CN107058503A - 雌激素相关受体α作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物的用途及其相关应用 - Google Patents

雌激素相关受体α作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物的用途及其相关应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种雌激素相关受体α(ERRα)作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物的用途及其相关应用，本发明揭示了ERRα以及下调或阻断皮肤鳞状细胞癌中ERRα分子表达的活性成分在制备诊断和治疗皮肤鳞状细胞癌的相关试剂盒、药物上的应用，本发明为治疗皮肤鳞状细胞癌提供了新的诊断和治疗手段。

Description

雌激素相关受体α作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物的用途 及其相关应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤防治技术领域，尤其涉及一种雌激素相关受体α作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物的用途及其相关应用。
背景技术
皮肤癌是人类最普遍的癌症之一，皮肤癌的发生主要是由于表皮细胞不可控的增长所致，皮肤癌分为基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)、鱗状细胞癌(squamouscell carcinoma,SCC)和黑色素瘤(melanoma)三种类型，它们分别起源于表皮的基底细胞、鳞状细胞和黑色素细胞。其中基底细胞癌和鱗状细胞癌又统称为非黑素瘤(Non-melanoma)，在非黑素瘤中，基底细胞癌所占比例(80％)大于鳞状细胞癌(20％)，但由于鳞状细胞癌具有转移性，因此它的危害高于基底细胞癌。皮肤鳞状细胞癌通常是局部的，但是可能会转移。它可发生在身体的任何区域，但多发于暴露在阳光下的部位，如头、颈、手背等，可能与紫外的福射有关。鳞状细胞癌的治疗目前可用局部药物疗法、切除法、电干燥、辐射疗法等，但这些治疗方法的弊端仍然存在。对皮肤鳞状细胞癌发生机制的研究和寻找开发抗皮肤鳞状细胞癌的药物是当前皮肤肿瘤防治中的重要研究领域。
为了逆转皮肤鳞状细胞癌，提高化疗疗效，本领域迫切需要通过多种方式研究皮肤鳞状细胞癌发生的机制、皮肤鳞状细胞癌的关键基因靶点，并根据这些靶点设计治疗皮肤鳞状细胞癌的新药，从而引导皮肤鳞状细胞癌靶向性治疗。
孤儿核受体(orphan nuclear receptors,ONRs)是属于转录因子超家族中的一员，是一类无需与配体结合即可产生生物学功能的核受体，可直接参与调控多种功能有关的基因。ERR(estogen-relatedreceptors,NR3B)是一个重要的ONR超家族，ERRs属于第三类核受体超家族，主要包括3种亚型，分别是ERRα(NR3B1)、ERRβ(NR3B2)和ERRγ(NR3B3)。ERRs之所以被称为“雌激素相关受体”是因为ERRs不仅参与雌激素的复杂信号转导体系，并且与雌激素引起的疾病密切相关。而与此同时，ERRs和雌激素受体α(ERα)享有较高的序列同源性，可被非激素信号激活。ERR主要包括3个功能域：N末端结构域(N-terminal domain,NTD)、DNA结合域(DBD)和配体结合域(ligand-binding domain,LBD)，LBD还包括活化功能2(AF2)基序。NTD保守度较低，包含了活化功能区1(activation function,AF1)，主要参与转录后的共价修饰，例如磷酸化和泛素化的位点修饰。ERR受体DBD区域包含两个锌指结构，主要是识别和结合靶基因DNA的调节区域内的特殊序列。ERR位于C端的LBD高度保守，包含用于受体二聚化的配体结合袋位点，可与辅激活因子如过氧化物酶体增殖因子受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)辅活化子1α(PPARγcoactivator 1α,PGC-1α)、PGC-1β和辅抑制因子相互作用，以此调节ERR的转录活性(相关文献：Bianco S,et.al,J Steroid Biochem Mol Biol.2012,130(3-5):180-185；GiguèreV,et.al,Cold Spring Harb Symp Quant Biol.2011,76:57-61；Deblois G,et.al,NatRev Cancer.2013,13(1):27-36)。
