式存在，或者存在于天然的或合成的聚合物或树脂中，以便从口香糖中摄取活性成分。

口服给药的黄酮类也可以配制成缓释的，例如可将黄酮类涂布、装入微胶囊中或置于缓释装置中。这种制剂中总活性成分占制剂重量的0.01-10%。

含有黄酮类的药物制剂可通过本领域已知的程序、使用公知的并可容易获得的成分来制备。例如，黄酮类可与常见的赋形剂、稀释剂或载体配制，然后形成例如片剂、胶囊、汤剂、悬浮剂、粉剂、烟雾剂等剂型。所有这些剂型均可用于快速释放、延时释放或肠溶释放。这些还可以用于口或舌下或颊输送。适用于这种制剂的赋形剂、稀释剂和载体的例子包括填充剂和增量剂，例如淀粉、纤维素、糖类、甘露醇和硅衍生物。也可以包括粘合剂，例如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶，以及聚乙烯吡咯烷酮。可以包括增湿剂如丙三醇，崩解剂如碳酸钙和重碳酸钠。还可包括延缓分解的试剂，例如石蜡。还可以包含例如为季铵化合物的吸收促进剂。可包含诸如鲸蜡醇和丙三醇单硬脂酸酯的表面活性剂。可加入诸如高岭土和膨润土的吸附载体。也可包含例如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁以及固体聚乙二醇的润滑剂。

本发明的组合物还可以含有诸如纤维素和/或纤维素衍生物的增稠剂。它们还可以含有树胶，例如黄原胶、瓜尔豆胶或阿拉伯胶，或者作为备选的聚乙烯乙二醇、膨润土等等。

例如，含有黄酮类的片剂或囊片可包含诸如碳酸钙、氧化镁和碳酸镁的缓冲剂。囊片和片剂还可以包含非活性成分，例如纤维素、预胶化淀粉、二氧化硅、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、淀粉、滑石、二氧化钛、安息香酸、柠檬酸、玉米淀粉、矿物油、聚丙烯乙二醇、磷酸钠、硬脂酸锌等等。含有黄酮类的硬或软的明胶胶囊可含有非活性成分，例如明胶、微晶纤维素、甘油、十二烷基硫酸钠、淀粉、滑石和二氧化钛等，以及例如为聚乙烯乙二醇(PEG)和植物油的液体运载体。此外，含有黄酮类的肠溶涂布的囊片或片剂设计成可在胃中抗分解，而在十二指肠的较为中性至碱性的环境中溶解，其通常涂布有醋酸纤维素衍生物。

黄酮类也可以配制成用于方便地口服给药的酏剂或汤剂。黄酮类的药物制剂也可采用含水或无水溶液或分散体系的形式，或者备选地采用乳状液或悬浮液的形式。

肠胃外给药

在下面的章节B中讨论微颗粒黄酮类的典型的肠胃外制剂。

吸入式给药

黄酮类也可以向呼吸道给药。对于吸入法或吹入法给药，在此所公开的黄酮类组合物可以采用干粉的形式，例如为治疗药剂和诸如乳糖或淀粉的合适粉末基质的粉末混合物。该粉末组合物可存在于例如胶囊剂或药筒，或者例如明胶或泡罩包装的单元剂型中，粉末可通过吸入器、吹入器或计量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI)而从中给出。

当以气雾剂或用点滴器给药时，黄酮类还可以存在于水溶液中来给药。因此，其他气雾剂药物制剂可包括例如含有大约0.01-10%的所公开的黄酮类成分的生理学上可接受的缓冲盐溶液。液体制剂也可以含有例如甲基苯甲酸酯、丙基苯甲酸酯和苯扎氯铵等的防腐剂，例如磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的缓冲剂，例如甘露醇、氯化钠等的渗透压调节剂，例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠等的抗氧化剂，以及例如D&C黄色10号、FD&C黄色6号等的色素。以精细分开的不溶解的或悬浮于液体中的固体黄酮类颗粒形式的干气溶胶在本发明的实践中也是有用的。黄酮类可配制成扑粉，包含精细分开的颗粒。

对于通过吸入法向较高的（鼻腔）或较低的呼吸道给药，可从喷雾器或加压包或其他输送气雾剂喷雾的方便手段中方便地输送黄酮类。加压包可包括合适的推进物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况中，剂量单位可通过提供阀来输送被计量的量来确定。也可以通过使用喷雾器来输送产品。

对于鼻内给药，治疗剂也可通过滴鼻剂、液体喷雾的形式给药，例如通过塑料瓶雾化器或定量吸入器。典型的雾化器有Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。

栓剂制剂

此外，黄酮类非常适合于包括直肠和阴道栓剂的剂型。药物栓剂制剂可包含例如可可脂和产于植物油的基质的疏水基质，以及例如明胶甘油和聚乙二醇的亲水基质。

B.增溶的黄酮类制剂

在此所公开的是用于显著增加相对不溶于水的黄酮类在热稳定的黄酮类增溶化合物中的溶解性浓度以提高浓度水平（例如在环境温度下达到大约10wt%）的方法。增溶的黄酮类可添加到可接受的外用的、皮下的、口服的、腹膜的、气雾的和保健品的制剂中。

除了聚山梨醇酯，可使用本发明的高温方法以提高黄酮类的溶解度浓度水平的其他热稳定（即在达到200℃或以上的温度下稳定）的增溶化合物包括：超支化或树枝状聚乙烯氧化物聚合物（包括山梨糖醇聚乙烯氧化物树枝状高分子）、超支化聚乙烯乙二醇、超支化聚丙烯乙二醇、乙氧基脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙烯乙二醇酯、去水山梨醇酯及其乙氧基化衍生物、脂肪酸的乙二醇酯，以及脂肪胺乙氧基化物。

表面活性剂

山梨聚糖的脂肪酸酯（通常称为司盘）及其乙氧基化衍生物（通常称为聚山梨醇酯）可能是最常用的非离子表面活性剂。它们可单独使用，或相结合（例如聚山梨醇酯80和司盘80）使用以形成混合胶束。山梨糖醇酯不溶于水，但溶于多数有机溶剂（低亲水亲油平衡(HLB)数表面活性剂）。乙氧基化产物一般溶于水，并且具有相对较高的HLB数。这些非离子表面活性剂可单独使用，或以适当结合的形式使用以形成具有所需HLB的混合胶束。山梨糖醇酯及其乙氧基化衍生物的一个主要的优点是，它们能够作为食物添加剂使用。它们还可以用在化妆品和药物的制备中。

可采用本发明的高温方法以用于增加具有小于1mg/ml的在水中的溶解度的黄酮类的溶解性浓度水平的非离子表面活性剂化合物包括：乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙烯乙二醇酯、去水山梨醇酯及其乙氧基化衍生物、脂肪酸的乙二醇酯和脂肪胺乙氧基化物。

最常用的非离子表面活性剂是基于乙烯氧化物的，它们称为乙氧基化表面活性剂。可分为几类：醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、脂肪酸乙氧基化物、单烷基醇酰胺乙氧基化物、山梨糖醇酯及其乙氧基化衍生物、乙氧基化物、脂肪胺乙氧基化物，以及乙烯氧化物-丙烯氧化物共聚物（有时称为聚合物表面活性剂）。另一类重要的非离子表面活性剂是多羟基产品，例如乙二醇酯、丙三醇酯（以及聚丙三醇）、葡糖苷（以及聚葡糖苷）及蔗糖酯。胺氧化物和亚磺酰表面活性剂代表具有小端基的非离子表面活性剂M.J. Schick(ed):Nonionic Surfactants:Physical Chemistry，Marcel Dekker，New York,1987)。

聚山梨醇酯

聚山梨醇酯是在一些药物或食品的制备中所使用的一类乳化剂。它们经常用于化妆品中，以使精油增溶于水基产品之中。聚山梨醇酯是衍生于用脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖（山梨糖醇的衍生物）的油质液体。作为单纯的（非PEG化的）山梨聚糖和脂肪酸的酯的表面活性剂通常称为司盘。

·聚山梨醇酯20（聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯）

·聚山梨醇酯40（聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯）

·聚山梨醇酯60（聚氧乙烯(20)山梨聚糖单硬脂酸酯）

·聚山梨醇酯80（聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯）

在聚氧乙烯部分后面的数字20表示分子中氧乙烯-(CH₂CH₂O)-基团的总数。在聚山梨醇酯部分后面的数字与和分子的聚氧乙烯山梨聚糖部分缔合的脂肪酸的类型有关。单月桂酸酯用20表示，单棕榈酸酯用40表示，单硬脂酸酯用60表示，单油酸酯用80表示。在它们的司盘对应物的后面附随相同的数字（司盘20、司盘40、司盘60和司盘80）。

本发明包括用聚山梨醇酯增加相对不溶于水的黄酮类的溶解性浓度的方法。如前所述，许多黄酮类、尤其是芹菜素相对不溶于水溶液，因此严重限制了它们在外用的、药物的和保健品的应用中的生物利用率。

本发明包括通过使用表面活性剂化合物、尤其是聚山梨醇酯80、60、40和20来增加多酚的水相溶解度水平的方法。应该指出的是，在该例子中，聚山梨醇酯20、40和60代表聚山梨醇酯和不同的饱和脂肪酸的同源系列。脂肪酸链中的碳的数量从12（聚山梨醇酯20）增加到18（聚山梨醇酯60）。聚山梨醇酯80是具有18个碳的链长度的不饱和脂肪酸（油酸酯）。这些例子并不全面，本领域的技术人员应意识到带有任何其他脂肪酸的这些类型的非离子表面活性剂，以及诸如脂肪酸的聚氧乙烯烷基醚的其他种类的其他非离子表面活性剂的有用性。还需指出的是，也可以单独使用诸如多库酯钠或十二烷基硫酸钠的阴离子表面活性剂或诸如溴棕三甲铵或苄索氯铵的阳离子表面活性剂，或者将其与非离子表面活性剂结合起来使用。对于多种相对不溶于水的多酚，已获得超过两个以上数量级的显著的水相增强。

具有高黄酮类浓度的新颖制剂可用于口服的、吸入的、外用的、腹膜的、栓剂的和保健品的应用。该运载体尤其适用于针对自身免疫性疾病和癌症的腹膜灌注。向饮料（尤其是酒精类饮料）中添加芹菜素PS-80可作为口服输送低溶解浓度的有益的黄酮类的手段。

在一个优选的实施方案中，制剂包含诸如乙醇的醇类，以形成具有减小粘度的可溶的黄酮类溶液。用于减小增溶的黄酮类混合物的粘度水平的其他有利的溶剂包括小链醇，例如异丙醇、苯甲醇、乙氧基二甘醇和二甲基异山梨醇。

外用给药

增溶黄酮类的局部给药典型地以乳液、膏霜、凝胶或软膏的形式来完成。

透皮的黄酮类输送

用于增加黄酮类在非离子表面活性剂溶剂中的溶解度水平的所述方法实现了通过可控速率下的渗透而进入系统循环中的透皮的黄酮类输送(TFD)。本发明的制剂通过解决有关皮肤所固有的低渗透性的问题而提供了非侵入式的给药路径。皮肤对于药物渗透而言是良好的屏障。渗透促进剂的掺入可通过改变角质层的屏障特性而有助于药物的吸收。在外用的、口服的和腹膜的应用中，诸如聚山梨醇酯80的多种非离子表面活性剂被认为是药理学上惰性的、无毒的、无刺激性的、无过敏性的、无臭的、与多数药物和赋形剂兼容的，并且具有良好的溶剂特性。

