CN110393800A - 增强食管鳞状细胞癌化疗敏感的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强食管鳞状细胞癌化疗敏感的药物。本发明通过收集并检测临床标本、建立体外细胞模型以及体内裸鼠模型，从肿瘤微环境角度研究了肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞状细胞癌生物学行为及化疗耐药方面的作用机制，通过实验证明：M2型肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞状细胞癌间质内分布密度增加，并促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭性，同时促进食管鳞状细胞癌对化疗药物顺铂的耐药性。本发明为进一步明确食管鳞状细胞癌恶性生物性行为的机制以及靶向治疗提供了一个新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增强食管鳞状细胞癌化疗敏感的药物。
背景技术
食管癌是世界上最常见的恶性消化道肿瘤之一，尤其是在中国，食管癌的发生率及死亡率都位于世界前列，其中死亡率居于世界第5位。食管癌主要包括腺癌和鳞癌，而在中国，食管鳞癌的发生率远远高于腺癌，大约占食管癌90％以上。食管癌的早期症状不明显，因此临床上的食管癌患者多数是中晚期，对于早期食管癌，通常采用手术切除治疗，而对于中晚期食管癌手术切除已经达不到早期的治疗效果，因此往往多采用化疗药物治疗，但由于缺乏有效的靶向性药物，在治疗的过程中常易产生化疗耐药现象，经调查研究显示大约有75％的食管癌患者在治疗过程中存在着化疗耐药的问题，因此化疗耐药是目前亟待解决的问题之一。所以寻找新的治疗方向对食管鳞状细胞癌治疗及预后均具有非常重要的意义。
肿瘤微环境作为近年来的研究热点之一，其构成包括多种细胞成分，例如基质细胞、内皮细胞以及免疫细胞等。在免疫细胞中，巨噬细胞占主要成分。巨噬细胞可塑性强，主要有两种表型，分别是经典活化巨噬细胞M1型和替代活化巨噬细胞M2型， M1型巨噬细胞可分泌多种促炎因子，例如IL-12/IL-23以及TNF-a等，其抗原提呈能力强，对体内细菌病原体及肿瘤细胞等均具有杀伤作用。而M2型巨噬细胞，则主要分泌IL-10/Arg-1/TGF-β等细胞因子，该型巨噬细胞具有免疫抑制作用，并能帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸，从而促进肿瘤发生发展及侵袭、转移。多种恶性肿瘤中证实，肿瘤区域聚集的巨噬细胞多是M2型肿瘤相关巨噬细胞，并且该型巨噬细胞参与多种恶性肿瘤的发生发展，并起到促进作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强食管鳞状细胞癌化疗敏感的药物。
本发明首先保护用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护用于抑制巨噬细胞向M2型转化的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护一种产品，包括用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护一种产品，包括于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护一种产品，包括用于抑制巨噬细胞向M2型转化的物质；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护M2型肿瘤相关巨噬细胞作为靶点在开发药物中的应用；所述药物的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护以上任一所述的产品和用于治疗食管鳞状细胞癌的化疗药物在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗食管鳞状细胞癌。
本发明还保护一种产品，包括以上任一所述的产品和用于治疗食管鳞状细胞癌的化疗药物；所述产品的用途为治疗食管鳞状细胞癌。
本发明还保护用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质或用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质或用于促进巨噬细胞向M2型转化的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(b1)-(b5)中的至少一种：