ERRα在组织中表达较广，如心脏、肠道、脑、脊髓、棕色脂肪、骨骼、肾和子宫内膜癌细胞中ERRα均表达，在其表达的众多细胞中主要定位于细胞核，基于特异性环境、营养或者代谢信号，参与许多生理过程，尤其是由ERα参与调控的生理过程，并且影响ERα的信号通路。ERRβ主要与生物发育相关，主要表达在肝、胃、骨骼肌、心脏、肾脏等部位。ERRγ主要表达于脊髓、中枢神经系统、肝脏及乳腺组织(相关文献：Stein RA,et.al,Endocr RelatCancer.2006,13 Suppl 1:S25-32；Ariazi EA,et.al,Curr Top Med Chem.2006,6(3):203-215；Ranhotra HS,J Recept Signal Transduct Res.2010,30(4):193-205；AriaziEA,et.al,Cancer Res.2002,62(22):6510-6518)。
近年来，研究揭示ERRα与雌激素相关的乳腺癌、子宫内膜癌和宫颈癌等雌激素依赖性肿瘤密切相关，更有研究表明众多非雌激素依赖性肿瘤如前列腺癌、胃腺癌和结直肠癌等的发生发展和临床预后也与ERRα的表达相关。临床研究证实，ERRα在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤中表达显著上调，是一个预后不良的独立风险因子。在恶性侵袭性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，下调ERRα抑制了MDA-MB-231的迁移能力，而再表达ERRα则恢复了MDA-MB-231的迁移活性，表明ERRα在乳腺癌细胞的迁移中扮演着重要的角色。并且，ERRα可与HIF-1α以蛋白－蛋白相互作用的方式结合，共调控肿瘤细胞内缺氧/常氧条件下HIF-1α的靶基因转录。Ao等在对ERRα参与低氧转录应答与实体瘤生长的相关性研究中发现，ERRα可与HIF-1α相互作用并促进HIF-1α诱导的转录，对HIF-1α功能影响极为重要。通过上调/下调ERRα表达或使用ERRα抑制剂，可以有效抑制缺氧基因的转录活性，从而降低体内实体瘤的血管生成与增长。这些研究表明，ERRα可能是多种肿瘤潜在的治疗靶点(相关文献：Suzuki T.,et.al,Cancer research.2004,64(13):4670-4676；Stein R.A.,et.al,Cancer Res.2008,68(21):8805-8812；Boudjadi S.et.al,Am J Pathol.2013,183(1):266-276；Ao A,et.al,Proc NatlAcad Sci U S A.2008,105(22):7821-7826)。并且，ERRα反向激动剂XCT790抑制了多种肿瘤细胞的增殖及血管新生。ERRα反向激动剂SR16388有效抑制了裸鼠荷瘤模型中前列腺癌的增长。这些研究表明，靶向ERRα的调节剂有可能作为临床上有效的抗肿瘤药物(相关文献：Zhang L.,et.al,Eur J Pharmacol.2015,769:167-176；Wu F.,et.al,Chem Biol Interact.2009,181(2):236-242；Wang J.,et.al,CellProlif.2010,43(2):103-113；Duellman S.,et.al,Biochem Pharmacol.2010,80(6):819-826.)。
发明内容
