CN112451674A

CN112451674A - 一种皮肤鳞状细胞癌治疗制剂

Info

Publication number: CN112451674A
Application number: CN202011594293.2A
Authority: CN
Inventors: 郑焱; 段琪琪; 邵永平; 张梦迪
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-03-09

Abstract

本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种皮肤鳞状细胞癌治疗制剂，该制剂通过调控GPX2的表达参与细胞周期的调控。进一步地，该制剂通过控制经典caspase途径调控鳞癌细胞的凋亡。进一步地，该制剂通过下调GPX2的表达促进细胞的凋亡本发明为制备皮肤鳞状细胞癌治疗用制剂提供了一个新的方向。

Description

一种皮肤鳞状细胞癌治疗制剂

技术领域

本发明涉及生物药剂领域，具体涉及一种皮肤鳞状细胞癌治疗制剂。

背景技术

皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC）是一种起源于表皮和（/或）附属器角质形成细胞的皮肤恶性肿瘤，它是继基底细胞癌的世界第二大常见的非黑色素性皮肤肿瘤（non-melanoma skin cancers, NMSC），也是最常见的易发生转移的皮肤肿瘤，占所有皮肤肿瘤的20%-50%，并且其发病率正逐年上升。本病常发生于某些皮肤癌前疾病的基础之上，或者由各种癌前病变演变而来，如日光性角化（Actinickeratosis,AK）及Bowen病，该病好发生于老年人的额面、手背等长期曝光部位，亦可见于黏膜、会阴等部位，临床常常表现为菜花状的结节、斑块等，边缘隆起，形状不规则，底部常不平整，表面常见破溃，易出血。该病具有一定的损容性，且恶性程度较高，虽然大多数的病例可通过简单的手术切除达到治疗效果，但仍有5%的病例可发生转移，这部分病例侵袭其他组织的风险较高，最终导致较低的生存率。因此深入研究cSCC发病机制，寻找新的预防、诊断方法，以及发现新的治疗靶点是目前皮肤科医师对皮肤鳞状细胞癌进行研究急需解决的主要问题。

GPX2（谷胱甘肽过氧化物酶2）是GPX（谷胱甘肽过氧化物酶）的家庭成员之一，是人体内主要的酶类抗氧化分子，同时也是一种硒蛋白；其基因定位于人类染色体14q24.1，包含两个外显子，其表达的蛋白共含190个氨基酸，分子量约为22KD。GPX2的酶活性位点是硒代半胱氨酸，位于第40位，同时其含有多个半胱氨酸残基，可被氧化修饰。GPX2最初在胃肠道系统被发现，并命名为GI-GPX、GPX-GI，随着研究的逐渐深入，研究者也发现其表达于其他系统组织中，如膀胱、皮肤、子宫颈、鼻咽部、尿道、肾脏、肺部等；此外，多数研究已经证实GPX2在不同肿瘤中发挥着不用的作用，与多种肿瘤的增殖、侵袭及转移相关。

皮肤是一种直接暴露于外界环境的可以进行自我调节的保护性屏障器官，其主要作用是维持皮肤和身体的内稳态，抵抗环境压力，包括紫外线。以往的研究已经证实，过度暴露于紫外线辐射是导致许多皮肤癌发生和发展的重要原因，特别是UVB（280-320nm）是非黑色素皮肤肿瘤的主要致癌物，一定时间及强度的紫外线照射可导致细胞内DNA的损伤，进而诱发皮肤鳞状细胞癌。研究紫外线与皮肤鳞状细胞癌的发生发展的关系，有助于判断疾病的预后，并帮助发现新的治疗靶点。所以我们研究了在UVB照射条件下GPX2在皮肤鳞癌中所发挥的作用，为临床治疗靶点提供理论基础。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种皮肤鳞状细胞癌治疗制剂，为制备皮肤鳞状细胞癌治疗用制剂提供了一个新的方向。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