(b1)促进食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(b2)提高食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(b3)促进食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(b4)促进食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(b5)抑制食管鳞状细胞癌的凋亡。
本发明还保护一种产品，包括用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质或用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质或用于促进巨噬细胞向 M2型转化的物质；所述产品的用途为如下(b1)-(b5)中的至少一种：
(b1)促进食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(b2)提高食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(b3)促进食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(b4)促进食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(b5)抑制食管鳞状细胞癌的凋亡。
以上任一所述化疗耐药性体现为对于顺铂的耐药性。
以上任一所述食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白具体可为P-gp。
以上任一所述促进食管鳞状细胞癌的凋亡具体可通过降低食管鳞状细胞癌抗凋亡 Bcl-2蛋白的表达量和/或活性，或提高食管鳞状细胞癌促凋亡蛋白Bax的表达量和/或活性实现。
以上任一所述用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质或用于抑制巨噬细胞向M2型转化的物质或用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质包括但不限于氯磷酸盐脂质体。
本发明公开了增强食管鳞状细胞癌化疗敏感的而药物。本发明通过收集并检测临床标本、建立体外细胞模型以及体内裸鼠模型，从肿瘤微环境角度研究了肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞状细胞癌生物学行为及化疗耐药方面的作用机制，通过实验证明：M2 型肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞状细胞癌间质内分布密度增加，并促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭性，同时促进食管鳞状细胞癌对化疗药物顺铂的耐药性。本发明为进一步明确食管鳞状细胞癌恶性生物性行为的机制以及靶向治疗提供了一个新的方向。
附图说明
图1为M2型肿瘤相关巨噬细胞在哈族食管癌癌组织及癌旁正常组织中的表达分布情况。
图2为经不同处理后THP-1细胞分化前后的形态变化和qRT-PCR检测肿瘤相关巨噬细胞的表型变化(IL-10、Arg-1、IL-12及TNF-α的mRNA表达水平)。
图3为M2型肿瘤相关巨噬细胞对食管鳞癌细胞增值、迁移和侵袭的影响。
图4为M2肿瘤相关巨噬细胞对顺铂作用于食管鳞癌细胞化疗耐药的影响。
图5为流式细胞技术检测顺铂对不同处理组食管鳞癌EC109/EC9706细胞的凋亡
情况。
图6为M2型肿瘤相关巨噬细胞对食管鳞癌EC109/EC9706细胞耐药蛋白及凋亡相关蛋白的影响。
图7为实施例8中M2肿瘤相关巨噬细胞对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长情况以及对化疗药物顺铂作用的反应性的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下列具体实施方式中的细胞培养基的配置方法如下：配置100ml1640完全培养基(10％血清、1％双抗的1640完全培养基)，即：89ml的1640基础培养基，10ml的胎牛血清(BI)，和1ml的青链霉素混合液，4℃冰箱保存备用。
下述实施例中应用Gelpro32测量Western Blot实验中P-gp、bax和bcl-2蛋白表达的灰度值，表达水平用均数±标准差描述；细胞实验均至少重复3次，两组间差异应用t检验。所有相关的实验数据分析均采用SPSS 22.0统计学软件进行处理分析，P＜ 0.05认为差异具有统计学意义。“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P ＜0.001。
