CN115364225A - Pan-HER抑制剂在制备抗卵巢癌药物中的用途 - Google Patents
Pan-HER抑制剂在制备抗卵巢癌药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Pan‑HER抑制剂在制备抗卵巢癌药物中的用途。本发明目的是提供Pan‑HER抑制剂、Pan‑HER抑制剂与卵巢癌化疗药物的组合物在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。本发明通过建立体内外模型，发现JRF103单用或联合紫杉醇在卵巢癌体内外实验中起良好的抗卵巢癌作用。且与单药相比，JRF103联合紫杉醇在体内外实验中表现出更明显的抗卵巢癌作用。因此，Pan‑HER抑制剂JRF103单独或与紫杉醇联用具有成为卵巢癌新型治疗药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Pan-HER抑制剂在制备抗卵巢癌药物中的用途。
背景技术
卵巢癌是常见的、致死率最高的妇科恶性肿瘤。卵巢癌患者早期通常无明显症状。由于缺乏典型症状及早期诊断方法，超过70％的卵巢癌患者在病情发展到三期或四期后才被诊断出来，且预后较差。卵巢癌的标准化治疗为分期或缩瘤手术联合一线化疗药物。目前卵巢癌的5年生存率仅为47.5％。因此，有必要探索新的治疗药物。
人表皮生长因子受体家族(EGFR或HER家族)近年来受到广泛关注。HER家族由4种酪氨酸激酶受体(Receptor Tyrosine Kinases，RTKs)组成，分别为EGFR/HER1、HER2、HER3、HER4。HER家族受体与配体结合后产生同源或异源二聚体，与下游信号蛋白结合，并激活下游信号通路，包括Ras-Raf-MEK-ERK信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路、PLC-γ1信号通路、Src和STAT信号通路。通过调控下游信号通路，控制细胞增殖、分化、细胞周期、细胞迁移等。例如，活化的EGFR酪氨酸激酶与下游信号蛋白结合，激活了多种信号转导通路，促进细胞增殖和存活。HER2通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞凋亡。激活的HER2也可通过上调p53的表达，促进细胞增殖、分化、诱导凋亡。HER3的过表达与肿瘤耐药、转移以及生长相关。HER4有很好的抑制增殖、促凋亡活性。研究证明，HER家族的异常活化与各种类型的肿瘤密切相关，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌以及胃癌等。且在卵巢癌中约60％的上皮性卵巢癌中EGFR/HER1过表达，EGFR/HER1的高表达与卵巢癌的高肿瘤分级与高细胞增殖指数相关。卵巢癌中HER2的高表达与短的复发时间和低的总生存率相关。HER3的高表达与卵巢癌患者低无病生存期相关，可能是卵巢癌患者预后不良的独立标志物。HER4的异常活化与卵巢浆液性癌的化疗耐药和总生存时间缩短相关。综上，HER家族的异常活化与卵巢癌的发生发展密切相关，故而可以作为卵巢癌中潜在的抗肿瘤靶点。
目前靶向HER家族的药物包括单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂(TyrosineKinase Inhibitors,TKIs)。其中单克隆抗体靶向HER家族受体的胞外结构域，TKIs靶向与HER家族胞内的酪氨酸激酶结构域。单克隆抗体西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗分别靶向EGFR/HER1或HER2，已被FDA批准用于多种类型的实体肿瘤，如晚期鳞状细胞非小细胞肺癌。小分子酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼、阿帕替尼、来那替尼已被FDA批准用于EGFR突变阳性的非小细胞肺癌、乳腺癌、HER2阳性的乳腺癌中作为一线治疗药物。此外酪氨酸激酶抑制剂不仅包括靶向于单个HER家族成员的酪氨酸激酶抑制剂，也包括了双靶点酪氨酸激酶抑制剂和泛HER抑制剂(Pan-HER抑制剂)。阿法替尼是第一个口服Pan-HER抑制剂，其不可逆的靶向HER1、HER2和HER4。目前阿法替尼已被FDA批准用于EGFR突变阳性的非小细胞肺癌。
Pan-HER抑制剂JRF103为如式I所示化合物，在公开号为CN111630046A的专利文献中有所报道。但尚未见报道探究Pan-HER抑制剂JRF103单用、与其他化疗药联用时对卵巢癌的抑制作用及相关抗肿瘤机制。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本研究拟探索Pan-HER抑制剂JRF103单用及与紫杉醇联用时对卵巢癌的抑制作用及相关抗肿瘤机制，为临床上卵巢癌的治疗提供新思路。
为此，本发明的目的在于提供Pan-HER抑制剂在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。本发明的另一目的在于提供Pan-HER抑制剂与卵巢癌化疗药物的组合物在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
第一方面，本发明提供Pan-HER抑制剂在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
进一步地，所述的药物抑制卵巢癌细胞的增殖和/或集落形成。
进一步地，所述的药物促进卵巢癌细胞凋亡，引起凋亡相关蛋白表达量变化。
进一步地，所述的药物诱导卵巢癌细胞停滞于G1期，和/或抑制卵巢癌细胞迁移。
进一步地，所述的药物抑制卵巢癌细胞HER家族相关蛋白的磷酸化及其下游相关蛋白STAT3、AKT、ERK的活化。
第二方面，本发明还提供Pan-HER抑制剂与卵巢癌化疗药的组合物在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
其中，所述组合物是分别或同时给药的Pan-HER抑制剂与卵巢癌化疗药联合用药物。
其中，所述化疗药物包括：蔥环类药物、抗代谢类药物、抗有丝分裂药物、拓扑异构酶抑制剂、铂类药物、烷化剂。
进一步地，所述化疗药包括：环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、地塞米松、顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨中至少一种。
优选地，所述化疗药物为紫杉醇。
其中，所述药物抑制卵巢癌细胞集落形成，诱导卵巢癌细胞凋亡，抑制卵巢癌细胞迁移。
其中，所述药物降低M2型巨噬细胞、MDSCs、中性粒细胞的比例。
其中，所述药物使DCs比例升高，增强免疫。
进一步地，所述的药物是以Pan-HER抑制剂或Pan-HER抑制剂与化疗药的组合物作为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地，所述的制剂为口服制剂、鼻腔给药制剂或注射制剂。
进一步地，所述Pan-HER抑制剂为式I所示化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，将其定义为JRF103化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，简称JRF103。
进一步地，所述的JRF103化合物、其异构体或其药学上可接受的盐的处方和制备工艺包括但不限于申请公布号为CN111630046A的发明专利中公开的技术。
有益效果：本发明通过建立体内外模型，发现JRF103单用或联合紫杉醇在卵巢癌体内外实验中起良好的抗卵巢癌作用。且与单药相比，JRF103联合紫杉醇在体内外实验中表现出更明显的抗卵巢癌作用。在SKOV3卵巢癌模型中，JRF103联合紫杉醇能通过抑制M2型巨噬细胞、MDSCs、中性粒细胞的比例，升高DCs的比例，增强免疫。在A2780s卵巢癌模型中，JRF103联合紫杉醇能进一步抑制HER家族蛋白。因此，Pan-HER抑制剂JRF103单独或与紫杉醇联用具有成为卵巢癌新型治疗药物的前景。
附图说明
图1为实施例1中卵巢癌患者肿瘤组织中EGFR/HER1的高表达与不良预后显著相关。
图2实施例1中卵巢癌患者肿瘤组织中HER2的高表达与不良预后显著相关。
图3为实施例1中卵巢癌患者肿瘤组织中HER3的高表达与不良预后无显著相关。
图4实施例1中卵巢癌患者肿瘤组织中HER4的高表达与不良预后显著相关。
图5为实施例2中2.1部分卵巢癌细胞系中HER家族蛋白的表达情况。
图6为实施例2中2.2部分JRF103抑制卵巢癌细胞的增殖作用。
图7为实施例2中2.3部分JRF103抑制卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的集落形成。(A)JRF103作用后SKOV3细胞系集落形成图片及其统计图。(B)JRF103作用后A2780s细胞系集落形成图片及其统计图。
图8为实施例2中2.4.1部分JRF103促进卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的凋亡。
图9为实施例2中2.4.2部分JRF103诱导卵巢癌凋亡相关蛋白的变化。(A)不同浓度的JRF103处理后SKOV3细胞中凋亡相关蛋白的表达情况。(B)不同浓度的JRF103处理后A2780s细胞中凋亡相关蛋白的表达情况，以GAPDH为内参。
图10为实施例2第2.5部分JRF103可引起卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)细胞周期停滞。
图11为实施例2中2.6部分JRF103抑制卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的迁移，比例尺
图12为实施例2中2.7部分JRF103抑制HER家族蛋白的磷酸化。
图13实施例2中2.7.2部分JRF103抑制下游信号的磷酸化。
图14为实施例3中JRF103抑制SKOV3卵巢癌腹腔瘤生长；(A)裸鼠腹腔内肿瘤分布情况；(B)肿瘤图片；(C)肿瘤重量统计图。
图15为实施例3中JRF103抑制A2780s卵巢癌腹腔瘤生长；(A)裸鼠腹腔内肿瘤分布情况；(B)肿瘤图片；(C)肿瘤重量统计图。