渗透促进剂

在过去的二十年中已开发了包括单醇类和多醇类（乙醇、丙烯乙二醇）、表面活性剂（吐温、司盘）、脂肪酸（油酸）、胺类和酰胺类（氮酮、N-甲基吡咯烷酮）、萜烯（柠檬烯）、硫氧化物（二甲基亚砜）、酯类（十四酸异丙酯）的不同种类的渗透促进剂(FrenchE, Potton C, Walters K.Pharmaceutical skin penetration enhancement.In:Walters K,Hadgraft J, editors.New York：Marcel Dekker;1993.p.113-44)。

微乳液

为了促进皮肤渗透的另外一种制剂方法是制备微乳液。微乳液由水、油和表面活性剂组成，产生透明的、热力学稳定的液体。微乳液的特性包括光学透明性、热力学稳定性，以及疏水成分和亲水成分的溶解性。微乳液是油、水和表面活性剂以及还常常结合有助表面活性剂的清澈的、稳定的、均质的液体混合物。水相可含有盐和/或其他成分，而“油”实际上是不同的烃类和烯烃类的复杂混合物。相比于普通的乳状液，微乳液经过组分的简单混合而形成，不需要通常用于形成普通乳状液的高剪切条件。微乳液的两种基本类型是直接型（油分散在水中，o/w）和反向型（水分散在油中，w/o）。

来自微乳液的渗透增强可归因于药物浓度的增加，其提供了从运载体到皮肤的大的浓度梯度。含有提高的黄酮类浓度的非离子表面活性剂溶剂（如这里所述）十分适合用于透皮的、口服的和腹膜的应用的微乳液的制备。

在一个实施方案中，将含有芹菜素的微乳液溶解在聚山梨醇酯80、水和作为助表面活性剂的乙醇以及十四酸异丙酯(IPM)的油相中。该实施方案具有外用的应用（这是由于皮肤的渗透特性），还有口服、注射和鼻喷雾的应用。

本发明所公开的制剂实现了用于黄酮类的增强的透皮药物输送的方法。特别令人关注的是所公开的增溶于非离子表面活性剂混合物中的相对不溶于水的包括芹菜素的黄酮类的制剂。用人类皮肤和老鼠皮肤的体外皮肤渗透试验证明了出乎意料地多的芹菜素沉积于表皮和真皮层内，这是由于使用了所公开的非离子表面活性剂混合物。见实施例21。

透皮膏药

有助于相对不溶的黄酮类的透皮药物输送的是，使用含有处于用醇、例如相对易挥发的乙醇所稀释的非离子表面活性剂中的增溶黄酮类的透皮膏药。当用于皮肤时，膏药的外侧无孔膜障用于减少相对易挥发的醇的蒸发，从而允许增加黄酮类的渗透和输送。当应用于皮肤表面或者包含在透皮膏药之中时，用于化妆品和食品应用中的其他溶剂稀释剂，例如醇类（即乙醇、乙二醇、乙氧基二甘醇等）、酯类（二甲基异山梨醇等），能够减小相对粘性的非离子表面活性剂的粘度，从而增加皮肤渗透的速率和深度。特别地，对皮肤膏药和透皮膏药有用的是黄酮类微乳液制剂的使用。该制剂由水包油和油包水型的微乳液构成。

透皮膏药可分为两种输送系统类型：储库型和骨架型。两者的组成相似，只是在储库系统中使用薄膜来控制输送。所用薄膜的例子包括聚丙烯、低密度聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物等。在骨架型制剂中，药物可以分散/溶解在粘合剂中。两种常用的粘合剂种类包括丙烯酸酯和硅酮基材料。压力敏感型丙烯酸酯粘合剂的例子包括但不限于

系列（美国Henkel公司）。压力敏感型硅酮粘合剂包括但不限于系列（美国Dow Corning公司）。表III概括了关于一些具体的丙烯酸酯和硅酮基压力敏感型粘合剂的附加信息。

表III丙烯酸酯和硅酮基压力敏感型粘合剂的概要

本领域技术人员知道的溶剂和渗透促进剂也可以包含在组合物中。潜在的，溶剂/促进剂可包括但不限于脂肪酸类（油酸）、酯类（十四酸异丙酯）、醇类（乙醇和异丙醇）和二醇类（丙烯乙二醇、己烯乙二醇）。其他成分可包括抗氧化剂（例如BHT和BHA）或螯合剂（例如柠檬酸）。

口服给药

本发明的制剂也可以通过口服给药。对于口服给药，在此所公开的黄酮类组合物可以是丸剂、胶囊、悬浮剂或汤剂的形式。对于口服给药，在此所公开的黄酮类组合物可以是任何口服上可接受的剂量，包括但不限于胶囊、乳剂、微乳剂和水性悬浮剂、汤剂、分散剂、微胶囊、丸剂、粉剂和颗粒剂。用于增溶黄酮类的典型口服制剂已在上述的章节A中论述。

肠胃外给药

本发明的制剂还可以不经肠胃地给药。对于肠胃外给药，在此所公开的黄酮类组合物可以是可注射溶液或悬浮液、例如盐溶液的形式。在此所使用的术语“肠胃外”包括静脉内的、皮下的、肌肉的、滑膜内的、胸骨内的、病灶内的和颅内的注射或灌注技术。典型的制剂包括乳剂和微乳剂。包括乳剂的可注射制剂通常由用于注射的纯化水、有机助溶剂、表面活性剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂和pH调节剂的混合物构成。说明每一个类别的成分的例子如下，但不限于如下：

助溶剂

丙烯乙二醇、乙醇、甘油、聚乙烯乙二醇、苯甲醇、植物油、大豆油、红花油、棉籽油、玉米油、花生油、向日葵油、花生属植物油、蓖麻油、橄榄油、诸如单甘油二酯或单甘油三酯的中等链或长链脂肪酸的酯、油酸乙酯、十四酸异丙酯、辛醇、聚氧氢化蓖麻油、磷脂及其结合物。

表面活性剂

聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物、磷脂和聚山梨醇酯通常被用作合成的非离子表面活性剂。

悬浮剂

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素钠和右旋糖酐。

防腐剂

乙二胺四乙酸二钠、苯甲酸钠、苯扎氯铵、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

抗氧化剂

抗坏血酸、丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、硫代硫酸钠。

pH调节剂

氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、醋酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和磷酸。

吸入给药

本发明的制剂也可以通过吸入的方式给药。对于吸入给药，在此所公开的黄酮类组合物可以是气雾剂的形式，所述气雾剂将黄酮类成分以气体中的细微液滴悬浮液的形式向口部或鼻道输送。蒸发器和吸入装置可促进黄酮类成分的输送。增溶的黄酮类的典型吸入制剂已在上述的章节A中论述。

吸入给药

黄酮类也可以通过呼吸道来给药。

IV运载体和载体

除了黄酮类，制剂还包含运载体，例如“药物学上可接受的”或者化妆品上或者“皮肤病学上可接受的”载体/运载体。“药物学上可接受的载体”不会显著地不利影响活性剂的药物活性，在为了输送有效剂量的活性成分而给予足够剂量时对其受体没有毒害或不适当的伤害且是无毒性的，并且载体（稀释剂、赋形剂和/或盐等）与制剂的其他成分是相容的。同样，“皮肤病学上可接受的载体”具有相同的性质。

皮肤病学上可接受的载体典型地包括那些在化学上和物理上与黄酮类兼容的、在适当的保质期内稳定、以及可促进活性成分渗透进入皮肤里（例如到达表皮和/或真皮）的成分。任选地，皮肤病学上的载体含有有助于便于涂敷并具有令人愉悦的美学属性（颜色、气味、感觉等）的成分。

相应于药物输送概况的制剂目标取决于外用产品的预期用途。对于防晒霜、抗真菌剂和角质软化剂制剂，希望得到增强的药物输送和在角质层（皮肤的较外层）中的存留。相反，目的在于调整皮肤的生理机能的外用制剂要求药物沉积在和经常穿过皮肤的较低层（有活性的表皮和真皮）。

运载体例如可为存在于制剂中的其他材料充当稀释剂、分散剂和/或载体（例如在组合物涂敷在皮肤上时促进其分布）。一些示例性的运载体包括：有机组分（例如醇类、油类等）、水基溶剂（例如那些可以溶解或分散活性黄酮成分的水基溶剂，其例如处在适于治疗处理中使用的浓度下）。

更具体地说，运载体可以包括乙醇、异丙醇、苯甲醇、乙二醇（例如聚乙烯乙二醇、丙烯乙二醇、乙氧基二甘醇等）、油类（例如葡萄籽、希蒙得木、椰子、芝麻、矿物等）、丙三醇、脂肪酸酯、二甲基异山梨醇，以及包含至少一种前述载体的结合物。可选择它们来在所需的浓度下溶解或分散活性成分的胶状微颗粒，换句话说，可接受的载体是指在其中活性成分（包括黄酮类和/或水合黄酮类）以微颗粒的形式被溶解和/或分散和悬浮的载体。

运载体可以以基于制剂的总重量为小于或等于99.99wt%、尤其是80wt%-99.99wt%的量存在于制剂中，可以是如上所述的所需最终制剂的各种形式中的任何一种。

除了水和油以外，运载体成分还包括液体润滑剂、固体润滑剂、溶剂、润湿剂、增稠剂、粉料，以及包含至少一种前述成分的结合物。示例性的溶剂包括乙醇、异丙醇、乙氧基二甘醇和二甲基异山梨醇，以及丙酮，作为防止和/或减缓干燥，和/或用于保护皮肤，例如硬脂醇、鲸蜡醇、乙酰化羊毛脂醇、硬脂酸、棕榈酸异丁酯、异鲸蜡硬脂酸酯、鲸蜡棕榈酸酯、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、羊毛脂、可可油、酪脂树油、油类（例如橄榄油、向日葵油、鳄梨油、矿物油）、凡士林油和十四酸酯（例如十四酸丁酯、十四酸异丙酯、十四酸十四酯），以及包含至少一种前述成分的结合物。

在本发明的一个实施方案中，将水合的或增溶的黄酮类与肠溶包衣配制来使黄酮类在肠中释放。在另一个实施方案中，将水合的或增溶的黄酮类与环糊精（例如α、β或γ环糊精）配制。

V添加剂

透明质酸(HA)

在皮肤结构中，HA充当填充空间、稳定结构和保护细胞的分子，具有显著的可延展的物理特性和极好的生物相容性特性。此外，具有高水平粘弹性的HA结构有助于保持与该皮肤的高水平的水合作用。在皮肤中的水分含量与皮肤组织内的HA水平之间存在紧密的关联。已有大量文献证明，HA的物理和生物性能随着皮肤的老化、尤其是在皮肤的新陈代谢、含量和机械性能的衰退而存在显著的变化。人们相信，保持富有活力的HA存在于皮肤的细胞间结构中有助于健康皮肤的物理外观的活力。

