CN102337332A - 一种基因及其编码的蛋白在制备诊断及治疗乳腺癌药剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Kin17基因及其编码的蛋白在乳腺癌诊断、预后观察及治疗中的应用。本发明通过免疫组化与免疫荧光方法检测分析组织细胞中Kin17的表达水平，发现组织细胞中Kin17蛋白的表达量随乳腺疾病的发展从早期到晚期逐渐提高，可通过对Kin17蛋白的检测来了解肿瘤细胞的增殖程度，帮助及时诊断乳腺癌；同时发现Kin17蛋白在预后较好的乳腺癌患者组织中表达较低，在发生远处转移或死亡的乳腺癌患者组织中高表达，可通过对组织中Kin17蛋白的检测来进行患者预后分析及预警；本发明通过沉默或降低肿瘤细胞Kin17基因的表达，发现肿瘤细胞的增殖受到抑制，且对抗癌药物阿霉素的敏感性增强，可通过沉默Kin17基因的方法应用于乳腺癌治疗，降低阿霉素用量，从而降低肿瘤细胞耐受性及降低阿霉素造成的细胞毒性。

Description

一种基因及其编码的蛋白在制备诊断及治疗乳腺癌药剂中的应用

技术领域

本发明涉及Kin17基因及其编码的蛋白Kin17在乳腺癌诊断、预后分析以及治疗中的应用。

背景技术

乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，根据大量乳腺癌标本的基因芯片的结果，将乳腺癌分为以下几种：

Luminal A型——此型乳腺癌的分子标记表达特点为：ER⁺或PR⁺，HER-2^-，多见于早期乳腺癌，该型乳腺癌对内分泌激素治疗敏感，对化疗不敏感，复发风险低，预后较好。

Luminal B型——此型乳腺癌的分子标记表达特点为：ER⁺和/或PR⁺，HER-2⁺。该型乳腺癌高表达HER-2基因；对内分泌治疗敏感，但对他莫昔芬(Tamoxifen)的反应性较差。

Normal breast like型——此型乳腺癌的分子标记特点为：ER⁺，PR⁺，HER-2^-。其基因表达特点为高表达脂肪组织和非上皮细胞的基因，低表达基底上皮和管腔上皮基因。此类型乳腺癌对内分泌治疗较为敏感，预后较好。

HER-2阳性型此型乳腺癌的分子标记表达特点为：ER^-PR^-HER-2⁺。该型乳腺癌虽然对化疗较为敏感，但其预后较差。该型高表达HER-2基因，所以对HER-2抗体的靶向治疗有效。目前临床上采用曲妥珠单抗联合紫杉醇类药物或多西他赛/卡铂化疗，反应性好。

Basal-like型(基底样型)此型乳腺癌的分子标记表达特点为：ER^-PR^-HER-2^-，持续表达正常乳腺中的肌上皮细胞或是基底细胞基因(如CK5/6、CK14、CK17、EGFR等)。由于该型激素受体及HER-2受体的表达均为阴性，对内分泌治疗及HER-2抗体治疗无效，化疗是唯一的全身性治疗，恶性程度高，肿瘤进展快，且易复发转移，预后最差。

通常情况下，ER，PR，HER2表达均为阴性的乳腺癌被称为“三阴性型“(triple negativebreast carcinoma，TNBC)，大多数的三阴乳腺癌属于基底样亚型。

近年来，乳腺癌的发病率越来越高。2010年，美国癌症协会统计表明，乳腺癌是女性发病率最高(28％)，死亡率第二(26％，仅次于肺癌)的肿瘤。目前在乳腺癌的诊断方面取得了较大的进步，主要的治疗方法有化疗、手术切除病灶、内分泌治疗和分子靶向治疗等，但治疗效果还不尽理想。有6％的乳腺癌患者在确诊时已发生转移；有20-50％的乳腺癌患者在初次确诊后发生转移，发生转移的乳腺癌患者的五年生存率仅有26％。大约30％早期乳腺癌患者尽管接受一些辅助治疗，但仍然容易复发。50％的乳腺癌患者对化疗药物产生耐药性。最近出现的癌症靶向治疗，给乳腺癌的合理治疗带来了曙光，是当前乳腺癌治疗领域的研究热点。但在靶向药物的使用过程中会出现耐药性与药物抵抗性，给乳腺癌治疗带来了新的障碍。因此对乳腺癌靶向分子的研究显得越来越为重要。

人类Kin17基因定位于人类第10号染色体的p15-p14。该基因表达的蛋白Kin17是一种在物种进化过程中高度保守，而分布广泛的核蛋白，现有的研究结果表明，Kin17可能参与一个存在于所有类型细胞中的普遍调节机制。Kin17的蛋白结构呈模块状，有与DNA和RNA的结合活性。Kin17在DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复等多方面都有重要的功能，而且有可能与细胞增殖有关。但目前尚未发现有对Kin17与病理过程，如衰老、肿瘤的关系的研究。

发明内容

本发明公开了一种Kin17基因及其编码的蛋白Kin17在乳腺癌诊断、预后观察及治疗中的应用。所述Kin17 cDNA序列如序列表400<1>所示，所述Kin17蛋白序列如序列表400<2>所示。

首先，本发明通过免疫组化与免疫荧光方法检测分析各种新鲜乳腺癌组织、乳腺疾病标本、乳腺癌细胞系中Kin17的表达水平。发现Kin17在癌组织中的表达比正常组织中的表达高、Kin17在浸润性导管癌(Invasive ductal carcinoma，IDC)组织的血管内皮细胞中高表达、在肿瘤细胞系中高表达、并与反应细胞增殖程度的标记Ki-67共表达，同时发现Kin17的表达量随乳腺疾病的发展从早期到晚期逐渐提高。

上述结果说明Kin17参与了肿瘤的一些普遍的机制，与肿瘤的细胞增殖相关，可将组织细胞中Kin17的表达量作为确定肿瘤形成发展程度的一项指标，Kin17也可应用于制备乳腺癌诊断制剂。

