CN112522209A - 肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法 - Google Patents
肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，包括：步骤一、检测p62/IMP2在ESCC中的表达特征；步骤二、构建稳定过/低表达p62/IMP2的稳定细胞株；步骤三、观察p62/IMP2在食管鳞癌中的作用。通过上述的流程步骤操作，本发明构建了稳定过/低表达p62/IMP2的食管鳞癌细胞模型，利用细胞生物学实验、分子生物学实验以及体内动物模型证实p62/IMP2在ESCC(食管鳞状细胞癌)增殖、迁移、侵袭、凋亡和化疗耐药中发挥至关重要的作用。为深入探究ESCC耐药机制及基因靶向治疗提供必不可少的依据。本发明应用细胞生物学功能实验、分子生物学实验、裸鼠皮下成瘤模型等技术深入探究p62/IMP2在ESCC生长、转移、凋亡及化疗耐药中的作用及其分子机制，并结合临床组织样本解析与临床因素的相关性。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤相关抗原研究技术领域，更具体地说，特别涉及一种肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法。
背景技术
食管癌又称食道癌，在全国恶性肿瘤死亡总数中占22.34％，其死亡率居第二位，2012年全球食管癌新发病例为456,000例，死亡病例约400,000例，在全球恶性肿瘤中居第八位。在我国，特别是河南省林县是世界范围内的食管癌高发区，严重危害人们的身体健康，同时给家庭和社会经济造成很大的负担。因此对食管癌的研究已引起人们高度重视。
食管癌包括食道腺癌(esophagealadenocarcinoma，EAC)和食管鳞状细胞癌(esophagealsquamous-cellcarcinoma，ESCC)。在我国，ESCC是最主要的食管癌类型，而EAC的发病率较低。化疗是临床上治疗ESCC的重要手段，具有一定的治疗效果，并且毒性小。目前常见的化疗药物有紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂等。虽然联合化疗已被用于治疗ESCC，获得性耐药仍然是实现成功治疗的主要临床障碍，ESCC耐药的潜在机制尚未解释清楚。
1999年，p62作为肿瘤自身抗原是由张建营教授课题组首次发现报道的。p62/IMP2属于胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白家族(IMP1，IMP2和IMP3)的一员，该基因位于3号染色体，编码一个62KDa的蛋白p62/IMP2。其蛋白分子由四个串联的KH结构域和两个RRM结构域组成，都是常见的RNA结合结构。p62/IMP2普遍表达于各种组织中，其mRNA在小鼠或人的围生期和成年组织的多种器官中被检测到，如脑、肠、骨髓、肾、肺、肌肉、肝脏、睾丸和胰腺。作为一个mRNA结合蛋白，p62/IMP2能结合不同的mRNA，在众多靶mRNA中，大部分与癌症发展相关，如IGF2mRNA和c-mycmRNA，还有一些涉及到癌细胞的生长，迁移，粘附或能量代谢。作为肿瘤相关抗原，IMP2在多种肿瘤组织中也具有高表达，包括脂肪肉瘤，肝癌(HCC)，乳腺癌和子宫内膜腺癌，这些提示我们IMP2可能参与人类恶性肿瘤的发生发展过程。
近几年，研究者们发现p62/IMP2在肿瘤中确实发挥着重要的作用，2012年德国以SonjaM为主的研究小组报道，p62/IMP2在肝癌组织中的表达量明显增高并且在肝癌细胞中发挥抗凋亡作用，同时研究表明该功能不依赖于IGF2/PI3K信号通路而是通过细胞外的调节激酶ERK1/2。2015年Li等人发现p62/IMP2在乳腺癌中异常高表达促进乳腺癌细胞的迁移并降低细胞的粘附。2016年AhmadBarghash研究小组发现p62/IMP2在食管癌中高表达导致生存期缩短并与EAC的转移有关，表明p62/IMP2有可能成为Barret食管和EAC的预后标志物。2017年DaiNing所在的研究小组发现p62/IMP2通过结合和稳定HMGA1的mRNA，极大地增强IGF活性，促进肝癌细胞Hep3b、HCC-1359、SNU-423，宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MB-231、恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD和多形性胶质母细胞瘤U87、U251、GMB-P的细胞增殖。由此可见对p62/IMP2在肿瘤中的功能研究逐渐成为热点，但我们对它的分子机制等问题还知之甚少。
目前SonjaM，Li，Mu，AhmadBarghash等的研究结果显示p62/IMP2在肝癌，乳腺癌，GBM，EAC中均起着关键作用并且发挥的功能不完全一致。经过研究发现，p62/IMP2在ESCC患者癌组织中的表达异常高于癌旁组织，在Eca109细胞中稳定过表达p62/IMP2促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力，并抑制其凋亡和对化疗药物的敏感性，在KYSE150细胞中干扰p62/IMP2的表达对ESCC细胞起相反作用。体内动物模型中也证实p62/IMP2促进ESCC的形成。在ESCC中，p62/IMP2的表达特征、参与肿瘤的生成、肿瘤的转移和肿瘤的耐药还不清楚。
发明内容
(一)技术问题
因此，如何对ESCC的耐药机制进行深入研究，用以为ESCC的靶向治疗提供必要的理论依据，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
(二)技术方案