在另一方面，已有大量文献证明，诸如HA的多糖类分子会因酶机制和氧化（自由基）机制而降解。因此，期望开发用来防止诸如HA的多糖类分解的外用制剂。为此，诸如黄酮的黄酮类可用来达到这个目的，通过其已被充分证明的抗透明质酸酶和抗氧化特性，因此能够保持HA的活力，即保护其免受使其分解的机制的所期望的功能。

进一步地，向黄酮类颗粒制剂中添加HA可通过增强纳米颗粒的ζ电位而抑制颗粒聚集。此外，HA增大了外用制剂的粘度，从而有助于防止纳米颗粒分层。

从外用上说，HA具有储水特性，这使其可有利地成为膨胀剂和润滑剂，使其能够掺入到化妆品中，从而带来针对皮肤状况的易于感知的和明显的改善。在使用中，它形成薄的透明的粘弹性表面膜，其有助于保持年轻和健康的皮肤的特性：柔软、弹性和色泽。增加的皮肤的水合作用可使角质层的紧致结构膨胀和打开，导致增强在此所述的外用制剂的活性黄酮类成分的渗透。

制剂可进一步包括添加剂，只要该具体的添加剂不会不利地影响活性成分。可用于制剂的多种实施方案中的一些可能的添加剂包括：

抗氧化剂（例如生育酚、生育酚乙酸酯、丁基羟基甲苯、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠和没食子酸丙酯），

表面活性剂（例如那些可以减小相之间的界面张力和/或改善制剂稳定性的表面活性剂，和/或那些可以作为乳化剂的表面活性剂，例如甘油硬脂酸、硬脂醇、鲸蜡醇、硬脂酸二甲聚硅氧烷、硅酮（硅氧烷）表面活性剂、聚山梨醇酯、十二烷基醚硫酸钠），

皮肤调理剂，例如硅酮油，

防腐剂（例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇、苯扎氯铵等），润湿剂或润滑剂或增湿剂，例如丙三醇、聚乙烯乙二醇、甘油、山梨醇、矿物油、十四酸异丙酯等，

缓冲剂（例如磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和醋酸盐缓冲剂等），

pH调节剂（例如三乙醇胺、氢氧化钾、氢氧化钠、盐酸和磷酸等），

凝胶化剂，例如羟丙基乙基纤维素、羟乙基纤维素、聚丙烯酸聚合物和泊咯沙姆等，

维生素（例如维生素A、B、C、D、E、K等），

矿物、植物提取物（例如芦荟、金缕梅、接骨木花、黄瓜、甘菊等），

抗炎剂，

软化剂，

增湿剂，

皮肤保护剂，

硅酮，

止痛剂，

皮肤渗透促进剂，例如丙烯乙二醇、二乙二醇单乙基醚、十四酸异丙酯，

着色剂，例如黄色5号，

香水（或芳香剂），

蜡（例如蜜蜡、石蜡等），

推进剂（例如压缩空气、碳氢化合物（例如丙烷、丁烷、异丁烯等）），

防晒成分（例如无机的和/或有机的防晒霜，例如氧化钛、氧化锌、阿伏苯宗、氧苯酮、胡莫柳酯、奥克立宁桂皮酸酯等），或者

包含至少两种上述成分的结合物。

该制剂可含有基于制剂总重量的0.01wt%到20wt%的防晒成分，具体是0.1wt%到大约10wt%，更具体是0.5wt%到5wt%。对于皮肤产品，运载体是脂溶性的，即可有效地渗透到皮肤层中并将水合黄酮输送至皮肤的脂质丰富层。

通过将黄酮类加入油/水（“o/w”）和/或水/油/水（“w/o/w”）乳状液中，可将黄酮类加载到制剂中，该乳状液可包含分散剂、乳化剂、表面活性剂等。

可将含有分散的和/或增溶的黄酮和/或水合黄酮的处于掺和胶状形式的制剂与钛和锌的氧化物一起加入运载体中，使得黄酮水合物将在使用者的皮肤中被优先吸收，而含有锌和钛氧化物的相将不会被吸收，但是将会在皮肤表面之外形成防护UV膜屏障。

应当指出的是，虽然用于黄酮和/或水合黄酮的运载体可包含相对简单的溶剂或分散剂（例如油类和有机醇类），然而通常优选的是，载体包含更加有助于外敷的组合物，尤其是会在其所涂敷的皮肤上形成膜或层以使涂敷局部化并提供一些抵抗出汗的组合物，和/或能够帮助到皮肤（如皮肤的表层）的输送和活性成分向皮肤的脂质丰富层渗透的组合物。许多这样的组合物以乳液、膏霜、喷雾和凝胶的形式存在。典型的组合物包括含有水和/或醇类的乳液、软化剂（例如烃油、烃蜡、硅酮油、植物脂和/或油、动物脂和/或油、海产脂和/或油、甘油酯衍生物、脂肪酸类、脂肪酸酯类、醇类（例如多羟基醇类、醇醚类）、羊毛脂（包括其衍生物）、酯类（例如多羟基酯、蜡酯）、甾醇类、磷脂类，以及包括至少一种前述成分的结合物），通常还包括乳化剂（非离子的、阳离子的或阴离子的）。上述这些常用的成分可配制成膏霜而不是乳液，或者配制成凝胶，通过使用不同比例的这些成分和/或通过掺和诸如树胶或其他形式的亲水性胶体的增稠剂。

在一个实施方案中，该制剂包含溶解和分散（例如微颗粒）形式的黄酮类。溶解的形式可穿透皮肤层而变得有生物活性，而分散的水合物可充当储库，用于在溶解的水合物被消耗掉时保持溶解的浓度水平，以便保持持续的黄酮类供应。

可使用卵磷脂基的水包油膏霜，大约2.0wt%的芹菜素和/或水合芹菜素以及大约0.5wt%的抗坏血酸，大约0.5wt%的生育三烯酚乙酯和大约0.25wt%的乙二醇酸，以及包含运载体成分的余量，来制备制剂，基于制剂的总重量计。

在另一个实施例中，可使用卵磷脂基的水包油膏霜，3.0wt%的卵磷脂，大约0.5wt%的抗坏血酸，大约0.5wt%的生育三烯酚乙酯，大约0.25wt%的乙二醇酸，以及大约总量为8wt%的锌和钛的氧化物，还有包含运载体成分的余量，来制备制剂，基于制剂的总重量计。

任选地，该制剂可进一步包括：(i)添加剂，选自表面活性剂、维生素、矿物、植物提取物、抗炎剂、植物提取物的浓缩物、软化剂、增湿剂、皮肤防护剂、润湿剂、硅酮、皮肤舒缓成分、皮肤渗透促进剂、着色剂、芳香剂（香水）、防腐剂、pH调节剂，以及包含至少一种前述成分的结合物；和/或(ii)氧化钛、氧化锌，或者包含至少一种前述成分的结合物。

通常情况下，黄酮类组合物可包含大于或等于0.01重量百分比(wt%)的黄酮类，具体地，大于或等于1wt%，例如0.1wt%到10wt%，更具体地0.5wt%到8wt%，更特别地2wt%到5wt%，基于组合物的总重量计。该制剂可包含大于或等于0.01wt%的黄酮类（例如0.01wt%到20wt%的黄酮类，具体地0.05wt%到15wt%的黄酮类，特别是0.1wt%到10wt%的黄酮类，更特别是0.5wt%到4wt%的黄酮类，并且还更特别是1wt%到2wt%的黄酮类），基于制剂的总重量计。

在此所公开的范围可以是包括在内的或者是可结合在一起的（例如，范围“达到25wt%或者更具体地为0.5wt%到5wt%”包含了范围“5wt%到25wt%”的端点值和所有的中间值，等）。“结合物”包括掺和物、混合物、合金、反应产物等。更进一步地，用语“第一”、“第二”等在此并不指示任何顺序、数量或重要性，而是用来区分不同的要素，而术语“一”在此并不表示对数量的限制，而是表示存在至少一个所指对象。在此所使用的术语包括了该术语的单数和复数，因而包括一个或多个所述术语（例如膜包括一个或多个膜）。整个说明书中的“一个实施方案”、“另一个实施方案”、“实施方案”等意味着与实施方案有关的所述的具体要素（例如特征、结构和/或特性）被包括在至少一个在此所述的实施方案中，并且可能出现或可能不出现在其他的实施方案中。此外应该理解的是，所述要素在不同的实施方案中可以以任何合适的方式相结合。在此所使用的术语“（甲基）丙烯酸酯”包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯。

表IV含有所公开的微颗粒和增溶的黄酮类的制剂的例子

保健品/食品/膳食补充剂

本发明的微颗粒和增溶的黄酮类组合物可用于多种保健产品（如单独的营养品）、膳食补充剂、基于基因工程的“设计”食品、草药产品，以及诸如谷类、汤和饮料的加工产品。如在此所使用的，保健品是指任何无毒的食品提取补充剂，其对于疾病的治疗和预防具有科学认证的健康益处。

医疗食品

医疗食品被配制来用于在医生的监管下在体内消耗或给药。它们用于某疾病或状况的特定饮食管理，为此，在公认的科学原理的基础上通过医学评价建立了用于特殊的营养要求。医疗食品可通过口服或通过管饲来摄取。医疗食品常常被设计来满足被诊断为患有特殊疾病的人们的某些营养要求。本发明的微颗粒和增溶的黄酮类组合物可用于医疗食品。

化妆品

本发明的制剂可例如用于许多产品中，如化妆品和皮肤病学上的产品，包括粉底、防晒产品、非日晒型皮肤晒黑产品、膏霜（例如增湿霜、烫伤膏、护肤霜、晚霜、皮肤病霜等）、浆液、护肤乳液、柔软剂、凝胶剂、软膏剂、唇膏、清洁剂、化妆水、面膜、头发产品、指甲产品，以及其他化妆品产品或敷剂。

VI形成维生素黄酮的方法

在此进一步公开了形成维生素黄酮的方法。例如，形成“维生素黄酮”的方法包括：将维生素加热至熔化；将黄酮溶解在熔化的维生素中，以形成维生素黄酮液体混合物；以及冷却该维生素黄酮液体混合物，以形成均质的固体混合物。在不同的实施方案中，

(i)黄酮可选自芹菜素、水合芹菜素、木犀草素、水合木犀草素以及包含至少一种前述成分的组合物；和/或

(ii)维生素可选自维生素B3、维生素B5以及包含至少一种前述成分的组合物；和/或

(iii)黄酮可大于或等于0.1wt%，具体地大于或等于25wt%，更具体地大于或等于25wt%，还更加具体地大于或等于50wt%，基于维生素黄酮的总重量计。

在一个实施方案中，形成维生素黄酮的方法可包括：将维生素加热至熔化，将黄酮溶解在熔化的维生素中以形成维生素黄酮，以及冷却该维生素黄酮。

生育三烯酚是维生素E族中的一种。作为人体的基本营养素，维生素E由四种生育酚(α,β,γ,δ)和四种生育三烯酚(α,β,γ,δ)组成。

在将生育三烯酚用于组合物的许多实施方案中，将生育三烯酚从天然来源中分离出来，然后添加到制剂中作为富含生育三烯酚的维生素E制剂。然而，也可以采用合成的制剂，以及天然的和合成的维生素E的混合物。有用的生育三烯酚是例如用高效液相色谱法从小麦胚芽油、糠或棕榈油中分离出来的天然产品，或者通过醇萃取和/或分子蒸馏法从大麦、啤酒糟或燕麦中分离出来的天然产品。在此所使用的术语“生育三烯酚”包括来自这些天然产品的富含生育三烯酚的馏分和纯的化合物。在一些实施方案中可使用基本上不含有生育酚的生育三烯酚。