本发明的目的在于通过研究皮肤鳞状细胞癌中ERRα的临床意义以及调控皮肤鳞状癌细胞增殖及迁移的分子途径，结果显示了ERRα可作为皮肤鳞状细胞癌治疗新靶点，为皮肤鳞状细胞癌患者的治疗提供切实可行的依据；下调或阻断皮肤鳞状细胞癌中ERRα分子表达的活性成分在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物上的应用。同时为皮肤鳞状细胞癌患者的诊断提供灵敏度良好的方法和试剂盒，并为治疗提供切实可行的依据。
为了实现上述目的，发明人探究了ERRα在皮肤鳞状细胞癌患者的皮肤鳞状细胞癌组织中的蛋白表达情况。免疫组化结果显示，ERRα在皮肤鳞状细胞癌组织中丰富表达，而在正常皮肤组织中则极微弱表达，标志着这也许能成为一个新型生物标志物。
继而研究发现了ERRα在人皮肤鳞状癌细胞A431有表达，ERRα反向激动剂XCT790及靶向ERRα的shRNA处理A431后，显著地抑制了A431的增殖及迁移。XCT790将A431细胞周期阻滞在G0/G1期，诱导了Bax上调及Bcl-2下调。在分子作用机制上，XCT790处理A431后，下调上皮间质转化(EMT)，调控STAT3/ATR/p53介导的信号通路。本发明有助于为胶质瘤免疫治疗提供新方向。本发明对于皮肤鳞状细胞癌患者治疗方案的选择、减少复发、改善患者的生存率等都具有重大意义。
本发明提供了ERRα在制备诊断或治疗皮肤鳞状细胞癌药剂中的用途，所述的ERRα是雌激素相关受体家族成员。
人ERRα在NCBI的登录号是NM_004451.4，蛋白参见NP_004442.3，steroid hormonereceptor ERR1 isoform 1[Homo sapiens]。
ERRα可以作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记。
所述的抗皮肤鳞状细胞癌药剂的活性成分是阻断皮肤鳞状细胞癌ERRα分子表达的制剂。
本发明还提供了一种抗皮肤鳞状细胞癌药剂，所述的抗皮肤鳞状细胞癌药剂的活性成分是阻断皮肤鳞状细胞癌ERRα分子表达的制剂；即下调或阻断皮肤鳞状细胞癌中ERRα分子表达的活性成分在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物上的应用；所述下调或阻断皮肤鳞状细胞癌中ERRα分子表达的活性成分为ERRα的拮抗剂或者反向激动剂、ERRα的抗体、针对ERRα编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸。
本发明还提供一种检测皮肤鳞状细胞癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有检测ERRα表达量的试剂，利用该试剂盒检测ERRα表达量，进一步为皮肤鳞状细胞癌的临床分期、皮肤鳞状细胞癌病人预后或者皮肤鳞状细胞癌进程提供佐证；进一步地，所述的试剂盒中还含有ERRα的标准样品或者分子量标记；更优选地，所述的试剂盒中含有检测ERRα的扩增引物或者结合多肽。
本发明涉及肿瘤治疗领域，发明公开了ERRα作为抗皮肤鳞状细胞癌治疗靶点的应用。利用此靶点可有效靶向治疗抗皮肤鳞状细胞癌，提高疗效同时降低毒副作用，对于开展抗皮肤鳞状细胞癌的靶向治疗乃至开发新的个体化综合治疗方式，意义重大。ERRα目前的用途涉及作为多种肿瘤(但不包括皮肤肿瘤)及代谢性疾病的治疗靶点，对于本发明涉及的ERRα在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的用途属于首次公开，由于ERRα在皮肤鳞状细胞癌中高表达，而且下调ERRα极显著抑制皮肤鳞状癌细胞的增殖及迁移活性，具备突出的实质性特点，因此，ERRα在皮肤鳞状细胞癌的防治上的应用具有开创性的进步。
附图说明
图1A为实施例中ERRαmRNA在A431及HaCat细胞内的表达情况；
图1B为实施例中ERRα蛋白在A431及HaCat细胞内的表达情况；
图2A显示了实施例中ERRα特异性反向激动剂XCT790剂量依赖性下调A431中ERRαmRNA水平的结果；
图2B显示了实施例中XCT790剂量依赖性下调A431中ERRα蛋白表达水平的结果；
图2C显示了实施例中XCT790剂量依赖性抑制A431细胞增殖的结果；
图2D显示了实施例中XCT790时间依赖性抑制A431细胞增殖的结果；
图3A显示了实施例中ERRαshRNA下调A431中ERRαmRNA水平的结果；
图3B显示了实施例中ERRαshRNA下调A431中ERRα蛋白表达水平的结果；