本发明提供了一种肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法。在该肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，具体包括如下步骤：
步骤一、检测p62/IMP2在ESCC中的表达特征；
步骤二、构建稳定过/低表达p62/IMP2的食管鳞癌细胞株；
步骤三、观察p62/IMP2在食管鳞癌中的作用；
在所述步骤三中，包括步骤：
3.1、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响；
3.2、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用；
3.3、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用；
3.4、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞凋亡的作用；
3.5、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的作用；
3.6、确定p62/IMP2在体内促进ESCC的形成。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤一中：利用p62/IMP2多克隆抗体检测正常食管组织、癌旁组织和食管鳞癌组织中p62/IMP2的表达特征。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，通过免疫组织化学染色，检测p62/IMP2在不同组织中的表达水平。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤二中，包括步骤：2.1、研究p62/IMP2在不同食管鳞癌细胞中的表达，并选定细胞构建细胞模型；2.2、构建稳定过/低表达p62/IMP2的ESCC细胞株。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，选取Eca109细胞通过慢病毒感染构建过表达p62/IMP2的食管癌细胞模型。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，选取KYSE150细胞通过慢病毒感染构建稳定低表达p62/IMP2的细胞模型。
在所述步骤3.1中：将ESCC细胞转移至96孔板上，并在37℃恒温、5％CO2的环境下培养；每隔24小时，连续4天在同一时间采用CCK8试剂盒测定细胞增殖情况，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制增殖曲线，根据增殖曲线确定过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤3.2中：取Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞，细胞浓度为1×105，对细胞培养并使得细胞的融合率达到100％；在平板上采用画十字方式布置细胞，采用PBS轻柔洗细胞3次去除漂浮细胞，置于倒置显微镜下拍照测量，为0点的样本，之后将轻柔洗后的细胞在恒温37℃、5％CO2的环境中培养，培养一段时间后，观察细胞发育结构确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤3.3中：将Matrigel基底膜基质胶融化，用无血清培养基配制基质胶，比例为培养基∶基质胶＝1∶7；将配好的胶铺到Costar24孔Transwell上室，放置于培养箱使其成胶状；处于对数期的细胞用无血清的培养基悬浮，上室每孔加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含10％胎牛血清的培养基，并在恒温37℃、5％CO2的环境中培养；用含10％甲醇的结晶紫染色小室30分钟，将小室放入水中冲洗几遍，再用棉棒擦去上室内部膜表面的细胞，用正置显微镜拍照，33％醋酸洗脱细胞，利用酶标仪测其OD570，分析统计结果确定过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤3.4中：将培养24小时的肿瘤细胞和对照组细胞，使用胰酶消化离心后按AnnexinV-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒进行操作，使用流式细胞仪分析p62/IMP2的表达对细胞凋亡的影响。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤3.5中：将Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞接种于96孔板，培养24小时后加入不同浓度的紫杉醇PTX，浓度分别为：0、2、4、8、16、32、64和128nM和5-FU，浓度分别为：0、4、8、16、32、64、128和256μM，于恒温37℃、5％CO2的环境中培养48小时，采用CCK8试剂盒测定细胞活性，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制细胞活性曲线确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的作用。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，在所述步骤3.6中：采用活体裸鼠通过注射肿瘤细胞并绘制肿瘤生长曲线，确定p62/IMP2在体内促进ESCC的形成。