运载体中的生育三烯酚和/或富集生育三烯酚的维生素E制品与黄酮和/或水合黄酮的结合物是尤其优选的，因为黄酮水合物（例如芹菜素和芹菜素衍生物）增加了制剂中其他成分的功效。人们认为，生育三烯酚中的不饱和侧链能够使其更加有效地穿透具有饱和脂肪层的组织，使其潜在地对化妆品产品更加有用。并且，生育三烯酚的苯酚和羟基成分有助于增溶黄酮。两种或多种活性成分的结合物容易溶解在富含脂质的皮肤层中，因此清除由紫外线辐射产生的自由基。

芹菜素和抗坏血酸（维生素C）和/或抗坏血酸衍生物与生育三烯酚和/或α-羟基酸的结合物的有效性与它们的单独使用相比，或者甚至与硫辛酸和/或抗坏血酸和/或抗坏血酸衍生物的单独使用相比，具有意想不到的效果。

在此还公开了由以上方法形成的组合物和食品补充剂。

VII本发明的化合物和制剂的使用

黄酮类具有多种治疗应用，这是因为它们是自由基清除剂、抗氧化剂、超氧阴离子、UV吸收剂、血管扩张剂、抗透明质酸酶（通过抑制透明质酸酶而抑制透明质酸的分解）和脂质过氧自由基。还已知黄酮类化合物可有效地增强胶原蛋白结构。此外，黄酮类具有抗诱变、抗血管新生、抗致癌、抗炎和抗病毒作用。抗炎作用包括对TNF-α、IL-β、COX-2、蛋白激酶PKC、iNOS以及T辅助细胞Th1和Th17的抑制。黄酮类、尤其是芹菜素是p53的刺激物。研究者发现，芹菜素会在细胞周期的G1和G2/M期诱导可逆的细胞周期阻滞。

单独的黄酮类或与其他预防性和/或治疗性的有效药物相结合可有效地用于治疗或预防包括人类的哺乳动物中的最常见疾病，例如癌症、自身免疫性疾病、糖尿病、溃疡、心血管疾病、动脉硬化症和肝脏疾病。该化合物还有抗凝血活性。

本发明包括配制允许多种应用的黄酮类的多种途径。本发明的化合物、组合物和制剂可用于预防和治疗以下讨论的失调和疾病。在此所使用的“治疗有效量”是指为获得所期望效果需要的剂量。例如在斑块银屑病中，治疗有效量是指减小斑点或斑块的尺寸或严重度的量。“预防性量”是指预防或减小失调或疾病发生的可能性的剂量。

皮肤疾病

本公开提供了制备含有黄酮类如芹菜素的外用制剂的方法，该黄酮类处在皮肤病学上可接受的pH范围内并具有药物学意义上的浓度。该黄酮类可以是溶解形式或分散形式（例如微颗粒）或二者的结合。外用涂敷制剂可以是乳液、膏霜、喷雾、皮肤膏药、透皮膏药等的形式，以将足够的黄酮类输送入哺乳动物（例如人类）的组织（例如进入哺乳动物的角质组织）中。

外用涂敷量

典型的外用剂量范围是1到10mg/cm²，优选1到5mg/cm²，并且最优选1到3mg/cm²。剂量根据病情和给药模式而变。在FDA防晒霜外用测试中所使用的剂量是2mg/cm²暴露皮肤。文献“Re:Tentative Final Monograph for OTC Sunscreen”,Food andDrug Administration (U.S.).1998-09-11.Retrieved 2009-09-25提供了一种假设，“平均的”成年人高5英尺4英寸(163cm)，重150磅(68kg)，腰围32英寸(82cm)，该成年人穿着泳衣覆盖腹股沟区域，那么应该用29g（大约1盎司）均匀地用于未覆盖的身体区域。若只考虑面部，则转换成1/4到1/3匙用于平均的成年人的面部。对于更大的个体应相应地放大这些数量。

按照通常应当用于受影响皮肤的外用药物的量，皮肤科医生将“指尖单位”作为推荐指导。一指尖单位大约是500mg，并推荐需要用于覆盖受影响区域的单位数量。例如，充分地覆盖头皮上的银屑癣需要三指尖单位，而整个腿部和足部需要八指尖单位。该方法为病人提供了更精确地使用其外用药物的方法。

预防和治疗由于太阳辐射的皮肤损伤

诸如芹菜素和/或木犀草素的黄酮类的可溶形式可容易地渗透进入皮肤并被皮肤吸收，从而预防损伤（光老化）或修复已损伤的皮肤基质。如在以下的实施例21中所显示的，本发明的制剂允许黄酮类的显著的皮肤渗透。

芹菜素和/或木犀草素在乳液和膏霜的运载体中的低溶解度使得形成具有所需量黄酮类的这种组合物变得困难。在一个实施方案中，该制剂包含足量的处于近中性pH下的可溶水合黄酮类，以渗透进入活性的皮肤基质中，使皮肤组织的损伤最小化或消除，从而保护活性皮肤免受由暴露于UV射线和/或预渗透引起的损伤。该外用制剂可对个体给药，优选对个体的皮肤的局部涂敷、口服（例如作为食品补充剂）等。该制剂可以能有效预防UV损伤的量来施用，以便例如抑制自由基、活性氧和/或其他氧化物种。

对于抵抗皮肤癌的活性，芹菜素即使在很低的浓度、小于约50μM下仍表现为有效的。通过在细胞增殖和血管生成期间影响细胞凋亡和坏死的机制，导致对癌细胞增殖的抑制，芹菜素展示出抗恶性细胞增生和细胞毒素作用，上述细胞增殖和血管生成是包括前列腺癌、乳房癌、肺癌、白血病、甲状腺癌和肝癌的多种癌症细胞的主要特性。

机理

诸如芹菜素的黄酮类的主要机理被认为是它们的增加p53稳定性的能力、对诱导G1和G2/M细胞周期阻滞的作用，以及已被充分证明的其抗炎、抗氧化、无毒以及非诱变的特性。在通过洗脱移除芹菜素或在其扩散出皮肤外之后，这些细胞周期阻滞是完全可逆的。

鉴于芹菜素引起G1和G2/M细胞周期阻滞的事实，芹菜素的化学预防活性的本质可能是，通过确保在DNA损伤和肿瘤促进剂的存在下有足够的固有的和人为强加的细胞周期监测点，以抑制癌症的开始和发展。在晒太阳之前对皮肤进行芹菜素和木犀草素处理可延长对DNA损伤作出反应的、通常在G1和G2/M中阻滞的时间单元。这些黄酮增加了G1期的持续时间，使之超过了发生在正常细胞中的对DNA损伤作出反应的持续时间，或者，这些黄酮阻碍了含有在G1中激活的致癌基因的细胞，否则当即使存在显著的DNA损伤时细胞周期的发展也会继续。因此，花费在G1和G2/M中的时间对于细胞高效地修复所有DNA突变并因此减缓或阻止致癌过程是很关键的。

由于阳光损伤的作用在一生中是累积的，作为在所有的人类和动物癌症中最容易变异的基因，肿瘤抑制蛋白p53在人们使用芹菜素和/或木犀草素的外用敷剂的时候可能已经在一些角化细胞中被灭活。由于这些黄酮的作用在G1阻滞中依赖于p53、在G2/M阻滞中不依赖于p53，例如在角化细胞已经有灭活的p53基因时，芹菜素将增强在癌前细胞的这些小病灶中的G2/M阻滞，以防止额外的突变、转移和/或有丝分裂期间的染色体损失。此外，芹菜素和/或木犀草素可通过清除响应于UV-B/A阳光照射而产生的自由基来发挥其保护作用。

可以认为，芹菜素治疗可增强由UVB引发的细胞凋亡反应。不受理论的约束，可认为芹菜素的化学预防行为可用它的通过显著提高p53的稳定性来增加UV诱导的细胞凋亡的能力来解释，其中p53是皮肤癌细胞凋亡过程中的主要因素。因此，需要将药物学上有意义的浓度的芹菜素输送入有活力的表皮或整个皮肤层中，以便有效地预防皮肤癌(Li B.;Birt D.F.;Pharmaceutical Research,Volume 13,Number 11,November 1996,pp.1710-1715(6))。

如在此所公开的，针对含有黄酮类、尤其是芹菜素和/或木犀草素的外用敷剂的组合物可用于预防和/或治疗因暴露于太阳辐射（UVA和/或UVB）引发的皮肤损伤。芹菜素和/或木犀草素组合物还增大了外用组合物中的其他成分在预防和治疗晒伤中的功效。

在使用中，该产品可单次或多次涂敷，以获得所期望的结果。在一些实施方案中，防晒霜成分可以是制剂的一部分，和/或可以用作二次涂敷，使得含有防晒霜成分的膜通过阻挡或反射UV辐射而提供额外的全光谱UV辐射防护。

由于芹菜素和木犀草素在细胞周期中在细胞内发挥作用，所以任何一种均可与简单地作为细胞外屏障来吸收阳光中的UV能量的其他防晒剂相结合。因此，芹菜素和/或木犀草素的外用敷剂是可逆的细胞周期调节剂，为皮肤癌的预防提供了有用的、新颖的方法，可连续使用或者结合目前市售的防晒乳液来使用。

这些水合的黄酮因其抗氧化、抗炎、UV皮肤保护和其他让人满意的特性而可特别有利地作为外用制剂的添加剂。因此，芹菜素和木犀草素的外用敷剂为皮肤癌预防/治疗提供了有用的、新颖的方法，并且可在目前市售的防晒乳液之前或与之相结合地使用。

不受理论的限制，可认为该制剂可用于例如治疗或预防由暴露于紫外(UV)光或阳光而引发的皮肤癌。

在此所公开的是用于预防和/或治疗皮肤癌以及其他包括但不限于子宫癌和乳房癌的局部癌症的含有黄酮的组合物或外用敷剂。该组合物含有药物学上有效量的芹菜素来渗透进入皮肤层中，例如以增加p53的稳定性来预防和治疗皮肤和其他局部癌症。

可以认为，当用在适当运载体中的特定混合物中时，抗氧化剂芹菜素和木犀草素的UVB光保护作用是明显的。黄酮和/或水合黄酮与其他成分一起提供了天然的方法来有效地支持能提供保护以免受晒伤和慢性UV损伤的人体自身防御机制。与矿物颜料相结合的芹菜素和/木犀草素的天然抗氧化特性和抗癌特性提供了协同的光保护作用，以减小UV损伤和皮肤癌的风险。可加入包括诸如维生素E的抗氧化剂和增湿剂的其他天然成分，以产生增强UV保护并同时舒缓皮肤的协同作用。

在此还公开了减小和/或预防日晒后果的方法，包括：使用含有黄酮类和皮肤病学上可接受的载体的外用制剂，以向哺乳动物的角质组织输送黄酮类组分。任选地，外用的化妆品组合物可以使用第二次、第三次或更多次。

癌症

癌症化学预防药剂的三个理想性质是：1)是存在于已知与减少癌症发病率有关的食品中的天然化合物；2)具有已知的作用机理；和3)其作用是可逆的。可以认为，诸如芹菜素和木犀草素的黄酮类满足所有的三条标准。