图16为实施例4中4.1部分JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的集落形成图片及其统计图。
图17为实施例4中4.2部分JRF103联合紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡数目增加。
图18为实施例4中4.3部分JRF103联合紫杉醇可引起卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)细胞周期停滞。
图19为实施例4中4.4部分JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的迁移，比例尺
图20为实施例5中5.1部分JRF103联合紫杉醇抑制SKOV3卵巢癌腹腔瘤生长；(A)裸鼠腹腔内肿瘤分布情况；(B)肿瘤图片；(C)肿瘤重量统计图。
图21为实施例5中5.1部分JRF103联合紫杉醇抑制A2780s卵巢癌腹腔瘤生长；(A)裸鼠腹腔内肿瘤分布情况；(B)肿瘤图片；(C)肿瘤重量统计图。
图22为实施例5中5.2部分JRF103联合紫杉醇延长SKOV3腹腔瘤模型中裸鼠生存期。
图23为实施例5中5.2部分JRF103联合紫杉醇延长A2780s腹腔瘤模型中裸鼠生存期。
图24为实施例6中6.1部分流式细胞术检测SKOV3腹腔瘤模型中各治疗组M2型巨噬细胞的比例。
图25为实施例6中6.1部分流式细胞术检测SKOV3腹腔瘤模型中各治疗组MDSCs的比例。
图26为实施例6中6.1部分流式细胞术检测SKOV3腹腔瘤模型中各治疗组DCs的比例。
图27为实施例6中6.1部分流式细胞术检测SKOV3腹腔瘤模型中各治疗组中性粒细胞的比例。
图28为实施例6中6.1部分流式细胞术检测SKOV3腹腔瘤模型中各治疗组单核细胞的比例。
图29为实施例6中6.1部分流式细胞术检测A2780s腹腔瘤模型中各治疗组M2型巨噬细胞的比例。
图30为实施例6中6.1部分流式细胞术检测A2780s腹腔瘤模型中各治疗组MDSCs的比例。
图31为实施例6中6.1部分流式细胞术检测A2780s腹腔瘤模型中各治疗组DCs的比例。
图32为实施例6中6.1部分流式细胞术检测A2780s腹腔瘤模型中各治疗组中性粒细胞的比例。
图33为实施例6中6.1部分流式细胞术检测A2780s腹腔瘤模型中各治疗组单核细胞的比例。
图34为实施例6中6.2.1部分JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤组织中p-HER1的表达。
图35为实施例6中6.2.1部分JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤组织中p-HER2的表达。
图36为实施例6中6.2.1部分JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤组织中p-HER4的表达。
图37为实施例6中6.3部分JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤组织中Ki67的表达。
图38为实施例7中7.1部分SKOV3腹腔瘤模型中各组裸鼠的体重变化曲线。
图39为实施例7中7.1部分A2780s腹腔瘤模型中各组裸鼠的体重变化曲线。
图40为实施例7中7.2部分SKOV3腹腔瘤模型中各组裸鼠血生化检测结果。
图41为实施例7中7.2部分A2780s腹腔瘤模型中各组裸鼠血生化检测结果。
图42为实施例7中7.3部分SKOV3腹腔瘤模型中各组裸鼠重要脏器的H&E染色。
图43为实施例7中7.3部分A2780s腹腔瘤模型中各组裸鼠重要脏器的H&E染色。
ns，差异无统计学意义，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1实验仪器与材料
1.1、实验主要试剂
DMEM培养基：美国Gibico-invitrogen公司；胎牛血清(FBS)：美国Gibico-invitrogen公司；青霉素-链霉素：美国Gibico-invitrogen公司；胰蛋白酶：美国Gibico-invitrogen公司；紫杉醇：美国MCE公司；细胞增殖/毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)：东仁化学科技(上海)有限公司；Cocktail蛋白酶抑制剂：美国Epizyme公司；磷酸化酶抑制剂：美国Epizyme公司；BCA蛋白定量试剂盒：美国Thermo Scientific公司。JRF103试剂为实验室自制，具体制备工艺参照专利申请公布号为CN111630046A的发明专利中公开的技术。
1.2、肿瘤细胞株
人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、A2780s购买于美国典型培养物储藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)，由四川大学华西第二医院妇幼研究院妇女儿童相关疾病重点实验室传代保存；
人卵巢透明细胞系ES2、JHOC-5、OVISE购买于美国典型培养物储藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)，由四川大学华西第二医院妇幼研究院妇女儿童相关疾病重点实验室传代保存。
1.3、实验动物
用于建立SKOV3、A2780s卵巢癌腹腔瘤模型的BALB/C裸鼠(周龄4-6周，雌性，体重16-20g)购买自北京华阜康生物科技股份有限公司。所有实验动物均为SPF级别(Specificpathogen free，无特定病原体)，饲养于四川大学生物治疗国家重点实验室SPF级动物房。所有动物实验均参照国家颁布的《实验动物管理条例》以及四川大学实验动物委员会相关条例。
1.4、临床卵巢癌患者组织及病历资料
本申请获得了由上海芯超生物科技有限公司提供的154例原发性卵巢癌病人的病理组织切片及其病历资料。该研究所有纳入病例均签署知情同意书，并获得了上海芯超生物科技有限公司伦理委员会的伦理批准(审核编号：YB0502)。
2.主要实验方法与步骤
2.1利用组织芯片技术检测HER家族在卵巢癌患者肿瘤组织中的表达情况
2.1.1组织芯片免疫组化染色方法
(1)将154例由手术病理确诊的原发性卵巢癌患者的肿瘤组织用4％的多聚甲醛固定，冲水过夜，排列成组织芯片点阵后用石蜡包埋。
(2)用石蜡切片机将其切成5μm厚的组织芯片，经漂片、摊片后放入63℃烘箱，烘片1小时。
(3)用二甲苯脱蜡后用100％、95％、85％、75％酒精进行梯度脱水。
(4)抗原修复，用柠檬酸溶液(PH＝6.0)在高压锅中高压修复5分钟。
(5)用H2O2阻断内源性过氧化物酶，20分钟；用血清封闭20分钟
(6)分别将HER1(ab52894)用PBS以1：1000比例稀释、HER2(ab134182)用PBS以1：50比例稀释、HER3(ab101544)用PBS以1：25比例稀释、HER4(ab19391)用PBS以1：1200比例稀释后，滴加于组织芯片表面，于4℃冰箱孵育过夜。
(7)取出组织芯片，用PBS于摇床上洗两遍。滴加对应的二抗，于室温孵育30分钟。
(8)取出组织芯片，用PBS于摇床上洗两遍。用DAB进行显色，孵育5分钟后于自来水中冲洗终止。
(9)苏木素复染2分钟后，加入0.25％的盐酸酒精溶液反应2秒，于自来水中冲洗终止。
(10)封片。
(11)用Aperio ImageScope软件扫描组织芯片。
2.1.2组织芯片免疫组化染色统计分析方法及预后评价
根据组织芯片免疫组化染色结果，EGFR/HER1、HER2、HER3、HER4在肿瘤组织中的表达由两位不知道临床预后的病理学专家进行独立判读。以每个组织所有染色的面积和染色强度进行“染色阳性率评分”和“染色强度评分”。其中染色阳性率评分为：0分(阴性)，1分(1-25％)，2分(26％-50％)，3分(51-75％)，4分(76％-100％)。染色强度评分为：0分(阴性)，1分(1+)，2分(2+)，3分(3+)。以“染色阳性率评分”和“染色强度评分”的乘积作为总评分，最终0-5分为低表达组，6-12分为高表达组。通过Pearson’s Chi平方检验检测卵巢癌患者临床病理学特征和HER家族表达的关系。使用Kaplan-Meier评估EGFR/HER1、HER2、HER3、HER4的表达与卵巢癌患者总生存期及疾病无进展生存期之间的关联，同时使用对数秩检验(Log-rank)确定统计学差异，p值＜0.05时认为有统计学意义。
2.2细胞培养
2.2.1细胞复苏
(1)超净工作台紫外线杀菌30分钟后，打开通风系统，使超净台进入正常工作状态。
(2)根据慢冻速溶的原则，取出液氮罐中冻存的细胞株，立即放入37℃恒温水浴锅中解冻，轻晃使其彻底融化
(3)用75％的酒精棉球擦拭保种管外侧后放入超净台中。将保种管中的细胞悬液吸入含5ml DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，100mg/ml链霉素和100U/ml青霉素)的BD管中，于1200rpm/min离心3分钟。
(4)吸弃上清，加入10ml DMEM完全培养基重悬后倒入培养皿中，轻晃混匀培养基。
(5)置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。24小时左右观察细胞状态并换液或传代。
2.2.2细胞传代
(1)每日于显微镜下观察细胞的生长情况以及培养基消耗情况，约2-3天更换一次培养基。待细胞生长布满80％培养皿时可进行细胞传代。
(2)吸弃培养皿中培养基，用生理盐水或者无菌PBS冲洗培养皿后弃上清。每皿中加入3ml胰酶消化细胞。
(3)于倒置显微镜下观察见原贴壁细胞形态变圆且细胞间隙增加时，加入等体积含血清培养基中和胰酶，中止消化。
(4)用移液枪吹打细胞使其分散、悬浮，将细胞悬液吸入BD管中。
(5)1200rpm/min离心3分钟，弃上清，加入2-3mlDMEM完全培养基重悬细胞沉淀。
(6)按一定比例分皿培养，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
2.2.3细胞保种