其次，本发明对65例的IDC患者的临床特征进行了回顾性分析，并对所述IDC患者的预后情况进行随访分析，解析Kin17的表达与IDC患者的临床特征及预后参数的相关性。研究发现，Kin17与肿瘤级别及Ki-67表达量呈正相关。另外，Kin17在预后较好的乳腺癌患者组织中表达较低，在发生远处转移或死亡的乳腺癌患者组织中高表达。

因此，可将Kin17的表达量作为一项指标应用于乳腺癌患者的预后情况分析。

最后，本发明通过siRNA_Kin17沉默肿瘤细胞Kin17表达，或通过Kin17表达载体在肿瘤细胞中过量表达Kin17，从而检测不同的Kin17表达水平对细胞的增殖及分化的影响。研究发现Kin17的表达与细胞的增殖状况一致，降低肿瘤细胞中的Kin17表达能抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成能力，并改变癌细胞的细胞周期；而过表达Kin17则促进乳腺正常上皮细胞的增殖，同时抑制乳腺正常上皮细胞的分化。说明通过沉默Kin17基因可抑制乳腺癌细胞的增殖，此机制与乳腺癌的分型无关，这就为乳腺癌患者，尤其是ER^-PR^-HER-2^-型患者提供了一个有效的、新的治疗方案。

另，本发明在不同的Kin17表达水平下采用阿霉素(Adriamycin，Doxorubicin，ADM)诱发DNA损伤，通过ComtAssay法检测DNA损伤。研究发现，Kin17表达量的下降加剧了细胞中的DNA损伤，而ADM处理能引起Kin17表达上调，沉默Kin17基因后，细胞对DNA损伤药物更敏感。

因此，通过沉默或敲除基因降低Kin17的表达可以减少ADM的用量，从而降低乳腺癌细胞的耐药性以及降低ADM造成的细胞毒性。说明Kin17可应用于协助抗癌药物ADM治疗乳腺癌，可与传统抗癌药物一同制备效率更高的治疗乳腺癌的药物组合物。综上所述，说明该Kin17可用于乳腺癌的辅助治疗。

附图说明

图1Kin17在几种常见的肿瘤中的表达(a)肺癌(b)结肠癌(c)甲状腺癌(d)胃癌(e)直肠癌(f)睾卵癌(g)盲肠癌(h)肝癌(i)骨肉瘤(j)皮肤癌(k)牙龈癌(l)口腔腺样囊性癌(m)舌癌；每种肿瘤的染色图片都有100倍代表性区域图及400倍的放大效果图。

图2Kin17在乳腺的良性病变、导管内癌、浸润性导管癌标本中的表达

图3乳腺癌中癌巢组织与相应的癌旁组织中Kin17的表达

图4Kin17在乳腺的良性病变、导管内癌、浸润性导管癌标本中的血管内皮细胞中的表达

图5乳腺肿瘤细胞与正常细胞对Kin17的表达比较

图6Ki-67在乳腺癌组织中高表达

图7Kin17与Ki-67的在临床IDC标本与MDA-MB-231细胞中的共表达情况

图8Kin17在预后不良的患者标本中的表达；

图9转染pEGFP-N1-Kin17及pEGFP-N1到MDA-MB-231细胞后的荧光蛋白表达情况(A)及总蛋白中Kin17蛋白表达(B)。

图10不同浓度血清刺激后的Kin17表达情况

图11转染siRNA_Kin17后肿瘤细胞中Kin17表达被抑制

图12转染siRNA_Kin17后，MDA-MB-231和BT474细胞的生长被明显抑制

图13转染siRNA_Kin17后，MDA-MB-231和BT474细胞的克隆形成能力被明显抑制

图14用流式细胞仪分析转染siRNA_Kin17后的MDA-MB-231的细胞周期变化

图15通过转染pEGFP-N1-Kin17，过表达Kin17促进MCF-10A细胞的生长增殖

图16Kin17表达对3-D培养中对乳腺上皮细胞分化的影响；

图17Kin17的表达对乳腺细胞的DNA复制功能的影响。

图18Kin17对乳腺癌细胞的DNA修复中的作用(a)用cometassay检测敲除Kin17及(或)加ADM处理BT474细胞后的DNA损伤情况。(b)ADM处理细胞后，BT474细胞的DNA损伤比MCF-10A严重。(c)敲除Kin17后，MCF-10A及BT474细胞的DNA损伤加剧。

图19ADM刺激引起MCF-10A和BT474细胞中Kin17表达的改变

图20ADM作用下，剔除kin17的实验组与对照组细胞存活率对比图

具体实施例

实施例一：本发明实施例中应用到的实验方法与材料来源

实验材料：

1、患者与标本

肺癌4例、胃癌2例、食管癌1例、结肠癌7例、大肠癌1例、直肠癌3例、盲肠癌1例、肝癌3例、子宫肌瘤3例、卵巢癌1例、胶质瘤2例、肾癌1例、睾卵精原细胞癌2例、甲状腺癌14例、骨肉瘤9例、皮肤癌28例、口腔癌12例(舌癌、牙龈癌、上颚癌、舍下腺癌、上颚腺状囊性癌、口底癌、恶性黑色素瘤等)。

127个乳腺疾病标本，其中包括40例乳腺良性病变(Binign breast cancer，BBD)标本、22例导管内癌标本、65例浸润性导管癌标本。其中良性病变标本的性质是乳腺炎或者良性乳腺肿瘤。标本诊断都是根据国际病理标准做出诊断。这些标本进行免疫组化染色。另外还有4个患者的新鲜组织标本的癌巢中心标本与癌旁组织标本；提取这些新鲜组织的总蛋白并用western blot方法检测Kin17表达。取12例冰冻浸润性导管癌切片做免疫荧光检测Kin17与Ki-67的共定位情况。

2、免疫组化所用试剂

ChemMate^TMEnVision抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒：购自Dako公司，该试剂盒含标记有辣根过氧化物酶和抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚体分子，相当于二抗，它与兔抗或小鼠一抗结合。结合后的大分子标记的辣根过氧化物酶，再与DAB反应，显棕色。