本发明的化合物和制剂可用于癌症预防和癌症治疗。该制剂可用于治疗或预防皮肤癌（包括光化性角化病、黑色素瘤、基底细胞癌）、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、乳房癌、肺癌、白血病、甲状腺癌、肝癌和包括神经细胞母癌的脑癌。

治疗其他皮肤疾病的方法

本发明的化合物和制剂可用于治疗银屑病。实施例19证明了外用制剂以足以具备治疗价值的浓度穿透人体皮肤。

能够通过外用本发明的制剂和组合物来治疗或预防的其它皮肤病和相关的病痛/病症包括但不限于如下所述：痤疮、脱发、过敏性皮炎/湿疹、皮肤红斑狼疮、皮肤致敏和刺激、干性皮肤（干燥病、鱼鳞癣）、真菌感染、酒渣鼻、接触性皮肤病、包括银屑癣的自身免疫性病痛，关节炎。芹菜素/黄酮类的外用给药提供了极好的生物利用率。因此，这些外用制剂是昂贵的、不太令人满意的类固醇和细胞毒素药物的替代品。

治疗其他疾病的方法

本发明的化合物、组合物和制剂也可以用于治疗其他自身免疫性疾病，例如狼疮、关节炎、敏感症和哮喘。诸如芹菜素的源自食用植物的COX-2和NF-kB抑制剂的生物利用率对抑制狼疮和其他Th17介导的疾病如风湿性关节炎、克罗恩病和银屑病中的发炎，以及在过度表达COX-2的基于炎症的肿瘤（例如结肠、乳房）的预防中是有价值的。芹菜素通过抑制自身反应的Th1和Th2细胞的自身抗原表达来抑制狼疮。本发明的制剂提供了用于治疗自身免疫适应症/疾病的输送芹菜素/黄酮类的新颖方法。

该化合物和制剂对治疗神经学和神经退行性疾病也是有用的。几项研究已为芹菜素和木犀草素的抗炎作用及其在包括阿耳滋海默氏病的各种神经退行性疾病中的神经保护/疾病调节特性提供了证明。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和组合物对于治疗过敏性疾病和细菌感染是有用的。

可用本发明的水合黄酮类治疗、预防或减轻的TNFα相关疾病的例子包括但不限于：风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、脊椎关节炎、肠炎疾病、慢性心力衰竭、糖尿病、全身性红斑狼疮、硬皮病、肉状瘤病、多肌炎/皮肌炎、银屑病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、急性髓细胞白血病、帕金森病、AIDS痴呆综合症、阿耳滋海默氏病、抑郁症、脓毒症、坏疽性脓皮病、败血症、感染性休克、贝赫切特综合症、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、韦格纳肉芽肿病、休格林氏症、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、恶病质、癌症、中枢神经系统损伤、病毒性呼吸道疾病和肥胖症。

用本发明的水合黄酮类来治疗、预防或者减轻的IL-1β相关疾病的例子包括但不限于：风湿性关节炎、败血症、牙周疾病、慢性心脏衰竭、多肌炎/皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺疾病、阿耳滋海默氏病、骨关节炎、细菌感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、葡萄膜炎、中枢神经系统损伤、病毒性呼吸道疾病、哮喘、抑郁症和硬皮病。

由于黄酮类对IL-4和IL-13合成的抑制活性，可以预测的是，取决于数量和质量的黄酮类摄入可以改善过敏症状，或者预防过敏性疾病的发作（Int Arch Allergy Immunol.2004Jun;134(2):135-40.)。

芹菜素在人类牙周韧带(hPDL)细胞中具有抗炎活性，并通过新颖的机制来起作用，所述机制包括血红素加氧酶-1(HO-1)的作用。因此，芹菜素在预防和治疗与抽烟有关的牙周疾病以及牙菌斑中作为宿主调节剂是有益的(Gil-Saeng Jeong etal，;Anti-infiammatory effects of apigenin on nicotine-and lipopolysaccharide-stimulatedhuman periodontal  ligament  cells via heme  oxygenase-1.,InternationalImmunopharmacology，Vol.:9，Nov.2009)。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和制剂可用于促进头发的生长。研究表明，芹菜素通过TGF-β1基因的下调来刺激头发的生长。

应该理解的是，可以对如上所述的实施方案进行宽广范围内的改变和修改。因此，前面的描述目的是为了说明而不是限制本发明，并且以下的权利要求、包括其等效物限定了本发明。

实施例

实施例1-未加工的芹菜素粉末

从Actives International公司（美国新泽西州Allendale）获得芹菜素粉末，其具有如所附“分析证明”中注明的大于98%的纯度（通过HPLC测定）。这种高精制的芹菜素（商品名为Viapure Citrus^TM）是通过对来自柚子皮（柑属植物）的生物黄酮类进行修饰而衍生得到的。所有的淡黄色外观的芹菜素粉末能通过80筛目（美国标准筛尺寸），其表明了最大的芹菜素尺寸是大约200微米(μm)。这还表明了将芹菜素颗粒尺寸缩减大约200倍可得到1000纳米的颗粒尺寸。

实施例2-芹菜素溶解度

芹菜素溶解度试验表明，其在水中的溶解度可忽略不计，在丙酮和乙醇中的溶解度是有限的（小于2mg/ml），在丙烯乙二醇中的溶解度也是有限的（小于1mg/ml），在乙氧基二甘醇中的溶解度大于10mg/ml。尽管在文献中已经报道了在二甲基亚砜(DMSO)中的溶解度水平大于100mg/ml，但是被认为是优良的皮肤渗透剂的DMSO却被认为不适合用于外用成分。

实施例3-芹菜素在碱性溶液中的溶解度

芹菜素可溶于稀的NaOH溶液中。然而经实验确定，氢氧化钠被证明是对于芹菜素的最有效的溶剂，如表VI所示。

同样地，1M的氢氧化钾(KOH)和氢氧化锂(LiOH)溶液证明了可溶解相似量的淡黄色芹菜素粉末，1M的NaOH也一样。

为形成水合芹菜素和/或木犀草素，首先将芹菜素和/或木犀草素粉末溶解在碱金属氢氧化物溶液中。当用诸如柠檬酸或盐酸(HCl)的酸化剂将芹菜素的碱性的可溶钠盐（包含在水中，pH值大于8）酸化而开始形成云状和雪状的胶态（凝胶状）沉淀物时，便形成了水合芹菜素。当溶液的pH值降低到大约为5时，结束反应。将凝胶状沉淀物过滤，然后用蒸馏水充分地洗涤，以除去溶解的盐。挤压沉淀物并进一步将其暴露于空气流中，以便进一步干燥水合芹菜素产品。水合木犀草素可通过与类似于生产水合芹菜素的所述步骤来形成。

实施例4-在醇类中的溶解度

水合芹菜素和木犀草素在各种醇溶液中展现出有限的溶解度。这些发现显然不同于在这些醇溶剂中几乎不溶解的非水合状态的芹菜素和木犀草素。展示有限的溶解性浓度水平的醇类包括：乙氧基二甘醇、异丙醇、丙烯乙二醇、丁烯乙二醇和甘油。同样，溶剂二甲基异山梨醇展示了用于芹菜素和木犀草素的水合物的有限的溶解浓度水平。对于所有被测试的醇溶剂，水合木犀草素的饱和溶解性浓度水平大于水合芹菜素。显然，相比于芹菜素的三个羟基基团，木犀草素的四个羟基基团导致了这些相当的溶解度差异。

实施例5-在维生素中的溶解度

将固体状的维生素B5和B3熔化，以测定它们是否能溶解芹菜素和/或木犀草素。意外的是，它们可以。当把熔化的液体混合物（维生素B3/芹菜素和/或维生素B5/芹菜素）加入到几种乳液产品（例如当用力搅拌时）中时，得到的添加混合物似乎均匀地分散在（载体）乳液/膏霜中。

出乎意料的是，近1摩尔的维生素原B5（从美国Lotioncrafters,Olga,WA购买的D,L泛醇）和0.75摩尔的水合芹菜素之间的反应产生褐色的粘性液体混合物，该混合物可部分溶于水。

将水合芹菜素水合物和芹菜素快速地溶解于熔化的D,L泛醇（约65℃）中。将这些混合物快速地溶解于少量的醇类如乙氧基二甘醇或丙烯乙二醇(PG)中，以减小该混合物的粘度。将这些得到的溶液相对缓和地加入到几种现有的皮肤增湿和/或防晒乳液中，伴随着乳液pH值的略微升高。注入了熔化的芹菜素/D,L泛醇添加剂的乳液的颜色变成淡黄色，基于混合物的总重量计，芹菜素的浓度大约为1.5wt%。需要强调的是，芹菜素和芹菜素水合物溶液到D,L泛醇中要相对缓和地进行。巧合的是，D,L泛醇在H₂O中的5wt%溶液已被证实了明显是碱性的，其pH值略微小于9.0。

将得到的芹菜素/D,L泛醇混合物也溶解在二甲基异山梨醇、甘油、异丙醇和丙酮中。芹菜素/D,L泛醇混合物不溶于葡萄籽和西蒙得木油中。同样的，芹菜素/维生素B5混合物在H₂O中的5wt%溶液的pH值略微大于8.0。当用柠檬酸晶体将芹菜素/D,L泛醇混合物酸化至pH值大约6.5时，出现了芹菜素水合物的常见的胶状的和高度分散的棉花状沉淀物（差不多是油状的稠度）。芹菜素/D,L泛醇似乎是在酸化时容易转化成芹菜素水合物的碱性的均质混合物。

此外，芹菜素和/或水合芹菜素在熔化的烟酰胺（维生素B3）中是易溶的。当这些包含近1摩尔芹菜素和2摩尔烟酰胺的熔化混合物冷却至室温时，形成淡黄色/褐色固体。这些固体可溶于诸如乙氧基二甘醇、丙烯乙二醇和异丙醇的醇类中。应指出的是，固体混合物中的烟酰胺部分溶解在水中，同时可观察到水合芹菜素水合物是以高度分散的白色凝胶状（棉花状）形式存在。该溶液的pH是pH值大约为6.0的酸性。当用稀NaOH溶液将溶液的pH值提高到大于7.5时，芹菜素水合物几乎完全溶解。

应该指出的是，是熔化的烟酰胺中的水合芹菜素而不是无水芹菜素需要用稍微多些的控制来操作，并且需要稍微降低的熔化温度。

在大约40℃到50℃下，将溶解在熔融维生素B3中的芹菜素和芹菜素水合物的熔融混合物在固化之前加入到加热至40℃的乳液中，当将其充分混合于增湿和防晒乳液中时，将导致芹菜素和水合芹菜素均匀地分散。进一步地，可将芹菜素维生素B3的均质熔融溶液加入到乳液中，以提供6.5到8.0的pH值，以便增大芹菜素的可溶部分。