实施例1、食管鳞癌组织中M2肿瘤相关巨噬细胞的表达分布
一、组织样本
收集2008-2014年期间新疆伊犁自治州友谊医院177例食管鳞癌组织及相关临床病理资料，其中包括100例哈萨克族食管鳞癌组织和77例癌旁正常组织。患者的年龄分布范围33-76岁，其中癌组织中男性67例，女性33例；癌旁正常组织中男性51例，女性26 例。所有患者术前没有进行其他治疗。所有样本均用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)切片及苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，经两位高年资病理医生遵循世界卫生组织的肿瘤组织学分类标准阅片。上述标本的获取均事先征得受检者的知情同意。
二、免疫组织化学法检测大组织切片中M2肿瘤相关巨噬细胞的表达情况
用对免疫组织化学法检测步骤一种大组织切片中M2肿瘤相关巨噬细胞的表达情况进行分析。具体操作步骤如下：
第1天
1、将制备好的切片放入68℃烤箱中，烤片30min以上(刚制好的切片需要烤片 4h以上)。
2、按顺序将步骤1处理的切片依次放入以下组分中，各5min(二甲苯三次、无水酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精(当浸泡到80％酒精时，在棕色小盒中加入枸橼酸缓冲液，盖上盖子，用微波炉，高火，煮3min。与此同时，将高压锅烧开备用)。
3、完成步骤2后，将切片用自来水洗3次，每次拿出放入2-3次。
4、完成步骤3后，将切片放入微波炉煮沸的棕色小盒中，随即放入已经烧开的高压锅中，盖好盖子；将高压锅调至火锅档，1800W，待开始喷气，调至800W，蒸8min，关火，放气。
5、完成步骤4后，将锅中的盒子取出(注意烫手)，置于窗口，自然冷却至30℃以下，大约30-40min；然后用自来水洗3次，每次拿出放入2-3次即可。
6、完成步骤5后，将切片放入3％的H2O2-PBS溶液中(阻断内源性过氧化酶活性)，室温孵育10min，之后用自来水洗3次，每次拿出放入2-3次。
7、配制一抗，用抗体稀释液稀释；抗体信息见表1。
表1 抗体信息
8、将步骤6处理的切片置于温盆上，擦干组织周围液体，每张切片滴加30-50μl 一抗(根据切片上组织大小决定所加抗体的量，注意：不能让组织干着，擦一张，加一张抗体)，然后将装有切片的温盆放入4℃冰箱中过夜。
第2天
1、将温盆从4℃冰箱中拿出，放入37℃温箱中复温10min；然后用PBS静洗3 次，每次5min(在小型摇床上轻震荡)。
2、完成步骤1后，将切片置于温盆上，用纸巾擦干组织周围的PBS，每张切片滴加20-50ul的二抗(Envision二抗PV6000，北京中山金桥生物技术有限公司)，再将温盆放入37℃温箱中，孵育30min；然后用PBS静洗3次，每次5min。
3、完成步骤2后，每张切片滴加20-50μl的DAB显色液(ZLI-9019，Dako公司)，于显微镜下观察染色情况，若染色较好，即可终止显色。
4、立即将切片放入装有自来水的缸子里，浸洗，保持切片湿润；将切片置于温盆上，擦干组织周围的液体，滴加苏木素液体，大约3-5min，用自来水洗3次。
5、完成步骤4后，将切片放入70％酒精浸3次，每次5min；最后，用中性树胶封片，晾干，备用。
免疫组织化学结果判读方法：CD163胞膜或胞浆着色，呈黄色或棕黄色颗粒则视为阳性表达。随机选取每例组织的5个视野进行观察，计算5个视野下分数的平均值。染色结果均由两位高资质病理医师分别进行判读并取其平均值。评分标准如下表2所示。
表2 免疫组织化学染色结果判读标准表
说明：评定结果即阳性细胞范围与细胞着色强度的乘积，得分为0分时，分级为-，1-3分为1+；4-6分为2+；7-9分为3+，其中-被视为阴性表达，1+/2+/3+被视为阳性表达。
结果如表3和图1所示。本实验中用CD163分子标记M2型肿瘤相关巨噬细胞，其着色部位主要是位于巨噬细胞的胞膜或胞浆，根据免疫组化结果显示，M2型肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞癌癌巢及癌间质中的分布密度明显高于癌旁正常组织。
表3 M2型肿瘤相关巨噬细胞在哈族食管鳞癌及癌旁正常组织中分布情况
实施例2、M2型肿瘤相关巨噬细胞的诱导
一、M2型肿瘤相关巨噬细胞的诱导
人白血病单核细胞株THP-1可从上海复祥生物公司购买。
1、将THP-1接种于6孔板中，每孔1.5×106个，每孔加入PMA诱导剂(北京四正柏公司)20μl(使用浓度为320nM)，然后每孔使用细胞培养液补足至2ml，37℃，5％CO2培养箱中培养36h。