优选地，在本发明所提供的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法中，选用6-8周龄SPF级BALB/c裸鼠，每种细胞5只，共20只裸鼠；先在标准屏障环境中饲养5天到一周；培养待成瘤细胞Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-，按照标准细胞操作程序消化细胞、计数，将细胞混悬于无血清培养基中。将细胞分装于灭菌离心管中，每个离心管的细胞接种一个肿瘤，每个肿瘤接种量为5×106个细胞/150μl无血清培养基，使用1mL注射器分别在裸鼠前肢双侧皮下注射细胞；饲养、观察一段时间后，待肿瘤肉眼可见时，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，根据公式计算肿瘤体积：体积＝0.5x长x宽2，绘制肿瘤生长曲线，待肿瘤长到一定大小时处死裸鼠，将肿瘤剥离称重，提取其mRNA和蛋白。
(三)有益效果
通过上述的流程步骤操作，本发明构建了稳定过/低表达p62/IMP2的食管鳞癌细胞模型，利用细胞生物学实验、分子生物学实验以及体内动物模型证实p62/IMP2在ESCC(食管鳞状细胞癌)增殖、迁移、侵袭、凋亡和化疗耐药中发挥至关重要的作用。为深入探究ESCC耐药机制及基因靶向治疗提供必不可少的依据。本发明应用细胞生物学功能实验、分子生物学实验、裸鼠皮下成瘤模型等技术深入探究p62/IMP2在ESCC生长、转移、凋亡及化疗耐药中的作用及其分子机制，并结合临床组织样本解析与临床因素的相关性。本发明的特色之处在于将基础研究与临床相结合，有利于成果转化，用于ESCC的诊断与治疗。化疗耐药是肿瘤治疗失败的主要原因之一，研究耐药机制是当前研究的前沿发展趋势，本发明结果发现ESCC患者癌组织中p62/IMP2表达上调，参与了ESCC细胞的恶性转化，体外过表达p62/IMP2增强ESCC细胞对化疗药物的耐药性。本发明的创新之处是为ESCC化疗耐药机理和靶点治疗技术提供新的思路和方法。
附图说明
图1为p62/IMP2在正常食管组织，癌旁组织和食管鳞癌组织中的表达情况图；
在图1A中，p62/IMP2在正常ESCC中的弱表达；
在图1B中，p62/IMP2在癌旁组织中的弱表达；
在图1C中，p62/IMP2在癌旁组织中的高表达；
在图1A′，B′和C′中，为相应方框区的放大结果；
在图1D-F.中，p62/IMP2在ESCC组织中的弱表达、中等表达和高表达；
在图1D′-F′中，为相应方框区的放大结果；
在图1中，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶6000，Scale bars：25μm。
图2为p62/IMP2在食管上皮细胞和不同的ESCC细胞系中的表达特征图；
在图2A中，WB检测不同食管鳞癌细胞中p62/IMP2的蛋白水平及统计分析结果，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶500，GAPDH为对照；
在图2B中，qRT-PCR检测不同食管鳞癌细胞中p62/IMP2的mRNA水平。
图3为稳转细胞内p62/IMP2的蛋白和mRNA水平表达情况图；
在图3A中，WB检测Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞中p62/IMP2的蛋白水平；
在图3B中，qRT-PCR检测Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞中p62/IMP2的mRNA水平；
在图3中，***代表t检验P＜0.001，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶500，GAPDH为对照。
图4为CCK-8比色法检测过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响图；
在图4A中，过表达p62/IMP2促进Eca109细胞增殖能力；
在图4B中，低表达p62/IMP2抑制KYSE150细胞增殖能力。
图5为p62/IMP2对ESCC细胞迁移能力影响的示意图；
在图5A中，划痕实验证实过表达p62/IMP2促进ESCC细胞的迁移；
在图5B中，划痕实验证实低表达p62/IMP2抑制ESCC细胞的迁移；
在图5C中，Transwell实验证实过表达p62/IMP2促进ESCC细胞的穿模速率；
在图5D中，Transwell实验证实低表达p62/IMP2抑制ESCC细胞的穿模速率；
在图5中，*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01，***代表t检验P＜0.001，Scalebar：100μm。
图6为p62/IMP2对ESCC细胞侵袭能力影响的示意图；
在图6A中，Transwell实验证实过表达p62/IMP2促进ESCC细胞的穿模速率；
在图6B中，Transwell实验证实低表达p62/IMP2抑制ESCC细胞的穿模速率；
在图6中，***代表t检验P＜0.001，Scalebar：100μm。
图7为AnnexinV-PE/7-AAD法检测过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞凋亡影响的示意图；
在图7A中，上调p62/IMP2表达水平细胞凋亡率显著降低；
在图7B中，下调p62/IMP2表达水平细胞凋亡率显著增高；
在图7中，*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01。
图8为过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药影响的示意图；
在图8A中，在Eca109-vector和Eca109-p62+细胞中加入不同浓度的PTX(0、2、4、8、16、32、64和128nM)，48小时后用CCK8检测细胞活性；