(1)选择传代后生长状态良好的细胞。每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长布满80％培养皿时可进行细胞保种。
(2)吸弃上清，胰酶消化、离心后收集细胞沉淀。
(3)每皿细胞加入1ml预先配置好的保种液，重悬细胞。
(4)将细胞悬液吸入保种管中，标记细胞名称及保种日期。
(5)梯度降温(4℃冰箱放置10放置后转入-20℃冰箱放置半小时)后放入超低温(-80℃)冰箱，24小时后快速转移至液氮罐中保存。
2.3 CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测细胞活力
(1)取对数生长期的卵巢癌细胞，用胰蛋白酶消化细胞，离心后制成单细胞悬液，用计数板进行细胞计数。根据细胞大小、生长速度、药物作用时间取合适的细胞密度，将细胞接种于96孔板内，一般按照2-4x103细胞/孔/100μl(边缘孔加入生理盐水或无菌PBS避免培养基过度蒸发)。置于37℃、5％CO2的培养箱中预培养。
(2)待细胞贴壁后(细胞密度约20％-30％)，吸弃原有培养基，每孔加入200μl不同浓度的药物(JRF103：1nM、10nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、20μM)，同时在同一96孔板上设置空白对照组和溶剂对照组，每个浓度设置6个复孔。置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养24-72小时。
(3)药物作用24、48、72小时后，吸弃上清，每孔加入100μl稀释后的CCK8溶液(稀释比例：10μl CCK8溶液/100μl培养基)，避光放置于37℃、5％CO2的培养箱继续孵育半小时-两小时，至最高吸光度值在0.8-1.2范围内。
(4)用酶标仪测定每孔细胞在450nm处的吸光度，并通过公式计算加药后肿瘤细胞的增殖活力。
公式：细胞存活率＝[(给药组OD450nm-空白组OD450nm)/(对照组OD450nm-空白组OD450nm)]x100％
注：给药组OD450nm：含细胞的培养基、药物和CCK8溶液的孔的吸光度。对照组OD450nm：含细胞的培养基和CCK8溶液，但不含药物的孔的吸光度。空白组OD450nm：含CCK8溶液，但不含细胞的培养基和药物的孔的吸光度。
(5)使用GraphPad Prism8软件模拟细胞增殖曲线，并计算药物的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concertration,IC50)
2.4集落形成实验
(1)取对数生长期的卵巢癌细胞，用胰酶消化后制成细胞悬液。用计数板计数后，按照SKOV3：200个细胞/孔、A2780s：600个细胞/孔接种于6孔板中，轻晃6孔板，使细胞分布均匀。将6孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜，置细胞完全贴壁。
(2)吸弃原有培养基，加入不同药物浓度的DMEM完全培养基，每个浓度设置3个复孔。将6孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
(3)药物作用72小时后吸弃上清，每孔加入2ml的DMEM完全培养基，将6孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，直至对照组出现肉眼可见的集落后终止培养。
(4)吸弃上清，用预冷的PBS小心浸洗两次。每孔加入2ml预冷的甲醇或4％的多聚甲醛固定细胞10-15分钟。
(5)用预冷的PBS浸洗两次。每孔加入1ml 1％的结晶紫染色液染色15-20分钟。用PBS洗去多余的染色液并空气干燥。
(6)拍照，计数并统计集落数目。(注：大于50个细胞聚集为一个集落)
2.5流式细胞术检测细胞凋亡
(1)取对数生长期SKOV3、A2780s细胞，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，并用细胞计数板进行细胞计数。
(2)按合适细胞密度(一般为1x105cells/孔，可根据细胞大小、生长速度以及药物作用时间进行调整)将SKOV3、A2780s细胞接种于6孔板中，并每孔加入2ml的DMEM完全培养基。将6孔板置于培养箱(37℃，含5％CO2)中培养过夜，使细胞完全贴壁。
(3)吸弃上清，加入含预设药物浓度的DMEM培养基，每个浓度设3个复孔。放入培养箱中培养72小时。
(4)吸净每孔上清液分别置于流式管中，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞再分别收集细胞至对应的流式管中。1500rpm离心3分钟后吸弃上清，保留细胞沉淀(吸弃上清需用枪吸出，避免细胞被倒掉)。
(5)用预冷PBS重悬细胞，1500rpm离心3分钟后吸弃上清，共洗涤两次。
(6)每管用100μl 1x的Binding Buffer重悬细胞(试剂盒中原为10x BindingBuffer，用Milli-Q水稀释为1x)。每管加入1μl FITC Annexin V并用枪尖吹匀，置于4℃避光孵育10分钟，再加入1μl PI染液并用枪尖吹匀，于4℃避光孵育5分钟。
(7)孵育完毕后每管加入300-500μl 1x的Binding Buffer重悬细胞，1小时内上机检测。
2.6流式细胞术检测细胞周期
(1)收集对数生长期SKOV3、A2780s细胞(步骤同上)用细胞计数板进行细胞计数。
(2)按合适细胞密度(约5x 104cells/孔，可根据细胞大小、生长速度以及药物作用时间进行调整)将SKOV3、A2780s细胞接种于6孔板中，并每孔加入2ml的DMEM完全培养基。将6孔板置于培养箱(37℃，含5％CO2)中培养过夜，使细胞完全贴壁。
(3)待细胞完全贴壁后，吸弃上清，加入含预设药物浓度的DMEM培养基处理72小时。处理完成后，分别收集每孔上清液及贴壁细胞至离心管中，1500rpm离心3分钟后吸弃上清。
(4)用预冷的PBS重悬细胞，轻轻吹打混匀，1500rpm离心3分钟后吸弃上清，再重复用PBS洗涤一次。
(5)再次离心沉淀细胞，吸弃上清，每管加入300μl预冷的PBS，轻弹离心管底以分散细胞，避免细胞成团。
(6)每管缓慢加入700μl预冷的无水乙醇(因先加入了300ul预冷的PBS，故最终加入乙醇浓度为70％)，轻轻吹打混匀后用封口膜封口，4℃固定过夜(或于-20℃保存样品，1周内进行检测)。
(7)每管加入1ml PBS，重悬细胞，于2000rpm离心5分钟后弃上清。
(8)每管加入200μl PI染液(含100μg/ml RNase A)，充分混匀后于4℃避光染色30分钟。
(9)每管加入1ml PBS，重悬细胞。2000rpm离心5分钟后弃上清。加入400-600μlPBS重悬细胞，24小时内完成上机检测。
2.7划痕实验
(1)取对数生长期SKOV3、A2780s肿瘤细胞制成单细胞悬液，用计数板进行细胞计数，按照适当浓度接种于6孔板内(一般为5x105细胞/孔)。将6孔板放入培养箱(37℃，含5％CO2)中培养。
(2)当细胞密度达到90％-95％时，用无菌100μl枪尖垂直于孔板划横线。
(3)用无菌生理盐水漂洗2-3遍后吸净生理盐水，去除划掉的细胞。
(4)加入相应浓度的无血清培养基，放入37℃，含5％CO2的孵箱中培养。
(5)以加入药物时开始，分别于0小时、12小时、24小时于倒置显微镜下选取同一位置拍照。
2.8蛋白免疫印迹实验(Western blot)
2.8.1蛋白样品的制备
1)若为细胞样品，胰酶消化收集JRF103处理72小时的SKOV3或A2780s细胞。用预冷PBS洗涤细胞两次，4℃1200rpm 3分钟离心，尽量吸净上清。
2)样品置于冰上，根据细胞数量及组织大小加入适当的RIPA裂解液、cocktail蛋白酶抑制剂及磷酸化酶抑制剂(RIPA：cocktail＝200：1；冰上现配现用)，用枪尖吹匀。将样品置于冰上，用1ml胰岛素针反复洗吹至细胞彻底裂解。或于冰上用细胞超声破碎仪超声3-5次，每次3-5秒。
3)4℃，13000rpm离心15分钟，收集上清液至新的EP管中。
4)用BCA试剂盒检测蛋白浓度。按照浓度梯度(2000μg/ml，1500μg/ml，1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，25μg/ml，0μg/ml)配制BSA标准液。并配置BCA工作液(A液：B液＝50：1)。96孔板中每孔加入200μl的BCA工作液、10μl标准品或蛋白样品(每个样品设置3个复孔)。振荡器上振荡30s后于27℃孵育30分钟。96孔板冷却至室温后用酶标仪测定562nm处的吸光度。用Excel软件处理数据，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
5)按比例加入5x SDS Loading Buffer(蛋白体积：5x SDS Loading Buffer＝4：1)，并在100℃煮10min，于-80℃长期保存。
2.8.2配胶及SDS-PAGE凝胶电泳
1)洗净玻板，室温晾干，根据目的蛋白分子量选择7.5％或12.5％SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒。大分子量蛋白一般选用7.5％的分离胶，小分子量蛋白选用12.5％的分离胶。
2)将制备好的SDS-PAGE胶置于电泳缓冲液中，拔出梳齿。根据蛋白定量结果按每孔20-30μg蛋白调平各孔体积后上样。若目的蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至50-100μg。样品两端加入3-5μl预染蛋白Marker。
3)浓缩胶阶段用80v电压进行电泳，待样品完全进入分离胶后，将电压增加至120v，当上样缓冲液中溴酚蓝跑出胶时结束电泳。
2.8.3转膜
1)根据胶的大小准备合适的PVDF膜和滤纸。PVDF膜的孔径一般根据目的蛋白分子量的大小选择，分子量较大(大于20kD)时选择孔径0.45μm的PVDF膜，分子量较小(小于20kD)时选择孔径0.2μm的PVDF膜。
2)将PVDF膜放入甲醇中浸泡5-10秒后转移至转膜缓冲液待用。
3)装配转移“三明治”，按顺序从转膜夹子黑色面开始往上依次放置海绵、3-4层滤纸、胶、PVDF膜、3-4层滤纸、海绵。每层放好后小心赶去气泡。