皮肤鳞状细胞癌治疗制剂，该制剂通过调控GPX2的表达参与细胞周期的调控。

进一步地，该制剂通过控制经典caspase途径调控鳞癌细胞的凋亡。

进一步地，该制剂通过下调GPX2的表达促进细胞的凋亡

本发明为制备皮肤鳞状细胞癌治疗用制剂提供了一个新的方向。

附图说明

图1为IHC方法检测GPX2在组织中的表达情况

图2为Western Bolt的办法检测GPX2在肿瘤组织中的表达。

图3为与正常角质形成细胞相比，皮肤鳞癌细胞系中GPX2在RNA及蛋白水平表达较高。

图4为UVB照射正常角质形成细胞与皮肤鳞状细胞癌两种细胞系培养相同时间后ROS的变化

图5为UVB照射皮肤鳞癌细胞后ROS的变化。

图6为UVB照射皮肤鳞癌细胞后GPX2表达的变化。

图7为GPX2下调后ROS的变化；

图中：* p<0.05, ** p<0.01 。

图8为GPX2下调后GSH的变化；

图9为GPX2下调后FCM检测细胞凋亡。

图10为GPX2下调后Western Blot检测相关蛋白。

图11为GPX2下调后FCM检测细胞周期分布。

图12为GPX2下调后WB检测细胞周期蛋白。

图13为GPX2上调后ROS的变化

图14为GPX2上调后GSH的变化

图15为GPX2下调后检测相关信号通路蛋白的变化。

图16为稳定下调GPX2的表达后裸鼠移植瘤的生长曲线。

图17为裸鼠移植瘤接种第15天后各组瘤重量的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

临床实验：收集临床上确诊的皮肤鳞状细胞癌组织蜡块标本行免疫组织化学染色，结果如图1示GPX2在皮肤鳞癌组织中表达升高，并且主要分布于细胞质中；同时提取新鲜组织中的总蛋白，行Westernblot法检测GPX2的表达，结果如图2所示，与正常组织相比，肿瘤组织中GPX2的表达升高。

细胞实验：提取原代角质形成细胞与皮肤鳞癌细胞系总RNA及总蛋白，分别行qRT-PCR、Western blot的方法检测细胞中GPX2的表达，结果如图3示与原代角质细胞相比，皮肤鳞癌细胞系中GPX2表达在RNA及蛋白水平均升高。用UVB同时照射正常角质形成细胞系与皮肤鳞癌细胞系后检测ROS的变化，结果如图4示：SCL-1及HSC-1的ROS值较HaCaT低，说明在紫外线照射下，SCL-1及HSC-1的活性氧清除能力较强，即其抗氧化能力较HaCaT强，这有可能与GPX2表达升高相关。UVB是皮肤鳞癌的主要病因之一，所以我们选择在UVB照射下研究GPX2的作用机制。如图5所示，皮肤鳞癌细胞在UVB照射下利用酶标仪检测示ROS值升高，表明氧化应激模型构建成功。如图6所示，同等照射条件下 GPX2表达升高，表明暴露于UVB的条件下，GPX2可能参与皮肤鳞状细胞癌的发展。在皮肤鳞癌细胞系HSC-1及SCL-1中图7为下调GPX2的表达后ROS值升高，表明下调GPX2表达后，细胞内ROS清除力降低；同时如图8示下调GPX2后，细胞生成GSH的能力下降，表明其抗氧化能力下降。下调GPX2的表达后，用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，结果如图9示下调GPX2表达后细胞凋亡率增加，同时，WesternBlot检测相关凋亡蛋白的变化，结果如图10示：PARP、caspase3及caspase9凋亡蛋白蛋白被激活，说明GPX2可以通过经典的caspase凋亡途径调控皮肤鳞癌细胞的凋亡。下调GPX2的表达后，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，结果如图11示下调GPX2后G0/G1比例下降，S期比例升高，G2/M期比例升高；同时WesternBlot检测结果如图12示，细胞周期蛋白cyclinB、cylinD、cyclinE、CDK4均有所下降，cyclnA变化不明显，可以说明GPX2参与细胞周期调控。下调GPX2的表达后行Western Blot的方法检测信号通路蛋白，结果如图16示下调GPX2后AMPK蛋白磷酸化增加，说明其可通过AMPK信号通路调控GPX2在皮肤鳞癌中的作用。

动物实验：

选择4-5周大小的雌性裸鼠，给予皮下注射shGPX2慢病毒稳转细胞株行裸鼠移植瘤实验，使用游标卡尺测量肿瘤大小，每两天测量一次；待实质瘤生长至一定大小后给与UVB照射，继续测量肿瘤大小，每天测量一次；移植瘤进行14天后处死裸鼠，取出瘤子，称重。

实验结果显示：与对照组相比，GPX2稳定敲除组肿瘤生长明显减慢，并且肿瘤大小明显减轻。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims

1.皮肤鳞状细胞癌治疗制剂，其特征在于：该制剂通过调控GPX2的表达参与细胞周期的调控。

2.如权利要求1所述的皮肤鳞状细胞癌治疗制剂，其特征在于：该制剂通过控制经典caspase途径调控鳞癌细胞的凋亡。

3.如权利要求1所述的皮肤鳞状细胞癌治疗制剂，其特征在于：该制剂通过下调GPX2的表达促进细胞的凋亡。