在图8B中，在KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞中加入不同浓度的5-FU(0、4、8、16、32、64、128和256μM)，48小时后用CCK8检测细胞活性；
在图8中，*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01，***代表t检验P＜0.001。
图9为体内检测过/低表达p62/IMP2对ESCC的形成影响的示意图；
在图9A中，过/低表达p62/IMP2对裸鼠成瘤的影响；
在图9B中，过/低表达p62/IMP2时ESCC瘤子重量的统计结果；
在图9C中，qRT-PCR检测小鼠瘤组织中p62/IMP2的mRNA水平；
在图9D中，WB检测小鼠瘤组织中p62/IMP2的蛋白水平；
在图9中，*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01，***代表t检验P＜0.001，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶500，GAPDH为对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
在本发明的描述中，除非另有说明，″多个″的含义是两个或两个以上；术语″上″、″下″、″左″、″右″、″内″、″外″、″前端″、″后端″、″头部″、″尾部″等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语″第一″、″第二″、″第三″等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语″相连″、″连接″应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
名词解释：WB：westernblot(蛋白免疫印迹)；qRT-PCR：实时荧光定量PCR。
请参考图1至图9。
目前已有的研究发现p62/IMP2在多种肿瘤中异常高表达，但是具体的分子机制还知之甚少。本发明的目的为：1、阐明在ESCC患者癌组织中，p62/IMP2的表达特征，同时构建稳定过/低表达p62/IMP2的ESCC细胞株；2、揭示p62/IMP2在ESCC发生发展和耐药中的作用，为ESCC耐药机制提供新的线索。本发明将为深入研究ESCC的耐药机制和基因靶向治疗提供必要的理论依据。
本发明实现步骤如下：
一、检测p62/IMP2在ESCC中的表达特征
肿瘤相关基因的异常表达通常会导致肿瘤的发生。为了探究p62/IMP2在ESCC发生中的作用本发明首先利用p62/IMP2多克隆抗体检测了正常食管组织、癌旁组织和食管鳞癌组织中p62/IMP2的表达特征。组织芯片中包括102例食管鳞癌组织，102例癌旁食管粘膜组织和2例正常人食管组织的标本，通过免疫组织化学染色，检测p62/IMP2在不同组织中的表达水平。请参考图1，结果显示p62/IMP2在食管组织及ESCC组织中的阳性表达呈棕色颗粒，依照细胞阳性着色程度可分为弱表达(+)、中等表达(++)和高表达(+++)。
在图1中，对于A组，p62/IMP2在正常ESCC中的弱表达。对于B组，p62/IMP2在癌旁组织中的弱表达。对于C组，p62/IMP2在癌旁组织中的高表达。对于A\B\C组的A′，B′和C′为相应方框区的放大结果。对于D-F组，p62/IMP2在ESCC组织中的弱表达、中等表达和高表达，对应的D′-F′为相应方框区的放大结果。anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶6000，Scalebars：25μm。
统计结果显示p62/IMP2在食管鳞癌组织及对照食管组织的阳性表达率分别为97％(100/102)和14％(14/102)，对照组织包括2例正常食管组织和100例癌旁组织(其中有2例癌旁组织由于缺失组织标本未列入统计范围)。并且发现在食管鳞癌组织中高表达占37％，中等表达占33％，弱表达占27％，阴性表达仅有3％，而对照组织中p62/IMP2高表达占1％，中等表达占1％，弱表达占12％，阴性表达占86％，食管鳞癌组织与对照组织之间的差异具有统计学意义(P＜0.001)(如表1)，这些数据充分说明p62/IMP2在食管鳞癌组织中异常高表达，可能与ESCC的发生发展有相关性。
表1 p62/IMP2在食管鳞癌组织及对照组织中的表达
*为p＜0.001，食管鳞癌组织与对照组织相比较；(-)＝阴性表达，(+)＝弱表达，(++)＝中等表达，(+++)＝高表达。
二、构建稳定过/低表达p62/IMP2的稳定细胞株
2.1、研究p62/IMP2在不同食管鳞癌细胞中的表达
为了更好地研究p62/IMP2在ESCC中发挥的作用，本发明选取了正常食管上皮细胞和不同的ESCC细胞系Eca109、Eca9706、TE1、TE13、KYSE520、KYSE150、KYSE30和KYSE510，分别利用WB和qRT-PCR实验检测p62/IMP2蛋白及mRNA表达情况。
请参考图2A，其中HEEC为正常食管上皮细胞，结果显示食管鳞癌细胞Eca109、Eca9706、KYSE520中p62/IMP2的蛋白表达水平较低，在KYSE150和KYSE510中表达量相对较高。
请参考图2B，同时本发明利用qRT-PCR实验检测这些细胞中p62/IMP2的mRNA表达水平，结果与WB相一致。
本发明需要构建稳定的过表达和低表达p62/IMP2的食管癌细胞模型，具体地，本发明选取p62/IMP2表达量较低的Eca109细胞，通过慢病毒感染构建过表达p62/IMP2的食管癌细胞模型。选取KYSE150细胞通过慢病毒感染构建稳定低表达p62/IMP2的细胞模型，进而分析其在ESCC中的功能。