2、完成步骤1后，每孔更换新的培养液，并且加入IL-4(加入孔内后浓度为20ng/ml) 和IL-13(加入孔内后浓度为20ng/ml)，37℃，5％CO2培养箱中培养48h，获得M2型肿瘤相关巨噬细胞。
IL-4：PEPROTECH，货号：041814；
IL-13：PEPROTECH，货号：101723。
THP-1细胞是悬浮生长的单个球形细胞，如图2A所示；当用320nM的佛波酯PMA 诱导36h以后，悬浮生长的THP-1细胞发生了贴壁现象，但依然是偏类圆形的，如图 2B所示；但换用20ng/ml IL-4和20ng/ml IL-13继续刺激处理后，细胞逐渐伸出伪足，呈长梭形，且往往聚团生长，如图2C所示。
二、M2型肿瘤相关巨噬细胞鉴定
待测细胞：步骤一种仅采用PMA诱导得到的巨噬细胞和采用PMA+IL-4/IL-13诱导的得到的巨噬细胞。
1、提取待测细胞的总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用qRT-PCR检测IL-10、Arg-1、IL-12和 TNF-α的mRNA表达情况。用于检测的引物信息见表4。
表4 引物序列
结果如图2D所示。结果显示经PMA+IL-4/IL-13诱导的巨噬细胞与单独PMA诱导组相比较，IL-10和Arg-1的表达升高，而IL-12及TNF-α的mRNA表达水平则显著降低。
以上结果，本发明在体外环境下成功诱导了M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
实施例3、M2肿瘤相关巨噬细胞对食管鳞癌细胞增殖的影响
食管鳞癌细胞株EC109、EC9706可从上海复祥生物公司购买。
1、将食管鳞癌细胞株EC109单独或与实施例2制备并鉴定正确的M2型肿瘤相关巨噬细胞混合接种于Transwell六孔板中(单独培养时食管鳞癌细胞株EC109接种数为20×104个；共培养时采用非接触性共培养，小室中巨噬细胞的接种量是食管癌细胞的3倍，即食管鳞癌细胞接种数为20×104个，而巨噬细胞的的接种数为60×104个)，37℃，5％CO2培养箱中培养2周(每3天换一次培养液)，然后用PBS洗涤各孔2-3次，用4％多聚甲醛浸没，在4℃冰箱固定细胞30min，然后常温下用1％的结晶紫染色20min，风干后，显微镜下采集图像，统计细胞克隆的集落数并作图。
2、将食管鳞癌细胞株EC9706单独或与实施例2制备并鉴定正确的M2型肿瘤相关巨噬细胞混合接种于Transwell六孔板中(单独培养时食管鳞癌细胞株EC9706接种数为20×104个；共培养时采用非接触性共培养，小室中巨噬细胞的接种量是食管癌细胞的3倍，即食管鳞癌细胞株EC9706接种数为20×104个，而巨噬细胞的的接种数为60×104个)，37℃，5％CO2培养箱中培养2周(每3天换一次培养液)，然后用 PBS洗涤各孔2-3次，用4％多聚甲醛浸没，在4℃冰箱固定细胞30min，然后常温下用1％的结晶紫染色20min，风干后，显微镜下采集图像，统计细胞克隆的集落数并作图。
结果如图3A所示。结果显示，与M2型肿瘤相关巨噬细胞共培养后的食管鳞癌细胞的增殖能力明显高于未处理的单独培养组食管鳞癌细胞(P＜0.05)。
实施例4、M2型肿瘤相关巨噬细胞促进食管鳞癌细胞的迁移和侵袭性
食管鳞癌细胞株EC109、EC9706可从上海复祥生物公司购买。
1、将实施例2制备并鉴定正确的M2型肿瘤相关巨噬细胞分别与食管鳞癌细胞株EC109、EC9706利用6孔板小室分别进行非接触性共培养48h(食管鳞癌细胞接种数为20×104个，巨噬细胞的的接种数为60×104个)，共培养后的EC109和EC9706 细胞用于transwell实验。
Transwell实验迁移和侵袭实验，主要区别在于侵袭实验的小室里铺了一层Matrigel胶。
2、提前将martrigel基质胶(BD公司)置于4℃冰箱中过夜使其变为液体状态，移液器的200μl黄色吸头也提前放-20℃冰箱预冷。
3、完成步骤2后，进行将martrigel基质胶与DMEM按照体积比1:8进行混合后每孔铺50μl，铺胶的过程中注意不要产生气泡。铺胶结束后将小室放入24孔板中，然后放入细胞培养箱中干燥2h，取出小室，吸出培养基。
4、完成步骤3后，向小室内加入100μl无血清DMEM培养基，下层放入600μl 的无血清DMEM培养基来水化基底膜。然后放入细胞培养箱中静置半小时，洗去上层的培养基。(迁移实验直接进行下一步骤，省略步骤(2,3,4))
5、完成步骤4后，将步骤1制备的共培养后的EC109和EC9706细胞用细胞培养液制成细胞混悬液，Transwell小室细胞3万，100μl；下层含20％FBS培养基600μl。放入细胞培养箱中培养。