抗体：免疫组化所用到的抗体信息见表1。其中鼠抗人Kin17单克隆抗体(k36和k58)的抗体特异性与选择性已经被Miccoli和Biard确认。

3、所用的抗体

实验所用到的免疫组化、免疫荧光、western blot一抗、二抗信息如下。

表1抗体信息表

表2所用细胞系的信息

实验方法：

1、免疫组化

免疫组织化学染色步骤：

①把石蜡切片放置60℃烘箱烤片30min。

②迅速把玻片从烘箱取出放入二甲笨脱蜡，浸泡两次，每次10min。把玻片分别浸入100％酒精2min，然后90％酒精2min，80％酒精2min，水2min。

③将玻片浸入3％的H₂O₂/甲醇溶液中，摇床上室温摇10min。二级水洗5min 3次。

④微波炉高火煮柠檬酸缓冲液至沸腾，放入玻片架，中火继续煮16min。

⑤二级水洗5min 3次，PBS洗5min 2次，用油性笔把组织膜圈起来，平放于湿盒中。滴加非免疫山羊血清室温封闭30min，甩干。

⑥加入50-100μl的1∶100倍稀释的Kin17(K58或K36)一抗，PBS做阴性对照，4度过夜。

⑦第二天早上甩干一抗与PBS，PBS洗5min 3次。

⑧滴加50-100μl的ChemMate^TMEnVision二抗，室温1h。PBS洗5min 3次。

⑨滴加预备好的DAB工作液显色2min左右，光镜下控制显色。自来水终止反应，流水冲洗10min。苏木素复染，自来水冲洗10min返蓝。

⑩80％酒精浸2min，90％酒精浸2min，100％酒精浸2min，二甲苯浸2min，静置晾干。中性树脂封片。Niken显微镜观察显色情况及拍照。

染色评分：分别就每张切片的染色强度(-，±，1+，2+，3+，4+)与阳性细胞的百分率(0-100)％进行打分。计算染色得分＝染色强度(0，0.5，1，2，3，4)×(0-100)。得分≤100定义为低表达(Low level)，得分＞100定义为高表达(High level)。全部切片由两个病理科医生在不知道组织诊断性质的情况下独立打分。

统计分析：应用SPSS12.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)统计学软件进行统计分析。患者、肿瘤的基本性质，肿瘤的病理参数与蛋白表达水平的关系的统计采用t-test(线性参数)或者卡方x²检验(分类资料)。所有的统计检验及相关p值都采用双侧检验，p值＜0.05说明有统计学意义。卡方检验的适用于随机样本数据，而且卡方检验的理论频数不能太小。两个独立样本的四格表检验比较可以分以下3种情况：①.所有的理论数T≥5并且总样本量n≥40，用Pearson卡方进行检验；②.如果理论数T＜5但T≥1，并且n≥40，用连续性校正的卡方进行检验。③.如果有理论数T＜1或n＜40，则用Fisher’s检验。R×C表卡方检验应用条件是R×C表中理论数小于5的格子不能超过1/5，而且不能有小于1的理论数。如果有R×C表中理论数小于5的格子超过1/5，或者有小于1的理论数可以通过增加样本数、列合并来实现。

2、免疫荧光双染实验

冰冻切片标本准备：

①将组织修剪成约1cm³较平整的方块。放入预先折好的与其大小相当的锡纸做的小盒子中，加入包埋剂完全没过组织，放入-20℃冷却，直至包埋剂由无色完全变为乳白色。

②将切片机提前预冷至-20℃。

③把包埋好的组织从锡纸中取出，用包埋剂将其贴在载物支撑台上。载物台装入切片机相应位置。

④待包埋剂凝固后对组织快进行适当的修平和补齐，并不断调整合适的切片位置。

⑤切片，每片的厚度为4-8μm，切好后取编号序号的载玻片，正面(有写序号的一面)朝下对着切出的薄片，靠近，直至切片自然附着在载玻片上。

⑥将玻片放入固定剂(预冷丙酮)中固定，10min，去处晾干，在通风橱中进行。

⑦彻底晾干后的载玻片用锡纸包好，在锡纸上写好序号后放于-80℃待用。

冰冻切片的免疫荧光染色：

①冰冻切片从-80℃取出，在锡纸中恢复到室温(约15min)。

②用IHC mark笔圈出样本。1×PBS洗3min，重复3次，以除去包埋剂。

③滴加冰甲醇固定5min。1×PBS洗4次，每次3min。

④滴加适量封闭剂室温1h。

⑤甩去封闭剂，滴加1∶100稀释的K58一抗及1∶100稀释的Ki-67一抗混合液，湿盒中4℃过夜。1×PBS洗4次，每次5min。

⑥加1∶400稀释的Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit antibody及1∶400稀释的AlexaFluor 594-conjugated goat anti-mouse antibody荧光二抗混合液，室温避光孵育1h。1×PBS洗3次，每次5min。

⑦滴加0.2g/ml的DAPI复染5min。1×PBS洗3次，每次5min。

⑦擦干玻片上的水分和防渗笔痕迹，滴加(10-15)μl防淬灭封片剂(Flurescene MountingMedium，Dako)封片，排除气泡，在湿的时候盖上盖玻片。

⑧室温放置1h，片干后放入冰箱避光保存。用Leica的TCS sp5激光扫描共聚焦显微镜下再进一步观察并拍照。

3、细胞培养

冷冻细胞复苏：将水浴锅调至37℃。取出冻存的细胞迅速放入，然后将细胞不断摇动至融化。用无菌吸管把细胞从冻存管中取出，放入培养液中，离心去上清。最后把细胞重悬后放入完全培养基中培养。

细胞培养：细胞在37℃，含5％CO₂的孵箱中培养，细胞系的信息及培养条件见表2。

细胞传代：先吸干净细胞培养皿中的培养液，PBS清洗一次，加入1×TE消化细胞，镜下见细胞收缩变圆或少数细胞脱落后，用与1×TE等体积的FBS来终止消化，轻轻吹打下所有的细胞放入离心管中。1000rpm离心5min，弃上清。用完全培养基重悬后，按一定比例稀释后在一次性的培养皿中继续培养。