图2为p62/IMP2在食管上皮细胞和不同的ESCC细胞系中的表达特征。在图2A中，WB检测不同食管鳞癌细胞中p62/IMP2的蛋白水平及统计分析结果，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶500，GAPDH为对照；在图2B中，qRT-PCR检测不同食管鳞癌细胞中p62/IMP2的mRNA水平。统计结果均为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。
2.2、构建稳定过/低表达p62/IMP2的ESCC细胞株
将带有GFP标记的过表达p62/IMP2慢病毒和阴性对照病毒，分别感染Eca109细胞，标记为Eca109-vector和Eca109-p62+；将带有GFP标记的干扰p62/IMP2表达的慢病毒和对应的阴性对照病毒，分别感染KYSE150细胞，标记为KYSE150-control和KYSE150-p62-。第二天去除含病毒的培养基，更换为完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察GFP的发光情况。利用嘌呤霉素筛选目的细胞，提取相应mRNA和蛋白质，通过qRT-PCR和WB检测p62/IMP2的表达水平，确定稳定株构建的成功。
请参考图3A，WB结果显示Eca109-p62+细胞中p62/IMP2的蛋白表达量明显高于Eca109-vector细胞，KYSE150-p62-细胞中p62/IMP2的蛋白表达量低于KYSE150-control细胞。
请参考图3B，qRT-PCR检测结果显示与WB的相一致。
以上结果表明，获得有效表达p62/IMP2的ESCC细胞模型，为后续实验奠定了良好基础。
图3为稳转细胞内p62/IMP2的蛋白和mRNA水平表达情况。在图3A中，WB检测Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞中p62/IMP2的蛋白水平。在图3B中，qRT-PCR检测Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞中p62/IMP2的mRNA水平。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。***代表t检验P＜0.001，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶500，GAPDH为对照。
三、观察p62/IMP2在食管鳞癌中的作用
p62/IMP2在ESCC患者组织中异常高表达说明其可能参与了食管癌的发生发展，那么，为了确定p62/IMP2在ESCC细胞生物学功能方面发挥的作用，本发明利用细胞生物学方法通过检测p62/IMP2对Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，进一步挖掘p62/IMP2的分子功能和机制。
3.1、过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响
将细胞传至96孔板(5×103个/孔)，每组设置6个复孔，放入37℃，5％CO2培养箱培养。每隔24小时，连续4天在同一时间采用CCK8试剂盒测定细胞增殖情况，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制增殖曲线。
请参考图4A，实验结果显示在Eca109细胞中，过表达p62/IMP2后，细胞生长速度加快，促进细胞增殖能力。
请参考图4B，在KYSE150细胞中，低表达p62/IMP2后，细胞生长速度减慢，抑制细胞增殖能力。
图4为CCK-8比色法检测过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响。在图4A中，过表达p62/IMP2促进Eca109细胞增殖能力；在图4B中，低表达p62/IMP2抑制KYSE150细胞增殖能力。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。
3.2、过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用
取生长良好的Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞，细胞浓度为1×105，按照每孔1ml接种于6孔板中，培养过夜后融合率达到100％。
第二天用10μl微量移液枪头在板底部画十字。PBS轻柔洗细胞3次去除漂浮细胞，置于倒置显微镜下拍照测量，为0点的样本。继续放入37℃、5％CO2培养箱进行培养，24小时后取样，置于倒置显微镜下测量，比较划痕宽度，实验重复三次。
请参考图5A，结果显示过表达p62/IMP2的Eca109-p62+细胞比对照组Eca109-vector细胞迁移的速度明显增强。
请参考图5B，结果显示低表达p62/IMP2的KYSE150-p62-细胞比相应的对照组KYSE150-control细胞迁移速度慢。
请参考图5C，利用Transwell实验再次验证p62/IMP2对ESCC细胞迁移能力的影响，结果与划痕实验相一致，过表达p62/IMP2时促进ESCC细胞的穿模速率。
请参考图5D，低表达p62/IMP2时降低ESCC细胞的穿模速率。
以上结果表明p62/IMP2的表达水平影响ESCC的迁移能力。
图5p62/IMP2对ESCC细胞迁移能力的影响。在图5A中，划痕实验证实过表达p62/IMP2促进ESCC细胞的迁移，右侧为统计结果；在图5B中，划痕实验证实低表达p62/IMP2抑制ESCC细胞的迁移，右侧为统计结果；在图5C中，Transwell实验证实过表达p62/IMP2促进ESCC细胞的穿模速率，右侧为统计结果；在图5D中，Transwell实验证实低表达p62/IMP2抑制ESCC细胞的穿模速率，右侧为统计结果。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01，***代表t检验P＜0.001，Scalebar：100μm。