人体皮肤的pH值为4到5.6。从皮脂中分泌的汗和脂肪酸会影响皮肤表面的pH值。已经发现，皮肤的酸度有助于限制或预防病原体和其他有机体的生长。

实施例6-芹菜素在甘油中的溶解度

进一步发现，芹菜素以钠盐或钾盐的形式增溶在甘油中，浓度水平接近50mg/ml。芹菜素的增溶在碱性的甘油溶液中实现，使得不溶于甘油的氢氧化钠和/或氢氧化钾的精细晶体溶解于芹菜素悬浮颗粒中，从而观察到深黄色的溶液。此外，芹菜素的钠盐或钾盐在丙烯乙二醇中溶解为小很多的浓度，并且在多种其他醇类中溶解为减小的饱和浓度。

实施例7–芹菜素在碱性溶液中的溶解度且之后与外用载体混合

芹菜素在碱性溶液中的高溶解度水平是很重要的，这在于此时可以构思出将芹菜素溶解在药物学上可接受的外用载体中，同时使钠和/或其他碱金属离子的含量最小化。在碱性芹菜素制剂的酸化之后，大部分芹菜素以精细的微颗粒形式保持分散或悬浮，而很少的部分溶解在制剂的成分中。

在一个例子中，当把3.3毫升(ml)含有300mg/ml芹菜素浓度的2摩尔(M)氢氧化钠(NaOH)溶液加入到100克第一外用载体（表III中的1号样品）中时，将会得到含有基于最终混合物的总重量计为近1wt%的溶解芹菜素的外用制剂。随后用盐酸对NaOH进行中和，产生含有仅为0.3wt%氯化钠含量的制剂，或者可能是0.75M的NaOH溶液将可导致大约0.15wt%的氯化钠含量。

在另一个实施例中，将含有200mg/ml芹菜素浓度的0.5ml NaOH溶液加入到5ml第二外用乳液（表VII中的2号样品）中，以试图获得溶解的大约为2wt%的芹菜素浓度。随后通过添加柠檬酸的精细晶体，将由添加NaOH而获得的碱性制剂酸化至略微酸性的pH值。应指出的是，随着柠檬酸的加入而形成的柠檬酸钠还可在化妆品制剂中充当防腐剂。

在另一个实施例中，将含有75mg/ml的水合芹菜素浓度的4ml乙氧基二甘醇溶液加入到96克(g)第三外用乳液（表VII中的3号样品）中，以试图获得芹菜素在合适外用制剂中的溶解分量。pH值为5.5的第三外用乳液的pH值不会因含芹菜素溶液的加入而改变。

实施例8-未加工的芹菜素粉末的扫描电子显微镜(SEM)图

采集未加工的芹菜素粉末的扫描电子显微镜(SEM)图，以测定颗粒形状特征。将一至两滴在水中的未加工样品在0.4微米孔径的聚碳酸酯过滤器上过滤，然后用20滴“注射用水(WFI)”洗涤。将过滤器在干净的罩子中干燥至少24小时。用扫描电子显微镜对从每一个过滤器上获得的样品进行成像。图1是在10,000X的放大倍率下细化显示未加工的芹菜素粉末的晶体形状的典型的扫描电子显微镜(SEM)图。

实施例9-未加工芹菜素的颗粒尺寸测量

利用基于米氏理论（包含Fraunhofer理论）的静态光散射的颗粒尺寸技术来确定未加工的芹菜素样品的颗粒尺寸分布。图2和图3显示了未加工的芹菜素粉末的典型的“体积频率”和“累积细化颗粒”颗粒分布图。未加工的样品具有小于1微米的明显的颗粒体积，以及在40微米左右的非常大的分布。这些大尺寸的颗粒具有非常窄的范围分布，这表明了颗粒尺寸很均匀。这些样品中的几个样品显示了很大一部分是100nm以下的粒子。

实施例10-水合芹菜素的形态

采集水合芹菜素的扫描电子显微镜(SEM)图以测定其形态。所使用的方法与实施例8所述的类似。

图4是水合芹菜素样品的典型的扫描电子显微镜(SEM)图。未加工样品所展示的形态与如图4所示的典型水合芹菜素样品所展示的形态很不相同。通过FTIR和拉曼光谱测定的化学组成并未检测到未加工芹菜素和水合芹菜素之间的任何化学差异。这表明了，在形成水合黄酮类中所做的修饰已改变了黄酮的晶体形状和/或晶体特性，可能产生黄酮的多形体。该纤维具有30-500nm的直径，长宽比测得为大于20。

实施例11-改良的制造方法

下面描述制备水相乳液(APL)的标准方法。包括溶液温度、酸化过程中的溶液混合速率、酸化添加速率以及pH值的HA沉淀条件在三种单独的制剂中相同。

制备分别为60ml的3批水相乳液(APL)的基本的APL制备方法如下：

·称量未加工的芹菜素的量，使得每一份60ml的批次中含芹菜素为1.25wt%；

·将未加工的芹菜素加入到600ml烧杯中的300ml去离子水中，搅拌以形成固/液浆料；

·在搅拌时向上述浆料中缓慢添加1M NaOH溶液的量。加入足够的量直到所有的芹菜素颗粒已被增溶，从而形成可溶的芹菜素钠盐；

·向增溶的芹菜素溶液中加入碎冰，以降低温度至大约5℃；

·制备稀柠檬酸溶液，在用力搅拌增溶的同时快速加入碱性芹菜素溶液，直至pH水平大约为4到6。在此酸化过程中，应指出的是，当pH<~6时形成凝胶状的沉淀物，其明显变得不那么粘稠；

·然后用相对多孔的滤盘（大约2微米）将凝胶状的沉淀物（水合芹菜素）过滤。重要的是，该沉淀过程要相对轻缓地快速进行，以获得清澈的无颗粒的滤液；

·将水相乳液(APL)的剩余的可溶于水的组分单独地溶于水中，得到30ml样品中2%透明质酸、2%丙三醇、2%维生素B5和5%维生素B3的浓度。

·将含有0.75克芹菜素的水合芹菜素加入到如上所述的30ml溶液中。然后用去离子水将该混合物稀释至60ml。

·将该60ml溶液加热至大约120°F，然后用QSonics S-4000超声仪在95%的振幅水平下进行超声处理1分钟。在10秒钟超声增量后将超声过程“暂停”5秒钟。

·将得到的超声混合物注入20cc无空气的分配管中。

颗粒尺寸分布测试

将来自所制备的3批中的每一批样品放入20cc无空气的分配管中，并标记如下：

1.批次1：APL-19

2.批次2：APL-20

3.批次3：APL-21

4.批次1：APL-22

来自同一批次的APL-19和APL-22是用来检验颗粒尺寸分布(PSD)设备和所应用的分析程序的差异性/灵敏性。

对所制备的样品进行PSD分析。此外，由于颗粒主要处于亚微米范围内，所以可以同时测量纳米尺寸颗粒的ζ电势。

在图5和图6中总结了来自3个不同批次的4个样品（APL-19至APL-22）的颗粒尺寸分布的分析测量。APL-19和APL-22来自同一批次。如在图5和图6中所示，几乎所有的颗粒都小于1微米。来自同一批次的样品APL-19和APL-22具有几乎相同的线图。这些相似的分布提供了在分析设备和操作者规程方面的测量的可信度。

除了样品APL-20例外，图5中显示的PSD展现了~100nm和300-400nm的双峰分布。间隔开大约~250nm的双峰分布的原因尚不明确。样品APL-20具有在大约225nm处的单峰，可以认为，在其他样品中所显示的双峰分布峰会聚在一起，从而提供在双峰分布峰之间的单峰。

图6中的“累积细化体积”线图显示了4个样品之间的相似的颗粒分布一致性。显然，所有的样品表明，一半的颗粒都小于230nm。除了样品APL-20例外，~20%的颗粒小于100nm。表VIII总结了所测试的4个样品的ζ电势结果。样品在ζ电势测试之前大约5天时制备。所有结果表明，颗粒带有~40mv的负电荷。一般来说，带有超过25mv的负电荷或正电荷的颗粒将趋向于彼此相互排斥，因此将聚集的电势最小化。

表VIII-ζ电势一览表

样品#	ζ电势-(mv)
		APL-19	-42.32
APL-20	-41.26
		APL-21	-39.02
APL-22	-39.37

实施例12-采用所公开方法的其他黄酮类制剂

以如实施例11中所列出的方式制备几种黄酮类的水相乳液(APL)样品。在图7中显示了水相乳液(APL)中所含芹菜素、木犀草素、芸香苷和槲皮素的1.25%的黄酮类浓度的累积颗粒尺寸分布。APL的剩余组分包括：1%的透明质酸、1%的丙三醇、1%的维生素B5、2.5%的维生素B3，余量为水。平均颗粒尺寸均小于400nm。

图8显示了在水中的1.25%未加工槲皮素粉末与通过实施例2中所述方法制备的、包含在水相乳液中的1.25%水合芹菜素相比的颗粒尺寸分布的比较。显然，相比于未加工粉末，水相乳液中的水合槲皮素的平均颗粒尺寸(~400nm)已经减小了超过一个数量级。

表IX包含了当用水稀释至30比1的比例时几种包含于APL之中的水合黄酮类的定量评定。在延长的时间期间后颗粒沉降的缺乏为水相乳液中亚微米的黄酮类颗粒的含量提供了证据。

表IX*-水相乳液(APL)中的“水合黄酮类”悬浮液特征的定量评定

备注：*悬浮/溶解于水相乳液(APL)中的水合黄酮类由1%透明质酸(HA)、1%丙三醇、1%维生素B5（d-泛醇）、2.5%维生素B3（烟酰胺）和余量的水组成。

备注：芸香苷形成三水合物，木犀草素形成二水合物，槲皮素形成二水合物。所有都被认为是几乎不溶于水；然而，“水合形式”显示了微小的溶解度改善，此外还有不少的纳米颗粒部分。

实施例13-在聚山梨醇酯中的溶解度

由芹菜素和聚山梨醇酯80获得的产品被称为“A/P80”。A/P80通过如下步骤形成：

·将未加工的芹菜素粉末和粘性的液体聚山梨醇酯80(PS80)以大约5到10wt%的芹菜素与95到90wt%的聚山梨醇酯80的比例和少量的去离子以及任选地丙酮和/或乙醇在烧杯中混合；

·之后将混合物充分搅拌，以形成浓稠的浆状掺合物；

·之后在搅拌时将混合物缓慢加热（例如在气体火焰上）至相对较高的温度。加热过程伴随着水和存在于聚山梨醇酯80中的挥发性组分的煮沸蒸发。小心地操

作加热过程，以避免由于加热过程引起的起泡而使混合物从烧杯中溢出；

·在移除挥发性物质和加热至温度超过约200到300℃时，产生深褐色的透明液体，使得所有的固体芹菜素都增溶在聚山梨醇酯80混合物中；

·在冷却至周围环境温度时，得到粘性的、褐色的、透明的液体。芹菜素的含量越高，得到的颜色越深。

根据表X中所示的所公布的溶解度结果，将芹菜素在水、乙醇和聚山梨醇酯80中的溶解度列出如下：

表X-芹菜素的溶解度

在A/P80中的芹菜素的浓度通过HPLC-MS来测量。基于在粘性的A/P80液体中的4.05%浓度的芹菜素的测量值，芹菜素的含量为40.5mg/ml或40500ppm。

以下段落列出了针对A/PS80的实验观测。

·向标准的水合芹菜素乳液（含有大浓度的纳米颗粒）中添加A/PS80有助于增加饱和的可溶性浓度水平。增强的溶解度水平通过对穿过0.2微米过滤器的滤出液进行比色测试来定量测定。