细胞冻存：将贴壁细胞消化后离心收集，以含有10％DMSO的完全培养液

重悬细胞，细胞浓度为10⁶个/ml。混匀后以每管1-1.5ml分装至冻存管中，然后放在程序降温盒中，置-80℃的低温冰箱中过夜，次日保存到-176℃液氮中。

4、细胞生长分析

①取对数生长期的细胞，以3000个/ml/well的细胞浓度接种于24孔板；

②每24h计数一次，0.25％胰酶消化后用Beckman Z1计数仪器进行细胞计数，连续观察6d；

③以每天细胞数目为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

5、RT-PCR

组织RNA提取：

提取组织细胞总RNA，按Trizol试剂盒说明操作：取新鲜组织50mg，生理盐水洗净并剪碎，加入1ml Trizol，匀浆，将液体吸至1.5ml无酶管中，室温放置15min；加氯仿0.2ml，剧烈振摇15s，室温静置2～3min使之分层，4℃，10000g离心15min；将≤50％的上层水相小心转移至另一1.5ml的离心管中；加入0.5ml异丙醇，混匀，冰浴30min，4℃，10000g离心15min；弃上清，加入DEPC处理的75％乙醇700μl，混匀；4℃，7500g离心5min，弃上清，将1.5ml离心管倒置，以100μl的微量移液器吸净剩余乙醇，沉淀溶于20～40μl的无RNase水中。取2μl用DEPC处理水稀释至500μL，用紫外分光光度法测定A_260nm和A_280nm，RNA浓度(μg/ml)＝A_260nm×40×稀释倍数；纯度以A₂₆₀/A₂₈₀比值表示，达1.8～2.0方能用于实验，将余下的实验组和对照组RNA溶液稀释成相同浓度，-80℃保存备用。

逆转录：

rRNA的变性：

65℃反应5min后，立即置于冰上。

反应液配置：

逆转录反应：30℃，10min，然后42℃，20min，85℃，5min；4℃，5min。

6、pEGFP-N1-Kin17质粒的构建

引物的设计与合成

PCR扩增人类Kin17基因全长的引物设计：根据已知的人Kin17 cDNA全长序列(GenBank accession number NM_012311，1 182 bp)自行设计，上游引物5′ATACTCGAGATGGGGAAGTCGGATTTTC 3′，下划线碱基为Xho I酶切位点。下游引物为：5′GCAAGCTTGGCAAGTTTAGAAATGTCTTCAT 3′，下划线碱基为内切酶Hind III酶切位点。PCR产物片段的理论值应为1200bp。引物送广州华大基因有限公司合成。

人Kin17基因cDNA全长的PCR扩增

按以下体系配制PCR反应体系：

混匀后稍离心，于PTC-200型PCR仪上进行30个PCR循环。反应参数为：94℃，45s 59℃，1min 30s；72℃，1min，其中cycle 1，94℃变性5min，cycle 30，72℃延伸10min，12℃for ever。PK3质粒为法国Laurent Miccoli教授赠送。

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的EB)电泳，在凝胶成像系统下观察扩增结果，然后用PCR片段纯化试剂盒将扩增片段进行纯化，按操作说明书进行。

PCR产物和pEGFP-N1载体的双酶切和定向重组

取纯化的PCR产物和pEGFP-N1载体DNA按下列步骤分别进行双酶切：

混匀后稍离心，37℃水浴孵育5h，再30℃水浴孵育2h，65℃水浴15min终止酶切反应，为了保证酶切回收后有足量的DNA，每种样品的酶切反应可做2～3份。酶切后的PCR产物用PCR产物回收试剂盒回收。而酶切后的载体用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统下切胶，用Takara公司的凝胶回收试剂盒回收目的片段。

按下列步骤进行DNA连接，定向重组(目的基因与载体的摩尔分子比4∶1)

混匀后稍离心，16℃反应16h。

DNA重组质粒的转化

无菌条件下取上述新鲜感受态细菌200μl，每管加入连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min，转至42℃水浴90sec，再冰浴2min，加入不含抗生素的LB培养基800μl，于37℃空气摇床100～150r/min摇45min，使细菌复苏。常温，1000g稍离心，吸去上清800μl，将剩下的200μl均匀涂布于含100μg/ml卡那青霉素的LB平板上。室温放置20min，使液体吸收，37℃倒置培养16～20h至单菌落形成。

重组质粒的筛选及鉴定

各重组子转化的平板中分别挑取8个单菌落接种于3ml含卡那青霉素(50mg/l)的LB培养基中37℃振荡培养过夜。用24小时之内生长起来的克隆做菌落PCR鉴定。选取菌落PCR鉴定结果为阳性的克隆，用经典碱裂解法制备得到质粒DNA。把得到的重组克隆用Xho I/Hind III进行双酶切，酶切结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行观察。将用PCR与双酶切方法鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-Kin17的菌株送上海生工生物工程公司测序。

7、Western blot

将经SDS-PAGE电泳分离的凝胶，放在Bialab半干转仪上进行电转。步骤如下：剪好比凝胶面积稍大的的PVDF膜(GE Healthcare)和Whatman滤纸(6张)，用电转移缓冲液浸泡大约5min。在电转仪的平板上从下到上依次放置3层滤纸、PVDF膜、凝胶、3层滤纸。20V电转20min左右。

电转后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜1-2次。然后加入封闭剂，脱色摇床上室温孵育30min。将PVDF放入用封闭剂稀释好的一抗及β-actin一抗中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST将膜洗涤3×10min，以去除未结合的一抗。然后将膜放入封闭剂稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗中，于室温孵育1h。取出膜用TBST洗涤3×10min，除去未结合的二抗。

等体积混匀ECL发光试剂A液和B液配制ECL混合工作液，滴加在膜上(蛋白面朝上)，用GE公司的ImageQuant RT ECL成像系统来观察并拍照片。图片用GE公司ImageQuant TL7.0 Image Analysis Software软件来获取并处理。