3.3、过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用
将Matrigel基底膜基质胶融化，用无血清培养基配制基质胶，比例为培养基∶基质胶＝1∶7，将配好的胶铺到Costar24孔Transwell上室，放置于培养箱使其成胶状，处于对数期的细胞用无血清的培养基悬浮，上室每孔加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含10％胎牛血清的培养基，于37℃、5％CO2孵箱中培养24小时，用结晶紫(含10％甲醇)染色小室30分钟，将小室放入水中冲洗几遍，再用棉棒擦去上室内部膜表面的细胞，用正置显微镜(10倍)拍照，33％醋酸洗脱细胞，利用酶标仪测其OD570，分析统计结果。分别将Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞进行Matrigel细胞侵袭实验，24小时后对透过膜的细胞进行结晶紫染色并拍照。
请参考图6A，结果显示上调p62/IMP2表达水平能增加穿过基质胶的细胞。
请参考图6B，下调p62/IMP2表达水平能抑制穿过基质胶的细胞。
结果证实p62/IMP2影响ESCC的侵袭能力。
图6为p62/IMP2对ESCC细胞侵袭能力的影响。在图6A中，Transwell实验证实过表达p62/IMP2促进ESCC细胞的穿模速率，右侧为统计结果。在图6B中，Transwell实验证实低表达p62/IMP2抑制ESCC细胞的穿模速率，右侧为统计结果。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。***代表t检验P＜0.001。Scalebar：100μm。
3.4、过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞凋亡的作用
培养24小时的肿瘤细胞和对照组细胞，使用胰酶消化离心后按AnnexinV-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒说明书进行操作。使用流式细胞仪分析p62/IMP2的表达对细胞凋亡的影响。
请参考图7A，结果显示在Eca109细胞中，上调p62/IMP2表达水平细胞凋亡率显著降低，右侧为统计结果。
请参考图7B，在KYSE150细胞中，下调p62/IMP2表达水平细胞凋亡率显著增高，右侧为统计结果。
图7为AnnexinV-PE/7-AAD法检测过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞凋亡的影响。在图7A中，上调p62/IMP2表达水平细胞凋亡率显著降低。在图7B中，下调p62/IMP2表达水平细胞凋亡率显著增高。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01。
3.5、过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的作用
将Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞接种于96孔板，培养24小时后加入不同浓度的紫杉醇PTX，浓度分别为：0、2、4、8、16、32、64和128nM和5-FU，浓度分别为：0、4、8、16、32、64、128和256μM，于37℃、5％CO2孵箱中培养48小时，采用CCK8试剂盒测定细胞活性，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制细胞活性曲线。
请参考图8A-D，结果显示在Eca109和KYSE150细胞对PTX和5-FU均有敏感性。
请参考图8A，随着PTX浓度增高，上调p62/IMP2表达水平时可抑制ESCC细胞对PTX的敏感性，增加细胞活性率。
请参考图8B，随着5-FU浓度增高，上调p62/IMP2表达水平时可抑制ESCC细胞对5-FU的敏感性，增加细胞活性率。
请参考图8C，下调p62/IMP2表达水平时可增强ESCC细胞对PTX的敏感性，降低细胞活性率。
请参考图8D，下调p62/IMP2表达水平时可增强ESCC细胞对5-FU的敏感性，降低细胞活性率。
上述结果表明p62/IMP2属于耐药基因，影响ESCC细胞对化疗药物的敏感性。
图8为过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的影响。在图8A中，在Eca109-vector和Eca109-p62+细胞中加入不同浓度的PTX(0、2、4、8、16、32、64和128nM)，48小时后用CCK8检测细胞活性。在图8B中，在KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞中加入不同浓度的5-FU(0、4、8、16、32、64、128和256μM)，48小时后用CCK8检测细胞活性。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01，***代表t检验P＜0.001。
3.6、p62/IMP2在体内促进ESCC的形成
购买6-8周龄SPF级BALB/c裸鼠(每种细胞5只，共20只)，先在标准屏障环境中饲养5天到一周，让其尽快适应环境。培养待成瘤细胞Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-，按照标准细胞操作程序消化细胞、计数，将细胞混悬于无血清培养基中。将细胞分装于灭菌离心管中，每个离心管的细胞接种一个肿瘤。每个肿瘤接种量为5×106个细胞/150μl无血清培养基。使用1mL注射器分别在裸鼠前肢双侧皮下注射细胞。饲养、观察一段时间后，待肿瘤肉眼可见时，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，根据公式计算肿瘤体积：体积＝0.5x长x宽2，绘制肿瘤生长曲线。待肿瘤长到一定大小时处死裸鼠，将肿瘤剥离称重，提取其mRNA和蛋白。