4)将转膜“三明治”放入转膜装置中(黑色面对黑色面)，电泳槽中加入预冷的转膜缓冲液及冰袋，后放入4℃冰箱开始转膜。插上电极，电压调至100V恒压，电流约为0.2-0.4A，转膜时间为0.5-2小时。
2.8.4抗体孵育及显色
1)转膜结束后，将PVDF膜置于封闭缓冲液(即含5％脱脂牛奶的TBST)中，室温摇动孵育1-2小时。
2)封闭完成后，用TBST于摇床上洗3次，每次5分钟。
3)加入合适稀释度的一抗(用一抗稀释液稀释)，4℃缓慢摇动孵育过夜。
4)回收一抗。用TBST洗膜3次，每次10分钟。
5)根据一抗说明书选用与HRP连接的山羊抗小鼠或抗兔二抗，用5％脱脂牛奶稀释后，于室温摇动孵育1-2小时。
6)二抗孵育完成后，用TBST洗膜3次，每次10分钟。
7)用TBS缓冲液洗5分钟。
8)用发光法显色曝光：将SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substate显色液均匀涂抹于膜正面，反应3分钟后吸去多余的反应液，在化学发光仪中显色曝光，检测目的条带。
2.9BALB/c裸鼠卵巢癌腹腔瘤模型的建立
(1)准备所需数量的4-5周龄健康BALB/c雌性裸鼠，于SPF清洁级动物房适应环境一周。
(2)培养合适数量的对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3、A2780s。胰酶消化、收集肿瘤细胞，离心的细胞沉淀。
(3)用无血清、无抗生素的DMEM培养基吹打洗涤细胞两次并再次重悬细胞，使细胞浓度为2.5x107细胞/ml，准备接种。
(4)在动物房超净台中使用1ml无菌空针吸取混匀后的细胞悬液，每只裸鼠吸取200μl。
(5)酒精棉球消毒裸鼠腹部皮肤后，每只裸鼠腹腔注射接种SKOV3(5x106个细胞)或A2780s(5x106个细胞)。
2.10实验动物的分组
2.10.1 SKOV3卵巢癌腹腔瘤模型
1)单药治疗：Control组(接瘤后未干预组)；Vehicle组(接瘤后给予等体积溶剂的对照组)；JRF103组0.25mg/kg。
2)联用治疗：Control组(接瘤后未干预组)；Vehicle组(接瘤后给予等体积溶剂的对照组)；JRF103组0.25mg/kg；紫杉醇组8mg/kg；JRF103+紫杉醇组。
2.10.2 A2780s卵巢癌腹腔瘤模型
1)单药治疗：Control组(接瘤后未干预组)；Vehicle组(接瘤后给予等体积溶剂的对照组)；JRF103组0.5mg/kg。
2)联用治疗：Control组(接瘤后未干预组)；Vehicle组(接瘤后给予等体积溶剂的对照组)；JRF103组0.5mg/kg；紫杉醇组15mg/kg；JRF103+紫杉醇组。
2.11实验动物的治疗及观察指标
(1)腹腔接种后第7天按上述分组对裸鼠进行药物治疗。给药方案如下：在SKOV3卵巢癌腹腔瘤模型中JRF103，0.25mg/kg，灌胃，每天一次共4周；紫杉醇，8mg/kg，腹腔注射，每周一次共4周；溶剂，10％NMP+10％Solutol+80％milliQ，灌胃，每天一次共4周。在A2780s卵巢癌腹腔瘤模型中JRF103，0.5mg/kg，灌胃，每天一次共3周；紫杉醇，8mg/kg，腹腔注射，每周一次共3周；溶剂，10％NMP+10％Solutol+80％milliQ，灌胃，每天一次共3周。
(2)每3天记录一次小鼠体重，绘制小鼠体重变化曲线图。
(3)治疗4周后终止实验。取裸鼠眼球血、腹腔瘤结节、心肝脾肺肾。
①取裸鼠眼球血，于室温放置2-4小时后离心取血清(4℃短期保存或-80℃长期保存)，用于血生化检测。
②剥离裸鼠腹腔肿瘤结节，称重并拍照。每组随机选择5个肿瘤组织，分成3部分：a)用于流式微环境检测；b)放入保种管内储存于液氮罐中，用于提取蛋白行Western blot实验；c)用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化染色。
③每组选5只裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于HE染色。
(4)继续JRF103灌胃治疗，观察裸鼠的生存情况，记录生存时间。
2.12流式细胞学检测肿瘤微环境
(1)取新鲜肿瘤组织置于冰上，用眼科剪将肿瘤组织尽可能剪碎，转入15ml BD管中，每管加入5ml含消化酶的无血清、无抗生素DMEM培养基(每50ml无血清、无抗生素DMEM培养基里加入50mg I型胶原酶和25mgIV型胶原酶，现配现用)。充分振荡混匀后置于37℃旋转消化1-1.5h。
(2)消化完成后，用70μm的筛网滤去残渣，收集滤过的单细胞悬液。
(3)4℃1500rpm 3min离心后弃上清。
(4)若下层细胞中含较多红细胞，则加入红细胞裂解液，冰上裂解4分钟。
(5)4℃1500rpm 3min离心，弃上清。若未裂解完全，可重复步骤(4)。
(6)在下层细胞沉淀中加入预冷的PBS重悬洗涤细胞，轻轻吹匀后于4℃1500rpm3min离心。
(7)预冷的PBS重悬细胞，分装至流式管中。
(8)根据目标细胞选择合适的抗体及配色方案，每1x10^6个细胞中加入1μl抗体，4℃避光孵育30分钟。巨噬细胞染色指标：CD45、CD11b、F4/80、CD206。树突状细胞(DC)染色指标：CD45、CD11b、CD11c。骨髓源性抑制细胞(MDSC)染色指标：CD45、CD11b、Gr-1。中性粒细胞(neutrophil)染色指标：CD45、CD11b、Ly6G。单核细胞(monocyte)染色指标:CD45、CD11b、Ly6C。
(9)孵育完成后，每管加入1ml预冷的PBS洗涤细胞，1500rpm 3min离心后弃上清。每管加入300-400μl预冷的PBS重悬细胞。尽快上机检测。
2.13裸鼠血生化检测
(1)治疗结束后各组随机选取5只裸鼠，取眼球血。
(2)将眼球血标本放入4℃冰箱过夜，使血块固缩，析出血清。
(3)取出血标本，于4℃，300转/分钟，离心15分钟。
(4)吸取上层血清(避免吸入红细胞)，并转移至新的1.5mlEP管中(至少需200μl/管)。放入全自动生化仪中。检测指标：ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶),ALB(白蛋白)、AMY(淀粉酶)、BILT(总胆红素)、BILD(直接胆红素)、CHO(总胆固醇)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、TP(总蛋白)、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、LDH(乳酸脱氢酶)、TG(甘油三酯)、GLU(葡萄糖)、UA(尿酸)、UREA(尿素)、CRE(肌酐)。
(5)检测结束后记录各组生化指标结果，并用Graphpad prim 8进行统计学分析。
2.14病理组织石蜡包埋切片
(1)取新鲜的肿瘤组织或心、肝、脾、肺、肾脏器，组织厚度不超过5mm，置于4％的多聚甲醛中固定48小时以上。
(2)将固定好的组织放入包埋盒中，用铅笔做好标记。于自来水中冲洗过夜。
(3)次日于室温下梯度酒精脱水。
(4)二甲苯脱酒精，浸蜡。
心、肾、肺、肿瘤：75％酒精，1小时；85％酒精，1小时；95％酒精，30分钟，3次，共1个半小时；100％酒精，20分钟，3次，共1小时；二甲苯，20分钟，2次，共40分钟；石蜡浸泡，20+15+10分钟。
肝、脾：75％酒精，30分钟；85％酒精，30分钟；95％酒精，20分钟，3次，共1小时；100％酒精，15分钟，3次，共45分钟；二甲苯，30分钟，2次，共1小时；石蜡浸泡，20+15+10分钟。
(5)将包埋盒置于新蜡中，用新蜡包埋组织，置于降温机上等待蜡块凝固，约15-30分钟后可将蜡块剥下。
(6)切片：将蜡块固定于切片机上，调整角度后用旧刀片修整蜡块，直至组织适当露出。后换用新刀片以4-6μm厚度切片。切好后用镊子小心夹起薄蜡切片，置于漂片机上漂片(漂片温度控制在42℃左右)。待组织漂平后用载玻片捞起组织，于摊片机中摊片(摊片温度约为65℃)，将切片上多余的石蜡烤干后(1-2小时)置于切片盒中室温保存。
(7)石蜡切片脱蜡水化
①将切片整齐的放置于铜架上，于65℃烘片机中烘片1.5小时。
②烘片结束后，根据下列步骤脱去石蜡：二甲苯I，15分钟；二甲苯II，15分钟；100％酒精，10分钟；95％酒精，10分钟；85％酒精，10分钟；75％酒精，10分钟。
③水化，将脱蜡结束后的切片置于PBS中漂洗两次，每次5分钟。切片完成水化后应立即开始染色。
2.15苏木素-伊红染色(H&E染色)
(1)将脱蜡水化后的组织切片浸润在苏木素染液中，染色15s。染色完成后立即用自来水冲洗5-10分钟。于显微镜下观察苏木素染色情况。若染色较浅，可冲洗5分钟后再染15-30s。
(2)将切片用伊红染液染色10s，随后用自来水漂洗5分钟。
(3)自然晾干切片后封片(以中性树胶封片)。
2.16免疫组化染色
(1)将肿瘤组织进行石蜡包埋、切片、脱蜡水化后，用3％的过氧化氢于室温下脱蜡避光处理15分钟，封闭组织内源性过氧化物酶。
(2)用PBS于摇床上漂洗两次，每次5分钟。
(3)抗原修复：用枸橼酸钠缓冲液(10mM，PH 6.0)淹没切片，置于高压锅中煮沸，盖上锅盖，上汽10分钟后缓慢冷却，也可使用自来水在高压锅外淋浴，加速冷却。操作过程中避免组织干透。(枸橼酸二钠2.41g；柠檬酸0.38g；MiilQ 1L。)
(4)用PBS于摇床上漂洗两次，每次5分钟。
(5)打孔：擦去切片背面以及正面组织周围的水(操作过程中保持组织湿润状态)，滴加1％Triton X-100，孵育10分钟。随后用PBS于摇床上漂洗两次，每次5分钟。
(6)血清封闭：擦去切片背面以及正面组织周围的水(操作过程中保持组织湿润状态)，滴加与第二抗体同源的正常动物血清，于湿盒中37℃孵育15分钟。
(7)取出切片，将切片上的血清甩掉后直接滴加稀释好的一抗(一抗稀释液：PBS+1％BSA)，于4℃冰箱中孵育过夜。
(8)取出切片，用PBS于摇床上漂洗两次，每次5分钟。
(9)擦去切片背面以及正面组织周围的水(操作过程中保持组织湿润状态)，滴加针对一抗的生物素化二抗，置于湿盒中37℃孵育40分钟。
(10)用PBS于摇床上漂洗两次，每次5分钟。
(11)擦去切片背面以及正面组织周围的水(操作过程中保持组织湿润状态)，滴加SAB复合物，于湿盒中37℃孵育20分钟。