8、质粒转染

①转染前一天，在6-well板中种植2×10⁵细胞到2ml的无抗性生长培养基中。等过夜后细胞长满平皿的30-50％时开始转染。

②去掉生长培养基，换上2ml的无抗性培养基。2h后开始转染。

对于每个转染孔，稀释4.0μg的质粒到250μl的培养基中，混匀；混匀Lipofectamine^TM2000，吸取10μl到250μl的无血清培养基中。混匀，室温静置5分钟。将稀释好的质粒和稀释好的Lipofectamine^TM 2000轻轻混合，室温孵育20min。将约500μl的质粒-Lipofectamine^TM 2000混合物到细胞孔的培养基中。摇晃培养板，使其混匀，置于37℃的CO₂培养箱继续培养。5-7h后给细胞换上新鲜的生长培养基。24-96h之间可检测。

实施例二：Kin17在乳腺癌中的表达及其与患者病理预后的关系

Kin17是一个与DNA复制，DNA损伤反应有关的蛋白。肿瘤的性质是快速的增殖，不受限制的DNA复制潜能与蓄积的DNA损伤。所以Kin17在人肿瘤中可能会表达升高，而且发挥一定的作用。为了证实这点，本实施例收集各种肿瘤标本，分析Kin17在其中的表达。同时分析了Kin17在乳腺癌标本与细胞系中的表达的情况。

导管内癌(Ductal carcinoma in situ，DCIS)是由于恶性的乳腺上皮细胞聚集在导管小叶的终端引起的一种原位癌，是浸润性导管癌(Invasive ductal carcinoma，IDC)的癌前病变。本实施例分析了Kin17在DCIS中的表达，以了解Kin17在肿瘤的发展过程中的作用。

实验结果及分析

1、Kin17在多种常见的肿瘤中普遍高表达

使用Kin17特异性抗体k36与k58对18种左右的常见肿瘤进行免疫染色，为了保证免疫组化的特异性，每张切片都在同一张玻片上进行阴性对照染色。阴性对照是用PBS来代替PBS稀释的抗体。如图1所示，在免疫染色中，阴性对照组无明显的特异性染色。而在十几种肿瘤标本中(胃癌、食管癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、直肠癌、盲肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌、睾卵精原细胞癌、甲状腺癌、骨肉瘤、皮肤癌、口腔癌)染色都比较强，且基本定位于细胞核中，虽然在细胞浆也有较淡的染色。在细胞增殖比较活跃的癌巢或者癌中心区域，Kin17的染色较强，而在癌巢旁边的正常组织中，Kin17染色较浅。此实验说明相对于正常组织，Kin17在各种常见实体瘤组织中明显高表达。

2、Kin17在组织细胞中的表达随乳腺癌发展由早期到晚期逐渐升高

利用免疫组化方法对127例标乳腺疾病标本(包括40例的BBD标本，22例导管内癌病变DCIS与65例IDC标本)进行免疫染色。实验发现，如图2所示，PBS阴性对照的标本都没有特异性染色。但在乳腺标本中都有不同程度的染色。Kin17表达主要定位于细胞核中，但在细胞浆中也有少量的表达；Kin17在良性病变组织及癌旁组织的表达都很低。90％(36/40)的BL组标本染色比较淡；81.8％的DCIS标本Kin17低表达，18.2％的DCIS高表达Kin17；、且43.1％的IDC标本细胞核染色比较高，同时细胞浆的染色相对较浅。统计发现，Kin17的在IDC中的表达，明显比良性病变组织(p＝0.0001)与DCIS组织(p＝0.036)要高；而且Kin17在DCIS组织中的表达，比BBD标本稍高，但没有统计学意义(p＝0.601)。因此在IDC中，癌巢中Kin17的表达明显比癌旁高(p＝0.0001，表3)。所以Kin17的表达在乳腺癌中明显升高。这表明Kin17的表达随着乳腺癌的发展由早期到晚期逐渐升高。

表3乳腺疾病分组中Kin17的表达及组间比较情况

^aCochran-Mantel-Haenszel test，^bPearson Chi-Square test，^cContinuitycorrection test，*statistically significant.

3、Kin17在乳腺癌的癌巢中的表达比相应的癌旁组织明显增强

选取4例新鲜IDC组织的癌巢与癌旁组织，分别抽提总蛋白，并用Western blot的方法比较了Kin17在它们中表达。如图3所示，Kin17在肿瘤组织中的表达明显比其相应的癌旁组织高。

4、Kin17在IDC标本的血管内皮细胞中的表达明显升高

本实施例同时分析了Kin17在血管内皮中的表达，结果如图4所示。Kin17在BBD和DCIS组织中的血管内皮细胞中表达较低，而在IDC组织中Kin17明显表达较强。统计发现Kin17在IDC中的血管内皮细胞中的表达明显比BBD和DCIS组织中的血管内皮细胞高(p＝0.011)。Kin17在肿瘤的血管内皮中高表达显示Kin17与血管内皮增生及肿瘤转移有关。

5、Kin17的表达在乳腺癌细胞系中明显升高

本实施例同时分析了Kin17在乳腺细胞系中的表达。培养了6种细胞系，包括4种乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，BT474，MCF-7，SKBr-3)，一种用生化的非致瘤性细胞系MCF-10A，还有一种正常的乳腺上皮细胞Hs 578Bst。MDA-MB-231细胞生长速度快，BT474细胞生长速度偏慢，叠层生长；MCF-7细胞生长速度中等，SKBr-3生长速度较慢。MCF-10A生长速度较快，而Hs 578Bst细胞生长速度较慢。研究发现Kin17在Hs 578Bst细胞中表达极低，在四种肿瘤细胞系中都明显高表达。MCF-10A中的Kin17蛋白比在Hs 578Bst中稍高，但也明显比其他四种肿瘤细胞低，结果如图5所示。表明kin17在肿瘤细胞系中的表达相对于正常细胞及非致瘤性细胞系仍然明显升高。

6、Kin17的表达与IDC的临床及病理参数有关

为了研究Kin17的表达与IDC患者的基本性质与预后参数是否有相关性，对65例的IDC患者的临床性质进行了回顾性分析。由单变量分析看出，Kin17的表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤的阶段、雌激素受体ER状态、HER-2状态、VEGF的表达没有相关性(表4)。但Kin17的表达与肿瘤的级别(p＝0.014)、PR的表达(p＝0.046)、p53的突变情况(p＝0.017)、luminalB亚型(ER⁺PR⁺HER-2⁺，P＝0.016)、Ki-67的表达(见图6，p＝0.046)有关。