迁移实验培养36h，侵袭实验培养48h。
6、完成步骤5后，漂洗小室，洗去残留的培养基，注意动作轻柔。自然风干后下室加入600μl的多聚甲醛，4℃静置20分钟，1×PBS洗2-3次，风干后，加入0.1％的结晶紫，染色15min，自来水终止显色。用棉签小心轻柔的擦拭掉上室内的基底胶和细胞，将小室晾干后进行拍照记录。选取5个显微镜视野下的图片进行计数做统计分析。每个实验均应进行3次(同时采用未与M2型肿瘤相关巨噬细胞共培养的食管鳞癌细胞株EC109、EC9706进行实验作为对照)。
结果如图3B和图3C所示。
迁移实验结果(图3B)表明，单独培养的食管鳞癌细胞中，EC109细胞穿过小室的成功迁移的细胞数目为(93±6)个，而EC9706细胞穿过的细胞数为(77±14)个；而与肿瘤相关巨噬细胞共培养后的EC109成功迁移的细胞数是(180±4)个，而共培养后的EC9706细胞的穿过数目是(241±14)个，因此，与肿瘤相关巨噬细胞共培养后的食管鳞癌细胞EC109/EC9706，它们的迁移能力明显高于未共培养处理的食管鳞癌细胞，这种差具有显著的统计学意义(P＜0.001)。
侵袭实验结果(图3C)显示，共培养后EC109穿过小室基质胶的细胞数为(212±6)个，共培养后EC9706为(309±8)个；而单独培养组EC109穿过基质胶的细胞数目为(164±6)个，单独EC9706为(156±11)个，共培养组相较于单独组而言，穿过基质胶数目明显增多，差异具有显著的统计学意义(P＜0.001)。
综上所述，M2型肿瘤相关巨噬细胞与食管鳞癌细胞共培养后能显著提高食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力。
实施例5、M2肿瘤相关巨噬细胞对食管鳞癌细胞存活率的影响(顺铂作用下)
顺铂(cDDP)可从山东齐鲁制药厂购买。
1、在2个96孔板中分别加入共培养前后的两株食管鳞癌细胞(EC109/EC9706) 每孔4000个细胞，分组情况：EC109、EC109+M2、EC9706、EC9706+M2，每组设置 5个复孔，培养24h。
2、完成步骤1后，分别在2个96孔板中加入选取的不同浓度(0.25、0.5、1.0、 2.0、4.0、8.0、16.0μg/ml)的顺铂药物溶液(化疗药物顺铂使用生理盐水溶解)，然后将2个96孔板放入培养箱作用不同时间(0、24、48、72h)。
3、完成步骤2后，取出96孔板，向铺有细胞的每个孔中分别加入10μl的CCK8 试剂(避光操作)，全部加完后，用提前消毒过的锡箔纸包裹96孔板，再次放入培养箱避光孵育1～4h，孵育完成后，用酶标仪检测A450nm处的吸光度OD值。
结果如图4所示。图4B中，EC109细胞存活率的统计结果为顺铂作用浓度为 3.5μg/ml，作用时间为48h的结果；EC9706细胞存活率的统计结果为顺铂作用浓度为 1μg/ml，作用时间为48h的结果。结果表明，与M2肿瘤相关巨噬细胞共培养后的食管鳞癌细胞在顺铂的作用下其存活率明显高于未处理组的存活率(P＜0.001)。
实施例6、顺铂对M2肿瘤相关巨噬细胞处理后食管鳞癌细胞凋亡率的影响
1、在2个96孔板中分别加入共培养前后的两株食管鳞癌细胞(EC109/EC9706) 每孔4000个细胞，分组情况：EC109、EC109+TAM、EC9706、EC9706+TAM，每组设置5个复孔，培养24h。
2、完成步骤1后，分别在2个96孔板中加入顺铂药物溶液(化疗药物顺铂使用生理盐水溶解)，EC109和EC109+TAM加入3.5μg/ml的顺铂，EC9706和EC9706+TAM加入1μg/ml的顺铂，然后将2个96孔板放入培养箱作用48h。
3、分别收集不同孔内的培养液上清，用Accutase细胞消化液收集细胞，800rpm离心5min，弃上清。
4、完成步骤5后，将细胞沉淀用预冷的1×PBS离心洗涤，收集1～10×105个细胞(包括培养液上清中的细胞)，取500μl 1×Binding Buffer重悬细胞。
5、完成步骤4后，每个管内加5μl FITC和10μl PI，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5min，上机检测。
结果如图5所示。结果显示，与M2肿瘤相关巨噬细胞共培养后的食管鳞癌细胞在顺铂的作用下的细胞凋亡率显著低于单独培养组食管鳞癌细胞(P＜0.05)。
实施例7、M2肿瘤相关巨噬细胞对食管鳞癌细胞凋亡相关蛋白及耐药相关蛋白蛋白表达的影响
在6孔板中分别加入如下分组的细胞，培养48h后Westernblot检测蛋白表达：
(1)EC109组：每孔接种20×104个EC109细胞；
(2)EC109+TAM组：每孔接种20×104个EC109细胞和60×104个M2肿瘤相关巨噬细胞；