图3C显示了实施例中ERRαshRNA抑制A431细胞增殖的结果；
图4A显示了实施例中XCT790抑制A431迁移的结果；
图4B显示了实施例中ERRαshRNA抑制A431迁移的结果；
图5显示了实施例中免疫组化测定ERRα在人皮肤鳞状细胞癌组织及正常组织中的表达的免疫组化切片。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
以下将详细说明利用本发明进行的关于ERRα在各项生物学及药理学研究内容。
实施例1
使用荧光定量PCR实验测试XCT790及ERRαshRNA对A431(人源皮肤鳞状癌细胞)中ERRα的转录调节活性。
本实施例阐明了本发明涉及的XCT790及ERRαshRNA可以有效地抑制人源皮肤鳞状癌细胞A431中ERRα基因的转录，说明1)ERRαmRNA在人皮肤鳞状癌细胞中表达，且表达量高于正常皮肤细胞；2)用XCT790或ERRαshRNA显著下调了A431中ERRαmRNA水平。荧光定量PCR测试技术是本领域工作人员熟悉的技术。
1、细胞铺板：
提前37℃温浴10％FBS的DMEM细胞培养液和胰酶，将无菌操作台用酒精擦拭灭菌之后，将胰酶和DMEM细胞培养液用酒精擦拭之后放进无菌操作台，取出状态良好的对数生长期的细胞，观察细胞形态之后，如细胞已经80％融合之后，开始传代。洗弃培养皿内的旧培养液，用无菌1mL PBS洗3-5遍之后，加入温浴好的胰酶1mL，水平摇晃培养皿使胰酶分布均匀，消化充分。将细胞放入培养箱1-2min，取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞间隙变大且细胞细胞收回突起变圆，立即加入10％FBS培养液的终止消化，用移液枪轻柔地吹打细胞，反复轻柔吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成均匀的细胞悬液，调整细胞密度。以细胞数5×106个/孔将细胞悬液接种至6孔板中，每孔2mL，放入37℃5％CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸弃原10％FBS培养液，并用无菌PBS洗3-5遍之后，换为0.1％FBS培养液，再饥饿培养24h，使细胞在G0/G1期处于均一化状态。
2、细胞总RNA提取与纯度检测：
1)在6孔板中A431或HaCat在被相应浓度的XCT790(ERRαshRNA)干预24h后，吸弃细胞上清旧培养液，每孔加入1mL TRNzol试剂，并用1mL移液枪反复吹打10次左右，使细胞充分裂解。
2)将TRNzol和细胞混合液倒入1.5mL无菌无RNA酶离心管，于室温静置5min，以确保核酸蛋白复合物能够充分分离。
3)加入200μL氯仿到上述装有TRNzol及细胞混合液的1.5mL离心管中，盖紧管盖后在旋转震荡仪上摇晃15s左右，于室温下静置3min后，于4℃，12000rpm离心机离心15min。离心后的混合液分为清晰的三层，用移液枪吸取含有RNA的最上层水相，用移液枪取约450μL并转移至新离心管中，将剩下的两层连同离心管一同扔弃。避免误吸入中间层。
4)以1:1比例向每管加入450μL异丙醇，与每管中的上述上清液轻柔翻转混匀后，将淡黄色的混合液在室温下放置约20min左右。置于4℃，12000rpm离心机离心10min，吸弃上清。留取少量上清液体于离心管底部防止RNA被吸出，在室温下将离心管盖子打开使液体挥发至离心管底部的白色胶状沉淀析出，离心管底部的白色胶状沉淀即为所提RNA。
5)再向每个离心管中加入1mL DEPC水配制的75％乙醇(防止RNA降解)洗涤沉淀。于4℃，5000rpm离心机离心3min。离心后向沉淀反方向迅速倒掉上清液，盖紧管盖，短暂离心。再用移液枪吸弃管中剩余的少量液体。此过程反复三次，以提高RNA纯度。
6)室温下将离心管盖子打开敞开管口晾干约2～3min后，看到白色沉淀变为半透明即可，马上加入15μLDEPC处理的ddH2O，反复吹打使RNA充分溶解。