表4 65例IDC标本中患者的临床病理参数与Kin17表达的关系

7、Kin17与Ki-67在乳腺癌中共定位

为确证Kin17与Ki-67的表达的相关性，我们收集了12例IDC新鲜标本做免疫双染试验。Kin17与Ki-67在肿瘤组织中都是高表达的，而且几乎所有的Ki-67的细胞都是Kin17阳性的，也就是Kin17与Ki-67在大多数的细胞中都是共定位的。Kin17的阳性率比Ki-67阳性率稍高。本实施例同时也检测了Kin17与Ki-67在乳腺癌细胞系MDA-MB-231的表达情况。如图7所示，他们在乳腺癌细胞系中也是共定位的。Ki-67被公认为是一种反应细胞增殖程度的标记。Kin17与Ki-67的共表达表明Kin17与细胞的增殖有关。

8、Kin17的表达与肿瘤患者的生存时间的关系

为了研究Kin17与肿瘤患者的预后的相关性，我们对IDC患者进行随访分析。随访时间为2003-2010年，为66.1％(43/65)。其中，4.6％(2/43)的患者死亡，7.0％(3/43)的患者发生肿瘤远处转移。其中，预后不良患者的肿瘤标本高表达Kin17，如图8所示。

小结

实施例二中的研究结果说明Kin17参与了肿瘤的一些普遍的机制，与肿瘤的细胞增殖相关。Kin17的表达量随着乳腺疾病的发展逐渐升高，可将组织细胞中kin17的含量作为确定肿瘤形成发展程度的一项指标，应用于乳腺癌的诊断；同时，kin17的表达量与肿瘤患者的预后生存相关，可将kin17的含量作为一项指标应用于预后分析。

实施例三：Kin17的表达与乳腺癌细胞DNA的复制及增殖的关系

本实施例中通过siRNA_Kin17敲除肿瘤细胞Kin17的表达，或通过高表达质粒在肿瘤细胞中高表达Kin17，来检测不同的Kin17表达水平对细胞的增殖、DNA复制、细胞周期、克隆形成能力、3D-培养后细胞形成乳腺导管的能力的影响。

实验方法

1、siRNA转染(用DNase-free，RNase-free的枪尖)

转染步骤与实施例一中质粒转染步骤相同，差别本实验稀释100pmol的Kin17 siRNA与Control siRNA取代4.0μg的质粒。

2、细胞生长分析

取对数生长期的细胞，以3000个/ml/well的细胞浓度接种于24孔板；每24h计数一次，0.25％胰酶消化后用Beckman Z1计数仪器进行细胞计数，连续观察6d；以每天细胞数目为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

3、克隆形成实验

微波溶解1.6％的琼脂1ml后迅速与1ml相同体积的2×DMEM(+20％FBS)混合，避免气泡产生，铺于6孔板，室温或4℃ 30min使其充分凝固；微波溶解0.7％的琼脂0.5ml后迅速与相同体积0.5ml的含有细胞的2×DMEM(+20％FBS)混合，细胞密度为400个每空，避免气泡产生，铺于6孔板上层，室温静置使其充分凝固后放入CO₂培养箱；每3天一次在上层琼脂上加培养基；细胞培养21d后，用结晶紫染色，计数含有大于50个细胞的克隆。

4、细胞周期检测

①离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

②加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。

③细胞染色：离心收集细胞，以1ml的PBS洗细胞一次，加入500μl PBS含50ug/mlPI，100μg/ml RNase A，0.2％Triton X-100，4℃避光孵育30分钟。

④流式分析：以标准程序用BD公司的FACScalibur流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件MODFIT software(Verity Software House)分析。

5、EuU incorporation assay实验检测DNA复制(按照试剂盒说明书进行)

①转染处理细胞后，用细胞生长培养基以1∶2000稀释EdU母液，每个24孔板加入200μl稀释好的含25μM EdU的培养液，37℃孵育2h。然后弃培养液，PBS清洗1-2次，每次5min。

②每空加入4％PFA(多聚甲醛)固定细胞，室温脱色摇床孵育30min。然后加入2mg/ml甘氨酸孵育5min。PBS清洗5min。

③加入含0.5％Triton X-100的PBS孵育30min。然后PBS清洗10min。

④按下列顺序配制1×Apollo反应液：

每空加入100μl的1×Apollo染色反应液，避光室温脱色摇床孵育30min。

⑤每空每次加入200μl渗透剂(含0.5％Triton X-100的PBS)作用2-3次，每次10min。

⑥加入甲醇冲洗1-2次，每次5min。

⑦用去离子水按1∶100稀释Hoechst母液，制备1×33342反应液，每空加入200μl，避光，室温脱色摇床孵育30min。PBS冲洗3次。

⑧Zasis显微镜观察荧光并拍照。

6、构建pEGFP-N1-Kin17质粒

①.编码人Kin17cDNA全长的PCR扩增。

②.经PCR扩增Kin17cDNA全长后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR成功地扩增出一条DNA条带，分子大小介于1000bp与2000bp之间，与目的片段预期大小相符。

③.pEGFP-N1-Kin17重组克隆的初筛与酶切鉴定

取BamH I/Hind III双酶切的PCR产物与BamH I/Hind III双酶切的表达载体pEGFP-N1，在T4DNA连接酶催化下定向DNA重组。选出菌落，用碱裂解法进行质粒抽提，根据电泳质粒中的大小初步筛选克隆；把重组质粒稀释20-100倍做模板，PCR作进一步筛选。将PCR筛选阳性的重组质粒用BamH I/Hind III进行双酶切，结果与序列推测值一致。即BamH I/HindIII双酶切重组质粒根据计算应可分别得到1200bp和4700bp两条带，电泳结果显示插入目的片段在1000bp与2000bp之间，与Kin17的目的片段大小一致。pEGFP-N1-Kin17融合表达质粒重组成功。