(12)用PBS于摇床上漂洗两次，每次5分钟。
(13)DAB显色：避光配制DAB溶液(1：200稀释)，现配现用。滴加后在显微镜下观察片子的显色情况，记录显色时间(同一指标不同处理组的显色时间一致)。自来水冲洗终止显色。
(14)苏木素复染15秒，染色完成后立即用自来水冲洗5-10分钟。
(15)室温下晾干切片并用中性树脂封片。
3.统计学分析
实验结果统计分析均采用GraphPad Prism 8软件进行，实验结果以均数±标准差表示。两组数据之间的比较采用Student’s t-test进行分析，多组之间的比较用ANOVA方差分析。生存分析采用Kaplan-Meier分析，并用Log-rank秩和检验计算各组生存期之间的差异。ns表示p＞0.05，差异无统计学意义。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001，差异有统计学意义。
实施例1卵巢癌组织中HER家族的表达及其与患者预后的关系
1.1卵巢癌患者肿瘤组织中HER家族的表达
HER家族包括EGFR/HER1、HER2、HER3、HER4等4种酪氨酸激酶受体。研究证明，HER家族的异常活化与各种类型的肿瘤密切相关，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌以及胃癌等。为了研究HER家族在卵巢癌患者肿瘤组织中的表达情况，以及其与卵巢癌患者预后的关系，我们收集了154例卵巢癌患者的临床资料，并对其肿瘤组织进行了组织芯片免疫组化染色。卵巢癌患者的临床资料及HER家族的表达情况如表1-4所示。根据组织芯片免疫组化染色结果，分别由两位病理学专家对免疫组化结果进行判读，结果发现，在154例卵巢癌患者中，分别有65例(42.2％)高表达EGFR/HER1，89例(57.8％)低表达EGFR/HER1；64例(41.6％)高表达HER2，90例(58.4％)低表达HER2；23例(14.9％)高表达HER3，131例(85.1％)低表达HER3；59例(38.3％)高表达HER4，95例(61.7％)低表达HER4。
通过分析患者的基本信息和HER家族的表达情况，我们发现，如表1-4所示。EGFR/HER1高表达主要集中在疾病分期III-IV期的患者(p＝0.0315)和肿瘤直径≥10的患者中(p＝0.0023)。HER2高表达主要集中在浆液性癌患者(p＝0.0184)，疾病分期III-IV期的患者(p＝0.0018)，淋巴结有转移(N1)的患者(p＝0.0017)，无远处转移(M0)的患者(p＝0.0002)和疾病有复发的患者中(p＝0.0013)。HER4高表达主要集中在疾病分期III-IV期的患者(p＝0.0083)，淋巴结转移无转移(N0)的患者(p＝0.0032)和疾病有复发的患者中(p＝0.0151)。
表1.肿瘤EGFR/HER1的表达与卵巢癌患者临床-病理资料特征
表2.肿瘤HER2的表达与卵巢癌患者临床-病理资料特征
表3.肿瘤HER3的表达与卵巢癌患者临床-病理资料特征
表4.肿瘤HER4的表达与卵巢癌患者临床-病理资料特征
1.2HER家族的表达与患者预后的关系
根据患者的生存资料，我们使用Kaplan-Meier生存分析来研究HER家族蛋白的表达与卵巢癌患者预后之间的关系。纳入的154例卵巢癌患者的中位随访时间为67个月。结果如图1-4所示。图1中，图(A)、(B)为组织芯片中EGFR/HER1在卵巢癌患者肿瘤组织的表达情况，(A)为高表达，(B)为低表达。放大倍数：20x。图(C)、(D)为EGFR/HER1的表达量与总生存期(OS)和疾病无进展生存期(PFS)之间的关系。(C)卵巢癌患者中EGFR/HER1高表达与患者OS呈负相关；(D)卵巢癌患者中EGFR/HER1高表达与患者PFS呈负相关。中位OS：高表达患者vs低表达患者＝42vs 79个月，差异有统计学意义(Long-rank test,χ2＝10.69,p＝0.0011)。中位PFS：高表达患者vs低表达患者＝29vs 87个月，差异有统计学意义(Long-rank test,χ2＝9.745,p＝0.0018)。
图2中，图(A)、(B)为组织芯片中HER2在卵巢癌患者肿瘤组织的表达情况，(A)为高表达，(B)为低表达。放大倍数：20x。图(C)、(D)为HER2的表达量与总生存期(OS)和疾病无进展生存期(PFS)之间的关系。(C)卵巢癌患者中HER2高表达与患者OS呈负相关；(D)卵巢癌患者中HER2高表达与患者PFS呈负相关。中位OS：高表达患者vs低表达患者＝32vs 81个月，差异有统计学意义(Long-rank test,χ2＝42.84,p＜0.0001)。中位PFS：高表达患者vs低表达患者＝20vs 52.5个月，差异有统计学意义(Long-rank test,χ2＝43.11,p＜0.0001)。
图3中，图(A)、(B)为组织芯片中HER3在卵巢癌患者肿瘤组织的表达情况，(A)为高表达，(B)为低表达。放大倍数：20x。图(C)、(D)为HER3的表达量与总生存期(OS)和疾病无进展生存期(PFS)之间的关系。(C)卵巢癌患者中HER3高表达与患者OS无显著相关；(D)卵巢癌患者中HER3高表达与患者PFS无显著相关。中位OS：高表达患者vs低表达患者＝68vs 66个月，差异无统计学意义(Long-rank test,χ2＝0.9453,p＝0.3309)。中位PFS：高表达患者vs低表达患者＝65vs 40个月，差异无统计学意义(Long-rank test,χ2＝1.243,p＝0.2649)。
图4中，图(A)、(B)为组织芯片中HER4在卵巢癌患者肿瘤组织的表达情况，(A)为高表达，(B)为低表达。放大倍数：20x。图(C)、(D)为HER2的表达量与总生存期(OS)和疾病无进展生存期(PFS)之间的关系。(C)卵巢癌患者中HER4高表达与患者OS呈负相关；(D)卵巢癌患者中HER4高表达与患者PFS呈负相关。中位OS：高表达患者vs低表达患者＝34vs 81个月，差异有统计学意义(Long-rank test,χ2＝33.84,p＜0.0001)。中位PFS：高表达患者vs低表达患者＝21vs 52.5个月，差异有统计学意义(Long-rank test,χ2＝38.45,p＜0.0001)。
图1-4表明，Kaplan-Meier生存分析表明卵巢癌肿瘤组织中EGFR/HER1、HER2以及HER4高表达的患者总生存期(Overall Survival,OS)和无进展生存期(Progression-freesurvival,PFS)较低表达患者短，差异有统计学意义。但HER3的表达水平与OS和PFS无显著相关性。
实施例2.Pan-HER抑制剂JRF103抑制卵巢癌细胞的体外研究
2.1卵巢癌细胞系中HER家族的表达
本研究使用流式细胞术检测人卵巢癌细胞系(SKOV3、A2780s、ES2、JHOC-5、OVISE)中HER家族蛋白的表达情况，如图5所示，其中绿色峰为检测峰，蓝色峰为同型对照峰。其中SKOV3、A2780s、ES2、JHOC-5、OVISE细胞系中EGFR/HER1、HER2、HER3、HER4的表达量分别为SKOV3：93.39％、99.53％、0.13％、63.50％；A2780s：61.99％、90.07％、84.21％、4.67％；ES2：97.40％、5.26％、0.733％、20.78％；JHOC-5：99.04％、90.88％、1.53％、16.17％；OVISE：4.91％、5.16％、2.50％、13.36％。
2.2Pan-HER抑制剂JRF103在体外抑制卵巢癌细胞的增殖
为了探究JRF103对卵巢癌细胞增殖的抑制作用，我们将卵巢癌细胞(A2780s、SKOV3、ES2、JHOC-5、OVISE)用不同浓度的JRF103(1nM、10nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、20μM)分别处理24小时、48小时、72小时后，加入CCK8溶液，用酶标仪检测不同药物浓度下卵巢癌细胞的吸光度，JRF103对卵巢癌细胞系的IC50分别为：24小时：A2780s：17.55μM、SKOV3：171.6μM、ES2：10279969μM；48小时：A2780s：6.236μM、SKOV3：10.07μM、ES2：9588μM；72小时：A2780s：1.888μM、SKOV3：3.298μM、ES2：6673μM。从图6可看出，用不同浓度的JRF103(1nM、10nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、20μM)分别处理24小时、48小时、72小时后，使用CCK8试剂盒检测药物作用后卵巢癌细胞的存活率。除ES2细胞系外，随着JRF103药物浓度的升高，卵巢癌细胞的存活率降低，且随着JRF103作用时间的延长，卵巢癌细胞的存活率也降低。故而认为JRF103对卵巢癌细胞的抑制作用也呈浓度依赖性和时间依赖性。
2.3Pan-HER抑制剂JRF103在体外抑制卵巢癌细胞集落形成
为了进一步探究JRF103对卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)增殖能力的影响，我们将SKOV3和A2780s细胞在不同浓度的JRF103(0μM，1μM，2μM，4μM)中处理72小时后继续在培养基中培养，直至对照组长出肉眼可见的集落后终止培养，并对所形成的集落数进行了统计。结果如图7所见，SKOV3、A2780s细胞经过不同浓度的JRF103(0μM，1μM，2μM，4μM)处理72小时后，改换为DMEM完全培养基继续培养，直至对照组可见集落形成时终止培养。使用1％的结晶紫染色并统计每组集落数量。随着JRF103药物浓度的升高，SKOV3、A2780s细胞形成的集落数量减少，且形成的集落面积减小。故而认为JRF103能抑制SKOV3、A2780s细胞的集落形成。
2.4Pan-HER抑制剂JRF103在体外诱导卵巢癌细胞凋亡
2.4.1Pan-HER抑制剂JRF103促进卵巢癌细胞凋亡