(3)EC9706组：每孔接种20×104个EC9706细胞；
(4)EC9706+TAM组：每孔接种20×104个EC9706细胞和60×104个M2肿瘤相关巨噬细胞；
共培养前后的两株食管鳞癌细胞(EC109/EC9706)每孔4000个细胞，分组情况：EC109、EC109+TAM、EC9706、EC9706+TAM，每组设置5个复孔，培养24h。
Western blot检测的具体步骤如下：1、常规提取不同组细胞的总蛋白；2、常规SDS-PAGE电泳，当溴酚蓝即将跑出凝胶下缘即停止电泳；3、按照由上而下的顺序摆放厚滤纸、PVDF膜、凝胶、厚滤纸，在半干转的转膜仪上进行转膜；4、将转膜完成的PVDF膜置于封闭液，室温下封闭1-2h；5、将封闭完成的PVDF膜转移至已稀释好的一抗中，放在4℃冰箱中，孵育过夜；6、将孵育好的PVDF膜置于1×TBST中进行洗膜；7、将洗好的PVDF膜置于以稀释好的二抗溶液中，室温下孵育2h，再用1 ×TBST溶液洗PVDF膜，最后按照发光试剂说明书步骤在暗室中进行曝光。抗体信息见表5。
表5 Westernblot实验所用的生物抗体信息
结果如图6所示，结果表明，与M2肿瘤相关巨噬细胞共培养后的食管鳞癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2及耐药相关蛋白P-gp的表达相较于单独培养组明显升高，而促凋亡蛋白Bax的表达则明显下降(P＜0.001)。
实施例8、体内动物实验检测M2肿瘤相关巨噬细胞对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长情况以及对化疗药物顺铂作用的反应性
动物：BALB/C雌性裸鼠，4-6周龄，体重15-20g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于新疆医科大学动物实验中心。
氯磷酸盐脂质体：上海翊圣生物科技有限公司，货号：40337ES10；氯磷酸盐脂质体发挥的作用为抑制和消除巨噬细胞的作用；
对照脂质体：上海翊圣生物科技有限公司，货号：40338ES10。
将BALB/C裸鼠(4-6周龄大小，体重15-20g)分为6组：EC109+氯磷酸盐脂质体+cDDP组，EC109+氯磷酸盐脂质体+生理盐水组，EC109+PBS对照脂质体+cDDP 组，EC109+PBS对照脂质体+生理盐水组，EC109+M2型肿瘤相关巨噬细胞+cDDP组， EC109+M2型肿瘤相关巨噬细胞+生理盐水组。每组8只。
1、将食管鳞癌细胞系EC109细胞培养至70％-80％时，用胰酶消化成单个细胞并计数用1×PBS多次清洗以去除其内残留的胰酶，最终用1×PBS将肿瘤细胞稀释成 1×107个/ml(所用液体均在37℃水浴锅内预热)，皮下注射于裸鼠左前腋下，100μl/ 只，即1×106个/只；对于共注射组，M2型肿瘤相关巨噬细胞：EC109＝1:1，即M2型肿瘤相关巨噬细胞1×106个/只，EC109肿瘤细胞1×106个/只，同样在裸鼠左前腋下皮下注射。
2、完成步骤1后，每隔3-4天观察裸鼠的一般情况并记录裸鼠体重以及肿瘤的体积，用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，皮下肿瘤的体积公式V＝a×b2×0.5，直至实验结束。
3、当移植瘤的直径达到0.2-0.4cm时，对应分组裸鼠尾静脉注射氯磷酸盐脂质体和PBS对照脂质体，第一次200μl/20g(5mg/ml)，4天后，进行第二次尾静脉注射，同第一次注射，再4天后，对应分组裸鼠瘤内注射相应脂质体，50μl/只，每4天注射一次，瘤内共注射3次，直至实验结束。
4、成瘤两周开始注射顺铂，2mg/kg，每周2次(间隔4天)，腹腔注射，共5次。
5、注射肿瘤细胞的第32天，处死裸鼠，并取出肿瘤拍照，测量肿瘤的体积及重量。
相关结果如图7所示。
在EC109+氯磷酸盐脂质体+生理盐水组(A组)，EC109+PBS对照脂质体+生理盐水组(B组)，EC109+M2型肿瘤相关巨噬细胞+生理盐水组(C组)三组食管鳞癌异种移植瘤裸鼠中，结果显示与清除裸鼠体内巨噬细胞的A组相比较，未处理巨噬细胞的B组和M2型肿瘤相关巨噬细胞增多的C组两组裸鼠食管鳞癌移植瘤体积和重量明显增大，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。对于C组的瘤体体积和重量均明显大于 B组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明M2型肿瘤相关巨噬细胞促进裸鼠食管鳞癌肿瘤的生长。