④pEGFP-N1-Kin17重组质粒中插入片段DNA测序结果

挑选经PCR与双酶切鉴定正确的阳性克隆送到上海生工生物工程公司测序。测序结果表明重组质粒中插入片段的DNA序列与人Kin17 cDNA序列完全一致。

7、稳定性筛选高表达Kin17的细胞系

确定细胞的G418筛选最佳浓度：将细胞稀释至1000cell/ml，按每孔100μl加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000μg/ml等12个级别，培养10-14d，在筛选10～14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。转染pEGFP-N1-Kin17质粒到MDA-MB-231细胞48h后，加入终浓度为500μg/ml的G418进行筛选细胞。每隔2-3d换上新的含有G418的生长培养基。

8、Matrigel三维细胞培养

细胞(2.5×10⁴)收集，离心，去上清，加入50μl的matrigel重悬细胞后，加入到96-well板中。然后在空加入150μl的生长培养基。继续培养15天后拍照。然后用福尔马林固定培养的胶，石蜡包埋，切片做HE染色，观察乳腺导管形成情况。

9、免疫荧光

①细胞爬片：取对数生长细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置有盖玻片的培养皿中，置二氧化碳培养箱培养过夜，待细胞长到合适的时间时，用PBS洗细胞表面2次。

②用4％PFA固定30min，PBS冲洗5min 3次。

③冰预冷的甲醇固定细胞5min，PBS冲洗5min 3次。

④加0.25％的Triton-100，室温孵育30min透过细胞核，PBS冲洗5min 3次。

⑤非免疫的山羊血清室温封闭1h。

⑥滴加Kin17(K58)一抗。把玻片平放在湿盒，4℃冰箱孵育5h，PBS冲洗5min 3次。

⑦加1∶400稀释的荧光二抗，湿盒中室温孵育1h，PBS冲洗5min 3次。

⑧1μg/ml的DAPI室温孵育5min，PBS冲洗5min 3次。

⑨防淬灭剂封片，避光保存。

⑩用蔡氏荧光显微镜观察荧光，并拍照。

10、pEGFP-N1-Kin17的转染

转染pEGFP-N1-Kin17进MDA-MB-231或者MCF-10A细胞48小时后，可以看到有绿色荧光蛋白表达，而且主要定位于细胞核中。而转染pEGFP-N1的细胞中的荧光蛋白则遍布整个细胞如图9所示。收集转染了pEGFP-N1与pEGFP-N1-Kin17的细胞，抽取总蛋白进行Western blot分析，可以检测到Kin17在细胞中过表达。

实验结果

1 Kin17的表达与细胞的增殖状况一致

本发明检测Kin17在细胞增殖过程中的表达。用不同浓度的血清刺激MDA-MB-231及BT474细胞。添加血清浓度高的细胞增殖速度越快，从而形成了具有不同生长速度的细胞。用Western blot的方法检测这些不同处理的细胞中Kin17的表达。如图10所示，添加高浓度的细胞中Kin17表达越高。因此，细胞中Kin17的表达跟细胞的增殖速度一致。

2沉默肿瘤细胞中的Kin17表达

本发明使用特异性针对Kin17的siRNA(siRNA_Kin17)来转染肿瘤细胞。转染siRNA_Kin17到MDA-MB-231和BT474细胞48h后，肿瘤细胞中的Kin17的表达水平明显比转染siRNA_NC的肿瘤细胞低，siRNA_Kin17转染能明显抑制细胞中Kin17的水平(见图11)。

3沉默肿瘤细胞中的Kin17抑制乳腺癌细胞的增殖

转染siRNA_Kin17与对照siRNA_NC到MDA-MB-231与BT474细胞24小时后，TE消化下细胞，计数，按10⁴cell/ml/well种植细胞到24-well板中，每隔24h检测一次细胞的数目，检测6d，绘制细胞生长曲线。如图12所示，转染siRNA_Kin17的细胞的生长速度明显比转染siRNA_NC的细胞慢。因此沉默肿瘤细胞中的Kin17抑制乳腺癌细胞的生长增殖。

4沉默肿瘤细胞中的Kin17基因抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力

转染siRNA_Kin17与对照siRNA_NC到MDA-MB-231与BT474细胞24小时后，TE消化下细胞，计数，种植10⁴/到含有软琼脂的6-well板中，培养21天。转染siRNA_Kin17的细胞的克隆形成数目明显比转染siRNA_NC的细胞少。沉默Kin17基因对MDA-MB-231细胞的克隆形成能力抑制率为66.7％，BT474细胞的抑制率为73.1％(见图13)。所以沉默肿瘤细胞中Kin17基因抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力。

5沉默肿瘤细胞中的Kin17改变了癌细胞的细胞周期

将转染后的细胞用流术细胞仪进行细胞周期检测。结果如图14所示，转染siRNA_Kin1748h后，MDA-MB-231细胞G₀-G₁期减少，S期的细胞增多。表明沉默Kin17基因后，乳腺癌细胞停滞于S期，不能顺利进入G₂期分裂。

6过表达Kin17促进乳腺正常上皮细胞的增殖

本发明将构建好的pEGFP-N1-Kin17质粒与空载体对照pEGFP-N1分别转染MCF-10A细胞，转让后得到的细胞分别命名为MCF-10^Kin17和MCF-10A^mock。转染pEGFP-N1-Kin17质粒的MCF-10^Kin17细胞中，kin17高表达。MCF-10^Kin17细胞的增殖速度明显比MCF-10A^mock快，p＜0.05(如图15所示)。表明过表达Kin17，能促进乳腺正常上皮细胞的生长速度。

7过表达Kin17抑制乳腺正常上皮细胞的分化

在步骤6的试验中，MCF-10A^mock细胞在培养一周之后，能在显微镜下形成明显的乳腺分支导管样结构；而MCF-10^Kin17细胞则不能形成这种典型分支导管样结构，很多细胞只是散在分布或者聚集成堆，如图16所示，不仅细胞数目增多，而且细胞出现核深染与核异型等性质。说明过表达Kin17不仅促进了乳腺正常上皮细胞的增殖，而且影响了细胞的分化。