请参考图9A，过表达p62/IMP2促进ESCC肿瘤的生长，低表达p62/IMP2抑制ESCC肿瘤的生长，表明p62/IMP2参与ESCC的形成过程。
请参考图9B，两周后将瘤子从裸鼠身上剖出，称量瘤子的重量，结果显示Eca109-p62+组肿瘤的重量明显增高，低表达p62/IMP2组肿瘤的重量明显降低。
请参考图9C和图9D，为了验证此结果是由于p62/IMP2的表达水平引起的，本发明提取瘤组织的RNA和蛋白，检测p62/IMP2的mRNA和蛋白水平，发现Eca109-p62+组p62/IMP2的mRNA和蛋白水平明显升高，KYSE150-p62-组p62/IMP2的mRNA和蛋白水平明显下调。
以上结果表明在体内p62/IMP2促进ESCC的形成。
图9为体内检测过/低表达p62/IMP2对ESCC的形成的影响。在图9A中，过/低表达p62/IMP2对裸鼠成瘤的影响，右侧为统计结果。在图9B中，过/低表达p62/IMP2时ESCC瘤子重量的统计结果。在图9C中，qRT-PCR检测小鼠瘤组织中p62/IMP2的mRNA水平。在图9D中，WB检测小鼠瘤组织中p62/IMP2的蛋白水平。统计结果为三次独立实验数据平均后，结果表示为平均值+标准差。*代表t检验P＜0.05，**代表t检验P＜0.01，***代表t检验P＜0.001，anti-p62/IMP2抗体稀释浓度为1∶500，GAPDH为对照。
本发明应用细胞生物学功能实验、分子生物学实验、裸鼠皮下成瘤模型等技术深入探究p62/IMP2在ESCC生长、转移、凋亡及化疗耐药中的作用及其分子机制，并结合临床组织样本解析与临床因素的相关性。本发明的特色之处在于将基础研究与临床相结合，有利于成果转化，用于ESCC的诊断与治疗。化疗耐药是肿瘤治疗失败的主要原因之一，研究耐药机制是当前研究的前沿发展趋势，本发明结果发现ESCC患者癌组织中p62/IMP2表达上调，参与了ESCC细胞的恶性转化，体外过表达p62/IMP2增强ESCC细胞对化疗药物的耐药性。本发明的创新之处是为ESCC化疗耐药机理和靶点治疗技术提供新的思路和方法。
本发明利用细胞生物学实验、分子生物学实验以及体内动物模型分别从临床样本、细胞、动物层面逐步探究p62/IMP2在ESCC中的作用，发现p62/IMP2促进ESCC增殖、迁移和侵袭能力，并抑制凋亡和化疗药物敏感性。所用到的技术均为研究基因分子功能和机制的最佳技术。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
Claims (10)
1.一种肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，包括：
步骤一、检测p62/IMP2在ESCC中的表达特征；
步骤二、构建稳定过/低表达p62/IMP2的稳定细胞株；
步骤三、观察p62/IMP2在食管鳞癌中的作用；
在所述步骤三中，包括步骤：
3.1、确定过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响；
3.2、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用；
3.3、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用；
3.4、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞凋亡的作用；
3.5、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的作用；
3.6、确定p62/IMP2在体内促进ESCC的形成。
2.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤一中：
利用p62/IMP2多克隆抗体检测正常食管组织、癌旁组织和食管鳞癌组织中p62/IMP2的表达特征；
优选地，通过免疫组织化学染色，检测p62/IMP2在不同组织中的表达水平。
3.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤二中，包括步骤：
2.1、研究p62/IMP2在不同食管鳞癌细胞中的表达，并选定细胞构建细胞模型；
2.2、构建稳定过/低表达p62/IMP2的ESCC细胞株；
优选地，选取Eca109细胞通过慢病毒感染构建过表达p62/IMP2的食管癌细胞模型；
优选地，选取KYSE150细胞通过慢病毒感染构建稳定低表达p62/IMP2的细胞模型。
4.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤3.1中：
将ESCC细胞转移至96孔板上，并在37℃恒温、5％CO2的环境下培养；
每隔24小时，连续4天在同一时间采用CCK8试剂盒测定细胞增殖情况，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制增殖曲线，根据增殖曲线确定过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响。
5.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤3.2中：
取Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞，细胞浓度为1×105，对细胞培养并使得细胞的融合率达到100％；