·向普瑞来（广泛使用的杀菌液）中添加A/PS80，产生明显的芹菜素可溶性水平，这归因于普瑞来的高乙醇含量。用聚山梨醇酯80获得的可溶的芹菜素水平明显高于水合芹菜素和未加工芹菜素。

·将A/PS80加入普瑞来，然后应用实施例11的芹菜素乳液的实验效果良好。该思想是利用乙醇的良好的渗透和溶解度特征（应指出的是，乙醇在使用后会很快蒸发，这将倾向于使皮肤变干），接着使用本发明的芹菜素制剂来帮助皮肤的再水化。

由LCMS（液相色谱-质谱仪）测定的芹菜素在所选溶剂中的以重量%计的浓度如表XI所示。

表XI-所选溶剂中的芹菜素分析概要

额外的测试证明，存在有由于加热PS80和芹菜素至接近~250-300℃的高温而产生的、基本上是微不足道的分解产物。

图9显示了与AP80溶液对比的、在加热之前的PS80的统计学分析。在对照样品和本发明样品之间可观察到微不足道的差异，这表明表面活性剂并未降解。在图9中，所检测的每一种成分用点来表示。PS80是聚合物，因此显示了许多低聚物。这解释了图中大量的成分或点。X代表质量特征，其与AP80样品之间存在统计学差异。可观察到非常少的不同特征，表明了PS80没有明显降解。只有少数几个X的存在表明了对照样品和本发明样品之间的差异很少。

实施例14-另外的黄酮类聚山梨醇酯制剂

除了芹菜素，用聚山梨醇酯80进行的测试扩展到包含几种黄酮类的化合物。表XII包含了被选来进行用聚山梨醇酯80的溶解度测试的黄酮类的化学和物理特征的数据。

表XII-所测试的黄酮类的化学和物理特征概要

*饱和浓度溶解度根据所公布的来源而改变。

表XIII包含了多种黄酮类的聚山梨醇酯80溶解度测试结果的概要。

表XIII–使用PS80的黄酮类测试的概要

实施例15-通过高温处理方法的在聚山梨醇酯80以外的聚山梨醇酯中的溶解度

非离子表面活性剂被广泛用于化妆品和食品中，因为它们被认为是无害的，因为它们是多元醇如山梨聚糖、蔗糖和甘油的脂肪酸酯。因此，决定评价若干合适的非离子聚山梨醇酯结构的表面活性剂，以通过实施例13所公开的高温处理方法来提高饱和溶解性浓度。

表XIV列出了几种由脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖（山梨糖醇的衍生物）组成的非离子表面活性剂。所有所测试的表面活性剂是油性液体，其满足了在大于200℃的温度下保持稳定的准则。类似地，所有所测试的黄酮类（包括芹菜素）是基于其具有大于200℃的熔点来选择的。

当温度水平超过200到300℃时，可观察到黄酮类浆状混合物在颗粒溶解性和颜色（深褐色-红色）上的变化。

表XIV中所列出的非离子表面活性剂以HLB（亲水-亲油平衡值）值的升序来排列。HLB是用于表面活性剂的亲水（“好水”）和疏水（“厌水”）基团的关系的经验表达式。表面活性剂的HLB值越高，其水溶性越好。大多数是乳液（水包油乳状液）或膏霜（油包水乳状液）。最常用的乳状液类型即水包油(o/w)通常需要较高HLB的表面活性剂，优选为12-16，而油包水(w/o)乳状液需要低HLB的表面活性剂，优选为7-11。HLB值小于10的的表面活性剂是油溶性的，而那些大于10的是可溶的。

如表XIV所示，司盘20非常适于油包水的外用制剂，而聚山梨醇酯80将最适合用于增溶芹菜素于水包油的外用制剂中。

表XIV–通过高温处理方法的在非离子表面活性剂

中的芹菜素溶解度的概要

备注：*不是表面活性剂

实施例16-黄酮类在碱性溶液中的溶解度以及随后与外用载体混合

由于黄酮类在碱性水溶液（NaOH或KOH）中的相对高的溶解度，已经发现，向多种市售的弱酸性（即pH值从4.5至6.5）的外用组合物中添加黄酮类碱性溶液并同时用力搅拌以便均匀地分散所溶解的黄酮类，会使得该黄酮类几乎完全增溶于几种市售的外用组合物中。向外用组合物中添加增溶的碱性黄酮类获得了高碱性的混合物。

随后中和这些混合物，这通过在用力搅拌时添加会与NaOH反应的酸性剂如柠檬酸或HCl以分别形成柠檬酸钠或氯化钠来实现。在一些外用组合物中，黄酮类保持为增溶的。然而在几种外用组合物中，如果超过了黄酮类的溶解度极限，则在外用组合物中除了可溶部分之外还产生了微颗粒。

根据本发明的一些实施方案，制备了含有大约1.25wt%的溶解的黄酮类浓度的几种制剂。表XV包含了几种黄酮类制剂的概要。将含有0.63克的各种黄酮类溶解于5ml、1.0M的NaOH溶液中的浓缩溶液加入到45克的量的Cetaphil^TM保湿乳液中。随后通过加入柠檬酸的精细晶体来将碱性的制剂中和至稍微酸性的pH值。应指出的是，随着柠檬酸的加入而形成的柠檬酸钠也将充当化妆品制剂中的防腐剂。

选择Cetaphil^TM保湿乳液作为典型的水包油乳状液，其成分包括多种表面活性剂、分散剂、pH调节剂、防腐剂、乳化剂、增湿剂、润湿剂、抗炎剂、硅酮止痛剂、聚合物增稠剂、维生素、植物提取物及其结合物。表XVI包含了用于如表VII所示制剂中的Cetaphil^TM成分的清单。

表XV–多种黄酮类外用制剂

表XVI–Cetaphil^TM保湿乳液

实施例17-超声处理实验方法/程序

制备在表XVII中所列出的由大约40cc组成并容纳于1升的HDPE的Nalgene广口瓶中的6个样品，用于超声处理测试。将样品进行高水平的超声处理10分钟，使用设置为100的带有1/2英寸直径触角的QSonics S-4000超声仪。可调节超声处理时间和功率设置，以获得最佳的颗粒尺寸缩减轮廓。

超声波电子发生器将交流功率转换成可驱动压电转换器/换能器的20KHz信号。由于内部压电晶体的特性，换能器将该电信号转变成机械振动。振动被扩大，并沿着触角/探针的长度向下传输，触角/探针的端头纵向地扩张和收缩。端头运动的距离取决于用户通过振幅控制旋钮所选择的振幅。例如，使用在测试中所使用的1/2英寸的触角，在50%的振幅设定下，端头将扩张和收缩大约60微米（每秒20K次）。在100%下，端头偏转大约120μm。在液体中，端头的快速振动引起气蚀效应，以及微观气泡的形成和猛烈破裂。成千上万的气蚀气泡的破裂在气蚀区域释放巨大的能量。探针端头的直径指示了可被有效加工的样品的数量。超声仪已用于多种应用，包括掺和、乳化、分散、均质化以及解聚等过程。

很明显，由声波能量产生的气蚀力直观地导致了颗粒聚集体的分解，如颗粒悬浮液的形成所证明的，当在延长的时间内保持无扰动时，该悬浮液明显不易沉降出来。对于所建议的10分钟持续时间来说，由于输入20K振动/秒的相对高的声波能量的输入（100%设置），~200cc的超声处理过的样品尺寸导致大约30℃至40℃的温度上升。

根据经验，升高的加工温度会促成精细颗粒的聚集（可能是由于介质粘度的减小和增加的颗粒碰撞的可能性等）。通过使用多种主动式冷却手段（主要是传热线圈等），可以有许多选择来限制超声处理溶液的温度上升。为限制由于声波能量输入所引起的温度上升，将含有样品6的烧杯浸入冰浴中。环绕的冰浴限制了这些样品的温度升高至高于环境温度约20℃。

除了乳化和均质化，超声处理的能量还可以为样品排气，这是所希望的效果，因为所溶解的空气的移除有助于将制剂成分的潜在氧化最小化。当表明将超声仪探针的端头插入到液体中至大约2英寸不成问题时，与含有表面活性剂的制剂相关的关于起泡的担忧可以减轻。随后，多个样品的测试证明了不发生起泡。

所超声处理的样品在表XVIII中示出。颗粒尺寸分布数据从马尔文粒度分析仪上获得。

数据清楚地表明，所有经超声处理的样品的颗粒尺寸分布(PSD)已明显减小。表XIII清楚地显示了在75%和90%水平的“累积体积”已被大幅减小。

超声处理是非常有用的预处理和后处理操作，其在分解由于范德华力而连结在一起的聚集体以获得颗粒尺寸分布的改善方面是有用的。

实施例18-HPH实验方法/程序

制备表XIII所列的样品，用于高压均质化(HPH)测试。HPH测试在BEEI的DeBEE2000装置上进行。

DeBEE技术产生强烈的力来使液滴和颗粒仅在一次性通过其系统之后便分解至纳米尺寸。DeBEE 2000增强器由液压驱动和微处理器来控制，以向DeBEE均质化单元输送持续的压力和流量。颗粒尺寸和颗粒尺寸分布通过流量的持续性和所施加的压力来测定。

使大约150cc的样品尺寸以大约20-30cc/min的速度流过DeBEE。在每一次运行之后，用去离子水清洗装置以除去之前所测试的残留物，然后接着注入去离子水，为下一个将要测试的样品作准备。在每一次测试之后，使流出的样品流经马尔文粒度分析仪以评估PSD结果，之后下一个样品流过HPH装置。对所选样品进行的测试还包括：“热交换(HX)”冷却和多程/周期测试，以评估温度控制和多个HPH周期对PSD的影响。显然，HX冷却被证明了可获得较细化的PSD，而多程如果对PSD有影响的话，也是很少的影响。一般来说可以估计，在所测试的条件下，可观察到离开压力室的样品的温度升高至大约高于周围环境40℃至50℃。

表XIV中所列出的9个样品经过DeBEE 2000装置加工。在15K psi、30K psi和45K psi的内室压力下，在样品3BEE上进行4次HPH测试，主要是用来测定压力对PSD的影响，以及测定HPH加工变量对含芹菜素样品的影响。鉴于三个样品3的PSD数据，决定剩下的测试在45K psi水平下运行。如表III所示，对于经受了极端的HPH加工条件的所有样品的PSD缩减是显著的。经历了1程HPH的所有样品的均匀性产生在90%累积体积水平下的小于1微米的PSD。同样地，未加工芹菜素的PSD的尺寸缩减也是明显的。

很明显，由HPH能量传递产生的气蚀力和剪切力确实导致了颗粒聚集体的分解，如颗粒悬浮液的形成所证明的那样，当在延长的时间内保持无扰动时，所述悬浮液明显不易沉降出来。

用**标志来标识的经超声处理的样品（样品2和5）也包括在表XV中。

数据清楚地表明，超声处理过的和HPH样品的颗粒尺寸分布(PSD)已被显著缩减。对于超声处理和HPH加工的样品，在75%和90%水平的“累积体积”已显著缩减。相当明显的是，由明显的双峰PSD分布结果所证实的对较大的未加工颗粒的聚集体的分解产生了大约为350纳米的累积平均PSD。