为了探索Pan-HER抑制剂抑制卵巢癌细胞活力的机制，我们将卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)用不同浓度的JRF103(0μM，1μM，2μM，4μM)分别处理72小时后，收集上清液及细胞，用Annexin V-PI凋亡试剂盒染色并用流式细胞仪检测不同药物处理组的凋亡情况。其中Annexin V标记凋亡细胞，PI标记坏死细胞。Annexin V-PI-为活细胞群，Annexin V-PI+为早期凋亡细胞群，Annexin V+PI-为晚期凋亡细胞群，Annexin V+PI+为坏死细胞群。结果如图8所示，与溶剂组相比，JRF103作用后SKOV3凋亡细胞比例(％)增加：control组凋亡细胞比例为3.973±0.4155，JRF103 1μM组凋亡细胞比例为7.348±0.4131,p＜0.01，JRF1032μM组凋亡细胞比例为8.768±0.5478，p＜0.001，JRF103 4μM组凋亡细胞比例为12.84±0.8329，p＜0.0001。在A2780s细胞中也能观察到随着JRF103浓度的增加，A2780s细胞凋亡比例增加。故而认为JRF103能促进卵巢癌细胞凋亡，呈浓度依赖性。
2.4.2Pan-HER抑制剂JRF103诱导卵巢癌细胞凋亡相关蛋白变化
上述实验证明了JRF103能诱导卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)凋亡率增加。为了验证JRF103能否诱导卵巢癌细胞凋亡相关蛋白变化，我们应用了蛋白免疫印迹法。我们用不同浓度的JRF103(0μM，1μM，2μM，4μM)分别处理SKOV3、A2780s细胞24小时后，提取蛋白。结果如图9所示，随着JRF103药物浓度的增加，SKOV3和A2780s细胞中抑制凋亡的Mcl-1、Bcl-2蛋白表达量下降。
2.5Pan-HER抑制剂JRF103在体外引起卵巢癌细胞周期停滞
为了进一步了解JRF103抑制卵巢癌增殖的机制，我们将卵巢癌细胞SKOV3、A2780s用不同浓度的JRF103(0μM、1μM、2μM、4μM)处理24小时，收集细胞，采用流式细胞术对用低渗PI染液染色的卵巢癌细胞进行了细胞周期的检测，结果如图10所示。
用JRF103处理SKOV3、A2780s卵巢癌细胞后，与对照组细胞相比，JRF103作用后位于G1期细胞的卵巢癌细胞比例亦增加，处于S期和G2期细胞的比例明显减少。在SKOV3细胞中，G1期细胞比例(％)分别为33.227±0.258(control组)，42.560±0.380(1μM)，59.920±0.370(2μM)，65.570±0.236(4μM)；S期细胞比例(％)分别为36.150±1.458(control组)，31.203±0.613(1μM)，20.873±0.283(2μM)，19.223±0.410(4μM)；G2期细胞比例(％)分别为28.503±0.347(control组)，23.467±0.382(1μM)，17.357±0.206(2μM)，13.373±0.331(4μM)。在A2780s细胞中。G1期细胞比例(％)分别为41.250±0.303(control组)，49.480±0.132(1μM)，51.970±0.330(2μM)，58.633±0.060(4μM)；S期细胞比例(％)分别为37.080±0.075(control组)，28.457±0.234(1μM)，25.817±0.491(2μM)，22.077±0.235(4μM)；G2期细胞比例(％)分别为20.647±0.558(control组)，20.327±0.401(1μM)，19.047±0.333(2μM)，16.963±0.457(4μM)。故而认为，JRF103主要使卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)停滞于G1期。
2.6Pan-HER抑制剂JRF103抑制卵巢癌细胞迁移
为了探究JRF103在体外是否能影响卵巢癌细胞的迁移能力，我们将细胞密度达到90％-95％的卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)划痕后，用不同浓度的JRF103(0μM、1μM、2μM、4μM)处理0小时、12小时、24小时后观察卵巢癌细胞的迁移情况。结果如图11所示，在SKOV3或A2780s细胞系中，与对照组相比，JRF103处理组细胞划痕更宽，但对A2780s细胞系迁移的抑制作用低于SKOV3细胞系。即JRF103能抑制卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的迁移，且随着药物浓度的增大，抑制迁移作用增强。
2.7Pan-HER抑制剂JRF103抑制卵巢癌细胞内HER家族及其下游信号的活化
2.7.1Pan-HER抑制剂JRF103抑制卵巢癌细胞内HER家族蛋白磷酸化
我们将卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)用不同浓度的JRF103(0μM、1μM、2μM、4μM)处理72小时后，收集细胞、提取蛋白，用免疫印迹技术(Western blot)对HER家族成员(EGFR/HER1、HER2、HER4)及其磷酸化蛋白(p-EGFR/p-HER1、p-HER2、p-HER4)的表达进行了检测。结果如图12所示，(A)用JRF103处理SKOV3细胞后，HER家族总蛋白表达无明显变化，但其磷酸化蛋白表达量明显减少。(B)用JRF103处理A2780s细胞后，HER家族总蛋白表达无明显变化，但其磷酸化蛋白表达量明显减少。GAPDH为内参。
JRF103处理卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)72小时后，EGFR/HER1、HER2及HER4总蛋白表达量无明显变化，但其磷酸化蛋白(p-EGFR/p-HER1、p-HER2、p-HER4)的表达量明显降低。且随着JRF103浓度的增加，HER家族磷酸化蛋白表达量减少。因此，JRF103对HER家族蛋白(EGFR/HER1、HER2、HER4)的活化有明显抑制作用。
2.7.2Pan-HER抑制剂JRF103抑制卵巢癌细胞内HER家族下游信号的活化
上述实验表明，JRF103对HER家族蛋白的磷酸化有明显抑制作用。既往研究表明，磷酸化的HER家族能与多种蛋白信号结合，形成蛋白信号复合物，其可诱导激活下游信号通路，包括PI3K/AKT、STAT、MAPK、PCL-γ1及Src等。本研究中，为了明确JRF103的作用途径，将卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)用不同浓度的JRF103(0μM、1μM、2μM、4μM)处理72小时后，收集细胞、提取蛋白，用免疫印迹技术(Western blot)检测了几个重要的下游蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平，包括STAT3、p-STAT3、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK。结果如图13所示，用JRF103(0μM、1μM、2μM、4μM)处理卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)72小时后，提取蛋白，用蛋白质免疫印迹法检测STAT3、AKT、ERK及其磷酸化蛋白的表达。(A)用JRF103处理SKOV3细胞后，STAT3、AKT、ERK总蛋白表达无明显变化，但其磷酸化蛋白表达量明显减少。(B)用JRF103处理A2780s细胞后，STAT3、AKT、ERK总蛋白表达无明显变化，但其磷酸化蛋白表达量明显减少。GAPDH为内参。
与对照组相比，JRF103组对STAT3、AKT及ERK的蛋白表达量无明显影响，但使p-STAT3、p-AKT及p-ERK的蛋白水平降低，且JRF103的浓度越高，p-STAT3、p-AKT及p-ERK的蛋白水平越低。结合上述实验结果，提示JRF103可能通过抑制JAK/STAT3、PI3K/AKT及RAS-ERK等信号通路来抑制卵巢癌细胞的增殖、转移。
实施例3.Pan-HER抑制剂JRF103在人卵巢癌腹腔瘤模型中的治疗作用
以上结果证明JRF103在体外能抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、促进肿瘤细胞凋亡并影响其细胞周期。为进一步探索JRF103在人卵巢癌腹腔瘤模型中的抗肿瘤作用，我们选用了SKOV3、A2780s腹腔瘤模型。在SKOV3腹腔瘤模型中，我们采用4-6周龄的BALB/c裸鼠，让其在SPF级动物房中适应一周后，腹腔接种5x106个SKOV3细胞。接瘤7天后，随机将裸鼠分成control组(即接瘤不处理组)、vehicle组(即接瘤后溶剂处理组，溶剂：10％NMP+10％solutol+80％MilliQ)、JRF103组(JRF103 0.25mg/kg，灌胃，每天一次)。灌胃给药，每天一次，持续28天后安乐死裸鼠。剪开裸鼠腹壁及腹膜，观察腹腔肿瘤分布情况并拍照，将所有肿瘤结节(包括肝周围间隙、脾肾周围、腹膜、肠管、大网膜、横膈膜下的肿瘤结节)剥离后称重并统计各组肿瘤重量差异。如图14所示，control组瘤重1.939±0.5136g，vehicle组瘤重1.795±0.4532g，JRF103组瘤重0.9051±0.1687g。与control组相比，vehicle组在肿瘤重量上无明显差异(p＝0.5137)。与control组相比，JRF103组能降低肿瘤重量，结果有统计学差异(control组vs JRF103组p＜0.0001)。
在A2780s腹腔瘤模型中，我们采用4-6周龄的BALB/c裸鼠，腹腔接种5x106个A2780s细胞。接瘤7天后，随机将裸鼠分组，分组同SKOV3腹腔瘤模型。灌胃给药，每天一次，持续21天后处死裸鼠，观察腹腔肿瘤分布情况并统计各组肿瘤重量差异。结果如图15所示，control组瘤重6.450±2.905g，vehicle组瘤重5.627±2.472g，JRF103组瘤重3.515±1.318g。与control组相比，vehicle组在肿瘤重量上无明显差异(p＝0.6086)。与control组相比，JRF103组能降低肿瘤重量，结果有统计学差异(control组vs JRF103组p＝0.04)。故而我们认为JRF103能抑制卵巢癌肿瘤的生长。
实施例4.Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌细胞的体外研究