在平板上采用画十字方式布置细胞，采用PBS轻柔洗细胞3次去除漂浮细胞，置于倒置显微镜下拍照测量，为0点的样本，之后将轻柔洗后的细胞在恒温37℃、5％CO2的环境中培养，培养一段时间后，观察细胞发育结构确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用。
6.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤3.3中：
将Matrigel基底膜基质胶融化，用无血清培养基配制基质胶，比例为培养基∶基质胶＝1∶7；
将配好的胶铺到Costar24孔Transwell上室，放置于培养箱使其成胶状；
处于对数期的细胞用无血清的培养基悬浮，上室每孔加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含10％胎牛血清的培养基，并在恒温37℃、5％CO2的环境中培养；
用含10％甲醇的结晶紫染色小室30分钟，将小室放入水中冲洗几遍，再用棉棒擦去上室内部膜表面的细胞，用正置显微镜拍照，33％醋酸洗脱细胞，利用酶标仪测其OD570，分析统计结果确定过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用。
7.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤3.4中：
将培养24小时的肿瘤细胞和对照组细胞，使用胰酶消化离心后按AnnexinV-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒进行操作，使用流式细胞仪分析p62/IMP2的表达对细胞凋亡的影响。
8.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤3.5中：
将Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞接种于96孔板，培养24小时后加入不同浓度的紫杉醇PTX，浓度分别为：0、2、4、8、16、32、64和128nM和5-FU，浓度分别为：0、4、8、16、32、64、128和256μM，于恒温37℃、5％CO2的环境中培养48小时，采用CCK8试剂盒测定细胞活性，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制细胞活性曲线确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的作用。
9.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
在所述步骤3.6中：
采用活体裸鼠通过注射肿瘤细胞并绘制肿瘤生长曲线，确定p62/IMP2在体内促进ESCC的形成。
10.根据权利要求9所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，
选用6-8周龄SPF级BALB/c裸鼠，每种细胞5只，共20只裸鼠；
先在标准屏障环境中饲养5天到一周；
培养待成瘤细胞Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-，按照标准细胞操作程序消化细胞、计数，将细胞混悬于无血清培养基中。将细胞分装于灭菌离心管中，每个离心管的细胞接种一个肿瘤，每个肿瘤接种量为5×106个细胞/150μl无血清培养基，使用1mL注射器分别在裸鼠前肢双侧皮下注射细胞；
饲养、观察一段时间后，待肿瘤肉眼可见时，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，根据公式计算肿瘤体积：体积＝0.5x长x宽2，绘制肿瘤生长曲线，待肿瘤长到一定大小时处死裸鼠，将肿瘤剥离称重，提取其mRNA和蛋白。
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|---|---|---|---|---|
| CN107929278A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-04-20 | 中国医学科学院肿瘤医院 | 长管香茶菜甲素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 |
| CN109576369A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-05 | 河南医学高等专科学校 | 一种prr11在食管癌组织及食管癌细胞系中使用方法 |
| CN109652545A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-19 | 山西医科大学 | Znf750在筛选用于治疗食管鳞癌靶向药物中的用途 |
| US20190315833A1 (en) * | 2015-06-19 | 2019-10-17 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer and other cancers |
| CN110393800A (zh) * | 2019-08-07 | 2019-11-01 | 石河子大学 | 增强食管鳞状细胞癌化疗敏感的药物 |
-
2020
- 2020-12-29 CN CN202011604026.9A patent/CN112522209A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190315833A1 (en) * | 2015-06-19 | 2019-10-17 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer and other cancers |
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