8Kin17的表达水平与细胞的DNA复制有关

为了研究kin17对乳腺癌细胞的DNA增殖的调控机制，我们用EdU嵌入试验来检测DNA的复制情况。转染siRNA_Kin17来沉默乳腺癌细胞的Kin17表达，48h后，MDA-MB-231细胞与BT474细胞中的DNA复制明显减弱。而且转染pEGFP-N1-Kin17来上调细胞中的Kin17表达水平，48h后，发现MCF-10A细胞中的DNA复制受到增强(见图17)。说明Kin17的表达水平与细胞中的DNA复制有关。

小结

实施例三中的研究证明Kin17与乳腺癌细胞的增殖与细胞分化有关，敲除或沉默Kin17基因可抑制乳腺癌细胞的增殖，与乳腺癌的分型无关。目前，ER^-PR^-HER-2^-型的乳腺癌尚无有效的治疗方法，Kin17为乳腺癌中的ER^-PR^-HER-2^-型患者提供了一个新的治疗方案。

实施例四：Kin17与乳腺癌细胞的DNA修复的关系

肿瘤细胞的特征是基因组不稳定，DNA损伤蓄积。国外学者的研究已经充分证实，UV与射线辐射后的细胞中Kin17表达升高；Kin17参与DNA损伤修复的过程。在上述实施例中中，我们检测到乳腺癌细胞中Kin17表达明显升高。所以我们推测Kin17参与肿瘤细胞的DNA修复，避免了DNA损伤反应对细胞增殖的抑制。

阿霉素(Adriamycin，Doxorubicin，ADM)，是乳腺癌治疗的一种常规用药，不过它带有一定的细胞毒性。ADM及其他DNA损伤药物主要是通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡或死亡而发挥抗癌作用的。抑癌基因p53在DNA损伤药物的抗癌作用中发挥着重要的作用。但p53经常突变或者功能缺失DNA损伤药物的药物抵抗性。本发明研究敲除Kin17是否增强ADM对肿瘤细胞的抗癌敏感性，从而减少临床上ADM的用量，减少ADM的细胞毒性与耐药性。

本发明采用ADM诱发DNA损伤，通过ComtAssay法检测DNA损伤。

实验方法：

碱性CometAssay的试验步骤：

①样品准备：准备好待测的细胞样品。

②把Lysis Solution置于4℃或冰上预冷20min以上。

③把装有琼脂糖的瓶子盖子松开，瓶子放在90-100℃水浴中煮大约5min，将瓶子放在37℃的水浴20min以上冷却。

④把1×10⁵/ml的细胞与37℃琼脂糖按1∶10(v/v)混合，然后立即吸引50μl的混合液到玻片样品区。用枪头涂布使细胞混合液全部均匀覆盖样品区。如果样品比较多，可以加一定体积的融合琼脂糖到37℃预热的各个离心管中，然后把管子放在37℃。吸细胞悬液到各个管中，用加样枪吹打一次到两次，然后转移50μl的混合液到玻片样品区。

⑤用黑色薄膜遮光玻片，平放在4℃冰箱10min。在玻片的样品区边缘会出现一个清晰的0.5mm的环。把玻片放在高湿度环境，延长胶凝集时间到30min。

⑥把玻片浸没在预冷的Lysis Solution中，然后置于冰上或4℃冰箱30-60min。

⑦取出玻片，然后把玻片浸没在新鲜配制的Alkaline Unwinding Solution中，室温避光20-60min。

⑧调整破片的方向与电泳的方向平行，然后往电泳槽中加入300mM Alkaline ElectrophoresisSolution，使液面刚好没过玻片。调电压为大约1Volt/cm(本实验中用25V)。增加或减少电泳液直至电流为大约300mA。电泳20-40min。

⑨取出玻片浸没在二级水中5min洗两次，然后放在70％的乙醇中泡5min。

⑩取出玻片放在滤纸上，室温避光放置10-15min使凝胶干燥，便于观察。在玻片的每个凝胶上加入100μl稀释好的SYBR Green I。冰箱里避光孵育5min。然后倒掉过量的染液，用吸纸吸干液体，然后放置室温中充分干燥。

用Nikon荧光显微镜观察细胞的染色荧光。SYBR Green I的最大激发与发射波长分别是494nm与521nm。图像分析软件使用CASP Analysis Software(University of Wroclaw，poland)。每个样品数至少50个细胞。使用Pencent DNA in the Tail来评估DNA损伤情况。

实验结果

1敲除Kin17加剧了细胞中的DNA损伤

用siRNA_Kin17转染的方法敲除细胞中的Kin17基因后，MCF-10A与BT474细胞中的DNA损伤程度明显比对照组高(如图18a与图18c所示)，说明kin17对细胞中DNA修复是必须的。

2ADM处理能引起明显的DNA损伤

通过CometAssay试验，我们检测到正常的BT474细胞中含有少量的DNA损伤。加入ADM处理24h后，细胞中的DNA损伤随加药浓度的增加而逐渐增加。而且同等的药物浓度，肿瘤细胞BT474中产生的DNA损伤比正常细胞产生的多(如图18b所示)

3 ADM处理能引起Kin17表达上调

ADM处理MCF-10A细胞和BT474细胞72小时后，细胞中Kin17表达随着药物浓度的增加先升高后下降。在ADM的浓度为0.2-0.5ug/ml的时候，Kin17的表达升高；当浓度增加到0.6ug/ml的时候，Kin17的表达逐渐下降，如图19所示。

4敲除Kin17后，细胞对DNA损伤药物更敏感

在本研究中，敲除细胞中的Kin17基因后，MDA-MB-231细胞与BT474细胞对ADM的处理更敏感，细胞的存活率明显低于正常对照组(见图20)。

小结

通过本实施例的实验，证明Kin17对乳腺正常细胞与肿瘤细胞的DNA修复是必要的，敲除或沉默Kin17基因可增强乳腺癌细胞对ADM的药物敏感性，因此，通过敲除或沉默Kin17基因的表达可以减少ADM的用量，从而降低乳腺癌细胞的耐药性以及降低ADM造成的细胞毒性。

Claims (3)

1.一种Kin17基因及其编码的蛋白Kin17在制备乳腺癌诊断制剂中的应用。

2.一种Kin17基因及其编码的蛋白Kin17在乳腺癌预后分析中的应用。

3.一种Kin17基因及其编码的蛋白Kin17在制备抗乳腺癌药物中的应用。

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