4.1Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌细胞的增殖
为了进一步研究JRF103联合紫杉醇对卵巢癌细胞增殖能力的影响，SKOV3、A2780s细胞经过不同浓度的药物(JRF103 2μM，paclitaxel 5nM,JRF103+paclitaxle)处理72小时后，改换为DMEM完全培养基继续培养，直至对照组可见集落形成时终止培养。使用1％的结晶紫染色并统计每组集落数量。结果如图16所见，与对照组相比，JRF103单药和紫杉醇单药都能显著抑制SKOV3和A2780s细胞的集落形成。且与单药组相比，JRF103联合紫杉醇有更强的抑制SKOV3和A2780s细胞的集落形成的能力。
4.2Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡增加
为了探索JRF103联合紫杉醇能否增加卵巢癌细胞凋亡，我们将卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)分别用JRF103 2μM、PTX 5nM、JRF103 2μM+PTX 5nM处理72小时后，收集上清液及细胞，用Annexin V-PI凋亡试剂盒染色并用流式细胞仪检测不同药物处理组的凋亡情况。结果如图17所示，与单药组相比，JRF103联合紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡增加。在SKOV3细胞中，各组凋亡细胞比例分别为：control组(2.4±0.1531)，JRF103组(8.683±0.4145)，PTX组(22.63±1.043)，JRF103+PTX组(30.27±0.5445)(JRF103组vs JRF103+PTX组p＜0.0001；PTX组vs联用组p＝0.0029)。在A2780s细胞中，各组凋亡细胞比例分别为：control组(3.747±0.5329)，JRF103组(8.907±0.3716)，PTX组(9.417±0.1605)，JRF103+PTX组(37.48±0.1859)(JRF103组vs JRF103+PTX组p＜0.0001；PTX组vs联用组p＜0.0001)。故而认为在卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)中，与单药相比，JRF103联合紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡比例增加。
4.3Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇对人卵巢癌细胞周期的影响
为了测定JRF103联合紫杉醇对卵巢癌细胞周期的影响，我们将卵巢癌细胞SKOV3、A2780s分别用JRF103 2μM、PTX 5nM、JRF103 2μM+PTX 5nM处理24小时后，收集细胞，采用流式细胞术对用低渗PI染液染色的卵巢癌细胞进行了细胞周期的检测，结果如图18所示。
在卵巢癌细胞中，与对照组相比，JRF103单药、PTX单药及联合用药组作用后，G1期细胞比例(％)为：SKOV3:control组：41.98±0.5850，JRF103组：60.48±0.4989，PTX组：38.72±0.12，联合用药组：39.82±1.052。A2780s:control组：41.85±0.6255，JRF103组：51.10±0.8001，PTX组：42.21±0.7030，联合用药组：58.81±0.8282。S期细胞比例(％)为：SKOV3：control组：31.14±0.04933，JRF103组：20.30±0.4706，PTX组：24.72±0.9061，联合用药组：20.02±1.791。A2780s:control组：37.55±0.14，JRF103组：29.67±0.9836，PTX组：34.03±0.8346，联合用药组：14.6±0.6099。G2期细胞比例(％)：SKOV3:control组：24.22±0.1908，JRF103组：17.12±0.05033，PTX组：34.48±1.310，联合用药组：37.79±1.089。A2780s:control组：20.60±0.5992，JRF103组：19.23±0.3166，PTX组：23.76±0.6275，联合用药组：26.59±0.5265。
总体来说，JRF103使卵巢癌细胞周期主要停滞于G1期，紫杉醇诱导卵巢癌细胞停滞于G2期。
4.4Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌细胞迁移
为了探索JRF103联合紫杉醇对卵巢癌细胞迁移的影响，我们将细胞密度达到90％-95％的卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)划痕，用JRF103、PTX、JRF103+PTX处理0小时、12小时、24小时后观察卵巢癌细胞的迁移情况。结果如图19所示，与对照组相比，JRF103单药治疗和紫杉醇单药治疗均能有效抑制卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的迁移，且当JRF103与紫杉醇联用时，对卵巢癌细胞(SKOV3、A2780s)的迁移能力抑制效果更明显。
实施例5.Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇在人卵巢癌腹腔瘤模型中的治疗效果
5.1Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌肿瘤的生长
上述结果中我们发现JRF103单用能抑制卵巢癌肿瘤的生长，且JRF103联合紫杉醇在体外能发挥抗肿瘤作用。故而探索JRF103联合紫杉醇在体内的抗肿瘤效果。为此我们建立了SKOV3腹腔瘤模型和A2780s腹腔瘤模型。在SKOV3模型中，取4-6周龄的BALB/c裸鼠，腹腔接种5x106个SKOV3细胞。接种7天后将裸鼠随机分成7个组，每组10只：1)control组；2)vehicle组(溶剂，灌胃，每天一次，共28次)；3)JRF103组(JRF103 0.25mg/kg，灌胃，每天一次，共28次)；4)PTX组(paclitaxel 8mg/kg，腹腔注射，每周一次，共4次)；5)JRF103+PTX组(0.25mg/kg，灌胃，每天一次，共28次；paclitaxel 8mg/kg，腹腔注射，每周一次，共4次)。从给药开始，每隔两天测量裸鼠体重，观察裸鼠生长状态。最后一天给药结束后24小时内处死裸鼠。观察裸鼠腹腔内肿瘤分布情况并拍照。取出裸鼠腹腔内所有肿瘤结节拍照并称重。我们发现，如图20所示，control组瘤重1.939±0.5136g，vehicle组瘤重1.795±0.4532g，JRF103组瘤重0.8791±0.2698g，PTX组瘤重0.8780±0.1896g，JRF103+PTX组瘤重0.3280±0.1596g。与control组相比，vehicle组瘤重无明显变化(p＝0.5137)。与control组，JRF103组、PTX组、JRF103+PTX组肿瘤重量明显下降，差异有统计学意义(control组vs JRF103组p＜0.0001，control组vs PTX组p＜0.0001，control组vs JRF103+PTX组p＜0.0001)。与PTX组相比，JRF103+PTX组肿瘤重量明显下降，差异有统计学意义(PTX组vs JRF103+PTX组p＜0.0001)。
在A2780s腹腔瘤模型中，取4-6周龄的BALB/c裸鼠，腹腔接种5x106个A2780s细胞。接种7天后将裸鼠随机分成7个组，每组8只：1)control组；2)vehicle组(溶剂：10％NMP+10％solutol+80％MilliQ，灌胃，每天一次，共21次)；3)JRF103组(JRF103 0.5mg/kg，灌胃，每天一次，共21次)；4)PTX组(paclitaxel 15mg/kg，腹腔注射，每周一次，共3次)；5)JRF103+PTX组(JRF103，0.5mg/kg，灌胃，每天一次，共21次；paclitaxel 15mg/kg，腹腔注射，每周一次，共3次)。从给药开始，每隔两天测量裸鼠体重，观察裸鼠生长状态。最后一天给药结束后24小时内处死裸鼠。观察裸鼠腹腔内肿瘤分布情况并拍照。取出裸鼠腹腔内所有肿瘤结节拍照并称重。我们发现，如图21所示，control组瘤重8.565±2.550g，vehicle组瘤重8.113±2.343g，JRF103组瘤重4.808±1.481g，PTX组瘤重2.660±0.9119g，JRF103+PTX组瘤重0.5388±0.6817g。与control组相比，vehicle组瘤重无明显变化(p＝0.7172)。与control组，JRF103组、PTX组、JRF103+PTX组肿瘤重量明显下降，差异有统计学意义(control组vs JRF103组p＝0.0029，control组vs PTX组p＜0.0001，control组vs JRF103+PTX组p＜0.0001)。与PTX组相比，JRF103+PTX组肿瘤重量明显下降，差异有统计学意义(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.0001)。因此认为JRF103与紫杉醇联用在卵巢癌治疗中有协同作用。
5.2Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇改善卵巢癌腹腔瘤模型中裸鼠生存期
上述实验证明JRF103联合紫杉醇能降低SKOV3、A2780s腹腔瘤模型中裸鼠的荷瘤量，起抗肿瘤作用。为进一步探索JRF103联合紫杉醇对卵巢癌腹腔瘤模型中裸鼠生存期的影响，我们观察了各组裸鼠的生存时间，并绘制了生存曲线。生存曲线的比较采用对数秩检验(Log-rank test)。