7)取2μL上述已提取的细胞溶解总RNA，以1:50的比例加入98μL DEPC水稀释为检测样品。用DEPC水调零校准后，采用紫外可见分光光度计测定样品在260nm及280nm处的吸光度值，每个待测样品的吸光度值均重复测定3次，取平均值。并计算A260/A280的比值，用来检验所提RNA的纯度。若所提RNA的A260/A280的比值在1.8～2.0区间范围内，那么可以认为所提RNA的纯度较高，可以用来做后续实验使用。用A260吸光度值计算所提RNA的样品浓度，计算公式如下。
计算公式为：RNA浓度(μg/μL)＝A260×稀释倍数(50)×40×3.3/1000
用DEPC水调整将RNA样品浓度调整为0.5μg/μL方便后续转录，于-20℃冰箱保存或者反转录为cDNA保存于4℃冰箱。
3、逆转录
按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)
轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:
得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。
4、Real Time PCR
反转录反应得到扩增模板后，选择Premix Ex Taq II进行Real Time PCR反应的操作方法，以GAPDH为内参条计算相对表达量，应用Applied Biosystems7500 PCRSystem进行扩增，反应液的配制如下：
按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。
引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0μM范围内调整引物浓度。
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性一个循环95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应四十个循环95℃ 5秒60℃ 34秒
PCR反应中的所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并用灭菌ddH2O调整至10μM，于-20℃分装保存，反复冻融影响引物的扩增效果。引物的具体序列如下：
ERRα F:ATCTGCTGGTGGTTGAACCTG
R:AGAAGCCTGGGATGCTCTTG
PCR反应的退火温度和循环数等应根据模板DNA、引物长度、目的片段等具体情况进行适当调整，进行条件的优化。
实验结果表明，ERRαmRNA在人皮肤鳞状癌细胞A431中表达，且表达量高于正常皮肤细胞HaCat中(图1A)；XCT790或ERRαshRNA显著下调了A431中ERRαmRNA水平(图2A及3A)。
实施例2
使用Western Bloting测试XCT790及ERRαshRNA对A431(人源皮肤鳞状癌细胞)中ERRα蛋白表达水平的影响。Western Bloting细胞增殖实验是本领域工作人员熟悉的技术。
1、提取A431细胞总蛋白
XCT790或ERRαshRNA干预相应的时间之后，吸弃原细胞培养班中旧培养液，用预冷的PBS将细胞洗2-3遍，每个6孔板的孔中加入200μL细胞RIPA裂解液(使用之前数分钟之前加入PMSF终浓度为1μM)，用枪吹打数下，是裂解液和细胞充分接触。1-2s之后，细胞被充分裂解。裂解充分之后，在冰上用细胞刮刀收集细胞。用移液枪将裂解液移入1.5mL离心管，吹打混匀，置于冰上30min。于4℃，12000rpm离心15min，将上清液转移至新1.5mL离心管中。
2、A431细胞总蛋白浓度检测及调整
采用BCA蛋白浓度测定方法测定每个蛋白样品浓度，并将蛋白样品浓度调至3μg/μL。加入5×蛋白上样缓冲液之后，于100℃水中煮沸5min使蛋白样品变性，并于-80℃分装冻存，避免蛋白样品反复冻融。
3、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳(SDS-PAGE)
1)制备12％的SDS-PAGE胶
使用Bio-rad配套的制胶工具，将两块玻璃板对齐后用夹子夹紧，固定在制胶架上，按以下配方和顺序首先制备12％的分离胶：