表XVII–样品描述

备注：*HA是透明质酸

**乳液（水相）由1%HA、1%丙三醇、1%维生素B5、2.5%维生素B3和余量的水组成。

表*XVIII–“超声处理”的测试结果

备注：*“颗粒尺寸分布”数据从“Malvern Mastersized”颗粒尺寸分析仪中获得。

表*XIX–高压均质化(HPH)的结果

备注：*“颗粒尺寸分布”数据从“Malvern Mastersized”颗粒尺寸分析仪中获得；

**这些样品经过如表XIV所示的预超声处理。

实施例19-使用芹菜素外用制剂对银屑病患者的治疗

五个对Regicide药、甲氨蝶呤和几种处方药物无响应的银屑病患者，由于一天两次地使用了含有透明质酸的含芹菜素制剂而体验了他们的银屑病病情的显著改善。所使用的乳液通过酸化增溶的芹菜素钠盐来配制。水包油乳状液制剂含有1.5%的分散的水合芹菜素微颗粒。出乎意料的是，使用该芹菜素乳液的所有个人体验了他们的包括染上银屑病的手、腹股沟、腿和膝盖的皮肤外观的逐渐改善。可观察到这些患者的初始的、客观的改善所需要的时间是1到2个月不等。

实施例20-原位法制造制剂

含有在Cetaphil保湿乳液（其成分在表XII中列出）之中的1.25wt%的芹菜素的100克批料通过如下步骤制备：

·将90克预先加热至略微超过140°F温度的Cetaphil加入到300cc烧杯中；

·向液体Cetaphil乳液中加入1.25克如实施例1所述的未加工芹菜素粉末。任选地，可向该流动性混合物中加入其他成分，包括透明质酸、维生素等。

·将高温下(135°F-150°F)的~90cc的流动性溶液用QSonics S-4000超声仪在90%的振幅水平下超声处理总共10分钟。在每1分钟的超声处理持续时间后，暂停超声处理30秒。

·之后向超声处理过的溶液中加入水，以得到100克的总溶液重量，然后将所得溶液在90%的振幅水平下超声处理~10秒，之后倒入分配器容纳管中。

实施例21-使用人类皮肤和老鼠皮肤的来自制剂的芹菜素的体外经皮吸收

可利用体外经皮吸收测试来估定潜在的生物利用率。本研究的目的是表征在对来自选择性手术的离体人类皮肤和新鲜的老鼠皮肤进行外用涂敷之后的来自所公开的本发明制剂的芹菜素的体外经皮吸收。该研究是采用根据FDA和AAPS的“Report of theWorkshop on Principles and Practices of in vitro Percutaneous Penetration Studies:Relevanceto Bioavailability and Bioequivalence(Skelly et al.,1987)”的程序来操作的。对来自单一的捐赠者的人类组织和鼠科动物组织给予5mg/cm²的制剂。

体外经皮吸收研究评估了来自如本发明所述的原型制剂的芹菜素的散布和渗透。

将5mg/cm²的临床有关剂量用于从选择性手术获得的来自单一捐赠者的用植皮刀切割的人体腹部皮肤上。该组织的厚度为0.021-0.039英寸(0.533-0.991mm)。

将5mg/cm²的临床有关剂量用于老鼠的组织。该组织的厚度0.011-0.025英寸(0.279-0.635mm)。

结果

图10是用了几种含有1.5%芹菜素浓度的外用制剂的人体组织的表皮、真皮和接受液芹菜素的特征的图示。类似地，图11是用了几种含有1.5%芹菜素浓度的外用制剂的老鼠组织的表皮、真皮和接受液芹菜素的特征的图示。

源自原型制剂的芹菜素表皮沉积（在人体组织中）的效率是所使用的芹菜素剂量的15.5至45.7%。源自原型制剂的芹菜素表皮沉积（在鼠科动物组织中）的效率是所使用的芹菜素剂量的15.0至88.3%。

源自原型制剂的芹菜素真皮沉积（在人体组织中）的效率是所使用的芹菜素剂量的0.446至2%。源自原型制剂的芹菜素真皮沉积（在鼠科动物组织中）的效率为所使用的芹菜素剂量的8.0至14.4%。

从制剂中输送而来的芹菜素总量是取决于产品中的芹菜素浓度和输送的效率。在每平方厘米皮肤上给予5mg制剂24小时（接受相水平）后，渗入人体组织的芹菜素的计算量为4.04至9.88ng/cm²的芹菜素。

在每平方厘米的皮肤给予5mg制剂24小时（接受相水平）后，芹菜素表皮沉积（在人体组织中）的计算量为22651至34293ng/cm²的芹菜素。

在每平方厘米的皮肤给予5mg制剂24小时（接受相水平）后，芹菜素表皮沉积（在鼠科动物组织中）的计算量为11232至66209ng/cm²的芹菜素。

在每平方厘米的皮肤给予5mg制剂24小时（受体相水平）后，芹菜素真皮沉积（在人体组织中）的计算量为334至1499ng/cm²的芹菜素。

在每平方厘米的皮肤给予5mg制剂24小时（接受相水平）后，芹菜素真皮沉积（在鼠科动物组织中）的计算量为6002至10814ng/cm²的芹菜素。

本发明的PS80制剂能向表皮和真皮皮肤层输送有效的芹菜素浓度。

上述所引用的所有文件和参考文献在此通过引用而全部结合于本申请中。

虽然已经参考了示例性实施方案来描述了本发明，但是本领域的技术人员应理解的是，可以作出各种变化以及用对效物来替代其要素而不脱离本发明的范围。此外，可作出许多修改来使特定的情形或材料适应于本发明的教示而不脱离本发明的实质范围。因此，本发明不限制于所公开的预计是实现本发明的最优模式的具体实施方案，但本发明将包括所有落入所附权利要求范围内的实施方案。

Claims (43)

1.一种组合物，包括：

水合微颗粒黄酮类，和

载体。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，黄酮类在水中的溶解度小于1mg/ml。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，黄酮类选自黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、黄酮醇（或儿茶酚）、花色素和异黄酮。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，黄酮类是选自芹菜素和木犀草素的黄酮。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，微颗粒黄酮类具有50-1000纳米的平均尺寸。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含透明质酸。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，载体包括防止或减少水合微颗粒黄酮类的聚集的化合物。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，组合物的形式为保健品、膳食补充剂、食品补充剂或医疗食品。

9.一种组合物，包括：

黄酮类，和

热稳定的黄酮类增溶化合物，

其中，所述组合物通过将黄酮类和所述热稳定的黄酮类增溶化合物混合至所述黄酮类溶解于所述表面活性剂中的温度来形成。

10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，黄酮类是芹菜素，而所述热稳定的黄酮类增溶化合物是非离子表面活性剂。

11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括醇。

12.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，其中组合物的形式为保健品、膳食补充剂、食品补充剂或医疗食品。

13.一种用于透皮式施用黄酮类的膏药，包括具有两个面的基片，第一面具有根据权利要求1或9所述的组合物和粘合剂，而第二面带有不能渗透到第一面上的组合物和粘合剂中的材料。

14.一种生产水合黄酮类的方法，包括：

将黄酮与碱金属氢氧化物混合，以形成碱金属黄酮盐的水溶液；

用酸性剂将碱金属黄酮类盐的水溶液酸化至小于7.0的pH水平，以形成水合黄酮类沉淀物；

其中，酸化步骤是在产生具有50-1000纳米的平均尺寸的黄酮类纳米纤维的条件下进行。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在酸化步骤之后是过滤沉淀物的步骤。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，过滤步骤包括将酸化步骤的产物调节至pH值小于7，以及用大于2微米的过滤器将材料过滤。

17.一种生产水合黄酮类的方法，包括：

将黄酮类溶解在无毒有机溶剂中，以形成混合物；和

向所述混合物中加入水，以形成水合黄酮类沉淀物；

其中，加水步骤在产生具有50-1000纳米的平均尺寸的黄酮类纳米纤维的条件下进行。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，溶解步骤在低于有机溶剂的沸点大约20℃的温度下进行。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，水合黄酮选自水合芹菜素和水合木犀草素。

20.一种形成水合黄酮类的外用制剂的方法，包括：

将黄酮类在水中与碱金属氢氧化物混合，以形成碱金属黄酮类盐溶液；

将所述碱金属黄酮类盐溶液加入到皮肤病学上可接受的载体中；

调节制剂的pH至皮肤病学上可接受的pH；

其中，调节pH步骤在产生具有50-1000纳米的平均尺寸的黄酮类纳米纤维的条件下进行。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，将制剂的pH值调节至4到8。

22.一种制备水合黄酮类的外用制剂的方法，包括：

将黄酮类溶解在醇中；

将醇溶解的黄酮类加入到皮肤病学上可接受的载体中；

调节制剂的pH值至皮肤病学上可接受的pH值；

其中，调节pH步骤是在产生具有50-1000纳米的平均尺寸的黄酮类纳米纤维的条件下进行。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，将制剂的pH值调节至4到8。

24.一种制备黄酮类的外用制剂的方法，包括：

将黄酮类加入到乳状液载体中，以形成混合物；

加热所述混合物，直至其具有与水近似的粘度；和

利用气蚀作用力来形成混合物中的微颗粒的分散体系。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，乳状液是水包油或油包水乳状液。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，形成分散体系的步骤利用超声处理或高压均质化来完成。

27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，将混合物加热至大约120°F-170°F。

28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，乳状液包括抑制微颗粒聚集的试剂。

29.一种制备增溶的黄酮类组合物的方法，包括：

将黄酮类颗粒与热稳定的黄酮类增溶化合物混合，以形成混合物；

加热所述混合物至黄酮类颗粒被增溶的温度，以形成溶液；和

冷却所述溶液。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，热稳定的黄酮类增溶化合物是非离子表面活性剂。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯，而黄酮类是芹菜素。

32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括向溶液中加入小链醇以形成粘度减小的溶液。

33.一种减少和/或预防阳光暴晒后果的方法，包括在皮肤上涂敷治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的防晒霜制剂。

34.一种治疗阳光暴晒后果的方法，包括在阳光损伤的皮肤上涂敷治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的制剂。

35.一种治疗哺乳动物中的癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的制剂。

36.一种减小在哺乳动物中发生癌症的可能性的方法，包括对哺乳动物给予预防性量的包括如权利要求1或9所述组合物的制剂。

37.一种治疗哺乳动物中的痤疮、脱发、皮肤致敏和过敏、干燥皮肤（干燥病、鱼鳞癣）、真菌感染和酒渣鼻、接触性皮肤病的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的制剂。

38.一种治疗哺乳动物中的自身免疫性疾病的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的制剂。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，自身免疫性疾病选自银屑病、狼疮和关节炎。

40.一种治疗在哺乳动物中的TNFα相关疾病的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的黄酮类制剂。

41.一种减小发生在哺乳动物中的TNFα相关疾病的可能性的方法，包括对哺乳动物给予预防性量的如权利要求1或9所述组合物的黄酮类制剂。

42.一种治疗哺乳动物中的IL-1β相关疾病的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给予治疗有效量的包括如权利要求1或9所述组合物的黄酮类制剂。

43.一种减小发生在哺乳动物中的IL-1β相关疾病的可能性的方法，包括对哺乳动物给予预防性量的如权利要求1或9所述组合物的黄酮类制剂。

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