与耗竭裸鼠体内巨噬细胞的D组(EC109+氯磷酸盐脂质体+cDDP)相比较而言，未处理E组(EC109+PBS对照脂质体+cDDP)和M2型肿瘤相关巨噬细胞增多的F组 (EC109+TAM+cDDP)使用化疗药物顺铂治疗后，肿瘤的生长速度明显增快，且E 组和F组的瘤体体积(P＜0.001)及瘤体重量(P＜0.01)均明显高于D组。E组和F 组进行比较，F组瘤体体积更大(P＜0.05)，且F组瘤体重量亦显著大于E组(P＜ 0.05)；同时耗竭裸鼠体内巨噬细胞的D组(EC109+氯磷酸盐脂质体+cDDP)，肿瘤 HE染色显示其坏死区域明显多于/大于未处理E组(EC109+PBS对照脂质体+cDDP) 和M2型肿瘤相关巨噬细胞增多的F组(EC109+TAM+cDDP)。
上述结果，表明M2型肿瘤相关巨噬细胞在裸鼠体内增加了食管鳞癌对顺铂的化疗耐药性，抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞能够提高食管鳞状细胞癌化疗敏感。
Claims (10)
1.用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
2.用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
3.用于抑制巨噬细胞向M2型转化的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
4.一种产品，包括用于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
5.一种产品，包括于抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
6.一种产品，包括用于抑制巨噬细胞向M2型转化的物质；所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
7.M2型肿瘤相关巨噬细胞作为靶点在开发药物中的应用；所述药物的用途为如下(a1)-(a5)中的至少一种：
(a1)抑制食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(a2)降低食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(a4)抑制食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(a5)促进食管鳞状细胞癌的凋亡。
8.权利要求4至6任一所述的产品和用于治疗食管鳞状细胞癌的化疗药物在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗食管鳞状细胞癌。
9.一种产品，包括权利要求4至6任一所述的产品和用于治疗食管鳞状细胞癌的化疗药物；所述产品的用途为治疗食管鳞状细胞癌。
10.应用或产品；
所述应用为用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质或用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质或用于促进巨噬细胞向M2型转化的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(b1)-(b5)中的至少一种：
(b1)促进食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(b2)提高食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(b3)促进食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(b4)促进食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(b5)抑制食管鳞状细胞癌的凋亡；
所述产品包括用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞活性的物质或用于促进M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤区域募集和/或存活的物质或用于促进巨噬细胞向M2型转化的物质；所述产品的用途为如下(b1)-(b5)中的至少一种：
(b1)促进食管鳞状细胞癌的化疗耐药性；
(b2)提高食管鳞状细胞癌耐药相关蛋白的表达量和/或活性；
(b3)促进食管鳞状细胞癌的增殖和/或生长；
(b4)促进食管鳞状细胞癌的迁移和/或侵袭；
(b5)抑制食管鳞状细胞癌的凋亡。
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