用移液枪将混合液反复吹打混匀后，将混合液用移液枪缓慢注入上述的两块玻璃板中的夹层之中，注意避免加入分离胶混合液的过程中产生气泡，每组玻璃板约加入3.5-4mL分离胶混合液，使分离胶混合胶液的液面距玻璃板顶端约2.5cm左右。然后在胶液上层缓慢地加入去离子水用于封胶，将夹了分离胶的玻璃板于室温静置30min使分离胶凝固。分离胶凝固之后，缓慢地倒去上层用于封胶的去离子水，并用滤纸吸干玻璃板之间的残余去离子水。然后按以下配方和顺序制备上层5％的浓缩胶：
用移液枪将浓缩胶混合液混匀后缓慢地加在上述的已凝固的分离胶上层，共约加入2mL浓缩胶，最终使胶液液面与玻璃板齐平，并迅速且轻柔地插入梳子，然后用滤纸吸去溢出的胶液，注意避免加入浓缩胶混合液和插入梳子的过程中产生气泡。于室温静置30min使浓缩胶凝固。待浓缩胶凝固后，轻轻拔出梳子，以免使加样孔变形。
2)蛋白样品上样与电泳
将制好的12％的SDS-PAGE胶固定在Bio-rad配套的电泳槽中，并向电泳槽内倒入配置好的1×SDS-PAGE电泳缓冲液，加至相应的刻度线。取已与5×蛋白上样缓冲液混匀并煮沸变性的蛋白样品10μL，冰上冷却后，并上样之前用移液枪将蛋白样品轻柔吹打混匀，然后加至加样孔中，每孔5μL的蛋白样品。待全部加样完毕后，将电泳槽置于铺满碎冰的脸盆中防止电泳液温度过高影响电泳，接通电源后，开始电泳。电泳条件：电压80V约30min，待样品进入分离胶后换为130V电压约2h，电泳条件随目标蛋白大小作适当调整。当溴酚蓝电泳至达分离胶边缘时，马上切断电源开关，停止电泳。
4、转膜
按胶上的欲染Marker条带以确定目的蛋白在胶上的位置，然后用切胶板切下目的蛋白所需范围的胶，将切下的胶轻柔缓慢地放到膜转移缓冲液中浸泡。用尺子量好切下的胶的尺寸并按切下凝胶尺寸大小裁剪6层滤纸(三层+三层)和PVDF膜，应该使膜的尺寸比凝胶略大一些，而滤纸尺寸应小于或者等于胶的尺寸，这样可以防止夹在凝胶最外层的两层滤纸接触造成短路。剪好PVDF膜之后，将剪好的PVDF膜放入甲醇中使甲醇刚好没过PVDF膜，浸泡5-10s，泡到膜全透明。然后再将PVDF膜与六层滤纸一同放入转膜液中再浸泡约2～3min。用平头镊制作转膜的“三明治”结构，即从上至下分别为：3层滤纸→胶→PVDF膜→3层滤纸，每加上一层滤纸或者PVDF膜时都要用转膜液充分润湿并用玻璃棒擀走层与层之间的气泡以避免影响转膜效率。“三明治”转膜结构做好后，先在半干转膜仪的阳极板上滴加少许转膜液，再将“三明治”结构平放于半干转膜仪的阳极板上，再在“三明治”结构周围滴加少许转膜液，然后按照顺序盖上阴极金属板与外盖并接通电源。以100mA恒流转膜30min。待转膜完毕后，将PVDF膜取出，在PVDF膜正面左上角剪去一个角，作为区分正反面的标记。
5、封闭
将已转膜完毕的PVDF膜用TBST洗去残余在膜上的转膜液，置于孵育盒中，然后加入现配的含5％脱脂奶粉的封闭液封闭PVDF膜，封闭液没过膜为最佳。于室温下摇床封闭2h或者4℃冰箱过夜。
6、目的蛋白一抗、二抗的孵育
将PVDF膜封闭完毕后，吸弃封闭液。用现配5％脱脂奶粉的封闭液稀释目的蛋白一抗，然后加入孵育盒中孵育PVDF膜，使上述一抗稀释液没过PVDF膜，用保鲜膜密封抗体孵育盒，防止挥发，于4℃冰箱中静置孵育过夜。
目的蛋白一抗稀释比如下：
目的蛋白一抗孵育完毕后，回收一抗稀释液，可重复利用，用TBST洗PVDF膜，重复5次，每次10min。用TBST稀释二抗，然后加入到含有PVDF膜孵育盒中，使稀释的二抗没过PVDF膜，用保鲜膜密封孵育盒防止挥发，并于室温摇床孵育1h。
二抗稀释比如下：
二抗孵育完毕后，回收二抗稀释液，PVDF膜再用TBST洗5次，每次10min。
7、发光、曝光与显影
按用于显影的A液和B液以体积比1:1的比例配制显影发光液，用于滴加于已处理的PVDF膜上显影，以1cm×6cm的膜需要发光液100μL左右计算添加PVDF膜上的显影发光液的体积。待显影发光液与PVDF膜反应1-2min后，用平头镊将PVDF膜转移至发光暗盒的透明薄膜袋中，并在暗房中用X光显影盒压片曝光。然后将胶片放于显影液中浸泡30s，清水中冲洗后，置于定影液中再浸泡30s，清水中冲洗后，观察条带深浅，如果条带太不清晰，则延长曝光时间，如果条带太粗，则缩短曝光时间，重新压片，如此可以得到最佳的曝光效果。具体曝光时间的长短取决于条带的亮度，首次曝光30s为佳以观察条带亮度，普通样品的曝光时间1-3min之间调整。
8、条带图像处理
用Gel ImageAnalysis图像处理系统对条带进行光密度扫描，以目的蛋白条带和内参条带的光密度比值作为各蛋白的相对表达水平，实验均重复3次，取平均值作图。
实验结果表明，ERRα蛋白在人皮肤鳞状癌细胞A431中表达，且表达量高于正常皮肤细胞HaCat中(图1B)；XCT790或ERRαshRNA显著下调了A431中ERRα蛋白表达水平(图2B及图3B)。
实施例3
使用CCK-8细胞增殖实验测定XCT790及ERRαshRNA对A431(人源皮肤鳞状癌细胞)的增殖抑制效应。
本实施例阐明了本发明涉及的ERRα被特异性反向激动剂XCT790或shRNA下调后，可以有效地抑制人皮肤鳞状癌细胞株A431的增殖，说明本发明所涉及的ERRα在人皮肤鳞状癌细胞株的体外增殖中显示了极其重要的关键效应。CCK-8细胞增殖实验是本领域工作人员熟悉的技术。
1、A431细胞培养及铺种96孔细胞培养板：
取出状态良好的对数生长期的A431，观察细胞形态之后，如细胞已经80％融合之后，开始传代。洗弃培养皿内的旧培养液，用无菌1mL PBS洗3-5遍之后，加入温浴好的胰酶1mL，水平摇晃培养皿使胰酶分布均匀，消化充分。将细胞放入培养箱1-2min，取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞间隙变大且细胞细胞收回突起变圆，立即加入10％FBS培养液的终止消化，用移液枪轻柔地吹打细胞，反复轻柔吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成均匀的细胞悬液，调整细胞密度。以细胞数5×103个/孔将细胞悬液接种至96孔板中，每孔200μL，放入37℃5％CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸弃原10％FBS培养液，并用无菌PBS洗3-5遍之后，换为0.1％FBS培养液，再饥饿培养24h，使细胞在G0/G1期处于均一化状态。
2、检测
化合物XCT790或ERRαshRNA干预A431细胞48h后，吸弃96孔板中的旧培养液，加入新培养液，并在每孔加入10μL CCK-8试剂，置于37℃5％CO2培养箱中孵育2h。采用9602酶标分析仪，在单波长450nm处检测吸光度值(A450)。每个浓度设6个复孔，取平均值，实验重复3次。抑制率计算公式：抑制率(％)＝(OD化合物-ODbasic)/(ODcontrol-ODbasic)×100。
实验结果表明，XCT790或ERRαshRNA可以有效地抑制人皮肤鳞状癌细胞株A431的增殖(图2C，图2D及图3C)，说明本发明所涉及的ERRα在人皮肤鳞状癌细胞株的增殖中显示了极其重要的关键效应。
实施例4
使用Transwell肿瘤细胞迁移实验测定化合物对XCT790及ERRαshRNA对A431(人源皮肤鳞状癌细胞)的迁移功能的影响。
本实施例阐明了XCT790及ERRαshRNA可以有效地抑制人源皮肤鳞状癌细胞A431的迁移，说明ERRα在皮肤鳞状癌细胞迁移中发挥至关重要的效应。Transwell肿瘤细胞迁移实验是本领域工作人员熟悉的技术。
1、制备Transwell小室：
用Matrigel 1:8(50mg/L)稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面用来包被基底膜，并于4℃风干。待风干之后，水化基底膜，吸出培养板中残余液体，每孔加入50uL含10g/L的BSA无血清DMEM培养液，并在37℃培养箱中，孵育30min。
2、制备细胞悬液：
1)取生长状态良好的细胞，待细胞传代贴壁后，换成1％FBS的DMEM细胞培养液饥饿培养12-24h，去除血清对细胞迁移的影响。
2)消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用1％FBS的DMEM细胞培养液重悬。调整细胞密度至1-10×105，并尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
3、接种细胞：
1)取细胞悬液200μL加入Transwell小室，并在Transwell上室内加入1、5、10、20μM的XCT790
2)24孔板下室加入500μL含10ng/ml VEGF的培养基(在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板)
3)将24孔板37℃，5％CO2培养箱中培养6，12，24h。
4、染色：
1)弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min。
2)染色：采用0.1％结晶紫染色。首先配制用0.1％结晶紫染色，然后0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。
5、细胞计数：
使用Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照(100×)，把Transwell小室反过来底朝上则可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。随机选取5个视野计数细胞个数。抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(对照组细胞计数-实验组细胞计数)/对照组细胞计数×100％。
实验结果显示，XCT790及ERRαshRNA显著抑制A431(人源皮肤鳞状癌细胞)的迁移(图4A及图4B)，表明下调ERRα可以抑制皮鳞状细胞癌的侵袭和转移。
实施例5
使用免疫组织化学检测ERRα在人皮肤鳞状细胞癌组织及正常皮肤组织中的表达。免疫组织化学是本领域工作人员熟悉的技术。
免疫组织化学染色步骤如下：
1、脱蜡和水化：
将脑组织石蜡切片置于二甲苯I中30min，二甲苯II中20min，二甲苯III中10min，在无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，80％乙醇中浸泡5mins，60％乙醇中浸泡5min，单蒸水中浸泡5min。
2、抗原修复：
取一定量的CB缓冲液于一耐高温容器里，放进微波炉中，power10×2min，使之沸腾。然后把切片小心放入其中，再缓缓放入微波炉中加热，power3×5min。最后，放在室温自然冷却30-40min。
3、染色：
取出切片，TBS冲洗4-5次，甩干擦净。加入30ul H2O2，于室温湿盒中封闭30min，甩干擦净。滴加ERRα一抗(1:200)40ul，4℃过夜，TBST冲洗4-5次，滴加生物素化二抗20ul，室温孵育1h，TBS冲洗4-5次，滴加酶标亲和素20ul，室温孵育30min，TBS冲洗4-5次，滴加30ul底物着色后迅速冲洗干净，滴加1滴苏木精，5-10min，脱水，封片，镜检。
本实施例阐明了ERRα在人皮肤鳞状细胞癌组织高表达，而在正常皮肤组织表达极为微弱(图5)，说明ERRα能够成为人皮肤鳞状细胞癌的诊断标志物。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.雌激素相关受体α作为皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物的用途。
2.雌激素相关受体α在制备皮肤鳞状细胞癌的诊断标记物上的应用。
3.下调或阻断皮肤鳞状细胞癌中雌激素相关受体α分子表达的活性成分在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述下调或阻断皮肤鳞状细胞癌中雌激素相关受体α分子表达的活性成分为雌激素相关受体α的拮抗剂或者反向激动剂、雌激素相关受体α的抗体、针对雌激素相关受体α编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸。
5.一种检测皮肤鳞状细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有检测雌激素相关受体α表达量的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有雌激素相关受体α的标准样品或者分子量标记。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有检测雌激素相关受体α的扩增引物或者结合多肽。
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