在SKOV3腹腔瘤模型中，我们将裸鼠接种SKOV3细胞后随机分组(n＝10/组)：control组、vehicle组、JRF103组(JRF103：0.25mg/kg，灌胃，每天一次)、PTX组(paclitaxel8mg/kg，腹腔注射，每周一次，共4次)、JRF103+PTX组(JRF103：0.25mg/kg，灌胃，每天一次；paclitaxel 8mg/kg，腹腔注射，每周一次，共4次)。紫杉醇治疗4次后停药，JRF103每天给药，直至裸鼠死亡。观察各组裸鼠的生存时间并绘制生存曲线。结果如图22所示，各组的平均生存时间分别为：control组38天，vehicle组46.5天，JRF103组46天，PTX组42.5天，JRF103+PTX组55.5天。与control组相比，vehicle组裸鼠的生存时间未见明显变化(p＝0.00793)。与control组相比，JRF103组、PTX组以及JRF103+PTX组裸鼠的生存时间延长，差异有统计学意义(control组vs JRF103组，p＝0.0001；control组vs PTX组，p＝0.0004；control组vs JRF103+PTX组，p＜0.0001)。
故而认为，在SKOV3腹腔瘤模型中，JRF103能延长裸鼠生存时间，且JRF103联合紫杉醇延长裸鼠生存期作用更明显。
在A2780s腹腔瘤模型中，我们将裸鼠接种A2780s细胞后随机分组(n＝10/组)：control组、vehicle组、JRF103组(JRF103：0.5mg/kg，灌胃，每天一次)、PTX组(paclitaxel15mg/kg，腹腔注射，每周一次，共3次)、JRF103+PTX组(JRF103：0.5mg/kg，灌胃，每天一次；paclitaxel15mg/kg，腹腔注射，每周一次，共3次)。紫杉醇治疗3次后停药，JRF103每天给药，直至裸鼠死亡。观察各组裸鼠的生存时间并绘制生存曲线。结果如图23所示，各组的平均生存时间分别为：control组44天，vehicle组37天，JRF103组57天，PTX组63天，JRF103+PTX组87.5天。与control组相比，vehicle组裸鼠的生存时间未见明显变化(control组vsvehicle组，p＝0.2235)。与control组相比，JRF103组、PTX组、JRF103+PTX组裸鼠的生存时间延长，差异有统计学意义(control组vs JRF103组，p＝0.0147；control组vs PTX组，p＝0.0012；control组vs JRF103+PTX组，p＜0.0001)。
故而认为，在A2780s腹腔瘤模型中，JRF103能延长裸鼠生存时间。JRF103联合紫杉醇延长裸鼠生存期作用更明显。
实施例6.Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制卵巢癌生长的机制研究
6.1Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇在卵巢癌模型中对相关肿瘤微环境的影响
给药结束后，我们在每组中随机选取5只裸鼠，取其腹腔肿瘤进行相关肿瘤微环境的检测。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境中重要的免疫细胞，包括M1型及M2型巨噬细胞。其中M2型巨噬细胞能促进肿瘤生长并抑制肿瘤免疫。结果显示，在SKOV3腹腔瘤模型中，如图24所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行M2型巨噬细胞染色(CD45+CD11b+F4/80+CD206+)，并进行流式分析。
与control组(47.80±3.223)相比，vehicle组(45.14±3.479)、PTX组(43.55±19.79)M2型巨噬细胞的比例(％)未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.2776，control组vs PTX组p＝0.6873)。与control组相比，JRF103组(25.45±4.527)、JRF103+PTX组(18.31±7.198)M2型巨噬细胞的比例下降，差异有统计学意义(control组vs JRF103组p＝0.0002，control组vs JRF103+PTX组p＝0.0003)。故而说明，与对照组相比，JRF103组、JRF103+PTX组均能降低SKOV3腹腔瘤模型中M2型巨噬细胞的比例。与PTX组相比，JRF103+PTX组M2型巨噬细胞比例下降，差异有统计学意义(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.0476)，证明与紫杉醇组相比，JRF103联合紫杉醇能进一步降低SKOV3腹腔瘤模型中M2型巨噬细胞比例。故而认为在SKOV3腹腔瘤模型中，JRF103可能通过降低M2型巨噬细胞的比例起抗肿瘤作用。
同时用流式细胞术检测了各治疗组骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)的比例(％)。结果如图25所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行MDSCs染色(CD45+CD11b+Gr-1+)，并进行流式分析。
在SKOV3腹腔瘤模型中，与control组(74.41±8.832)相比，vehicle组(66.81±6.619)MDSCs的比例未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.1622)。与control组相比，与control组相比，JRF103组(68.40±12.97)MDSCs的比例未见明显变化(control组vsJRF103组p＝0.4163)。且与control组相比，PTX组(57.68±10.55)、JRF103+PTX组(43.22±13.62)MDSCs的比例下降，差异有统计学意义(control组vs PTX组p＝0.0263，control组vsJRF103+PTX组p＝0.0026)。与PTX组相比，JRF103+PTX组MDSCs比例下降，但无统计学差异(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.0975)。故而认为在SKOV3腹腔瘤模型中，JRF103联用紫杉醇能降低MDSCs比例，起抗肿瘤作用。
在肿瘤微环境中，树突状细胞(Dendritic cells，DCs)起抗原呈递作用。吞噬肿瘤细胞后DCs激活T细胞，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。用流式细胞术检测了各治疗组树突状细胞(Dendritic，DCs)的比例，结果显示，在SKOV3腹腔瘤模型中，如图26所示，药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行DCs染色(CD45+CD11b+F4/80+CD206+)，并进行流式分析。
与control组(1.122±0.3809)相比，vehicle(1.774±0.5262)组DCs的比例(％)未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.055)。与control组相比，JRF103组(4.053±1.862)、PTX组(3.850±0.5747)、JRF103+PTX(3.543±1.074)组DCs的比例上升，差异有统计学意义(control组vs JRF103组p＝0.0102，，control组vs PTX组p＜0.0001，control组vs JRF103+PTX组p＝0.0021)。与PTX组相比，JRF103+PTX组DCs比例未见明显变化(PTX组vsJRF103+PTX组p＝0.5964)。故而说明，在SKOV3腹腔瘤模型中，JRF103组、紫杉醇单药组、联用组均能升高DCs的比例，其可能为药物抗肿瘤作用的机制之一。
用流式细胞术检测了各治疗组中有免疫负向调节功能的中性粒细胞(neutrophils)的比例(％)，结果显示，在SKOV3腹腔瘤模型中，如图27所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行中性粒细胞染色(CD45+CD11b+Ly6G+)，并进行流式分析。
与control组(68.50±12.32)相比，vehicle组(68.44±5.231)中性粒细胞比例未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.992)；JRF103组(50.61±4.993)、PTX组(54.75±6.802)中性粒细胞的比例下降，但无统计学差异(control组vs JRF103组p＝0.0579，control组vs PTX组p＝0.0874)。与control组相比，JRF103+PTX组(28.96±11.97)中性粒细胞的比例下降，差异有统计学意义(control组vs JRF103+PTX组p＝0.0009)。与PTX组相比，JRF103+PTX组中性粒细胞比例下降，差异有统计学意义(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.0066)。因此，JRF103联合紫杉醇使SKOV3腹腔瘤模型中中性粒细胞降低可能是其产生协同抗肿瘤效果的机制之一。
用流式细胞术检测了各治疗组中有免疫抑制作用的单核细胞(monocytes)的比例(％)，结果显示，在SKOV3腹腔瘤模型中，如图28所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行单核细胞染色(CD45+CD11b+Ly6C+)，并进行流式分析。
与control组(3.328±1.486)相比，vehicle组(3.373±1.605)、JRF103组(2.838±1.396)、PTX组(7.066±3.428)、JRF103+PTX组(4.570±2.171)单核细胞的比例未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.9689，control组vs JRF103组p＝0.6056，control组vsPTX组p＝0.0556，control组vs JRF103+PTX组p＝0.3219)。与PTX组相比，JRF103+PTX组单核细胞比例未见明显变化(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.2062)。因此，在SKOV3腹腔瘤模型中，JRF103对单核细胞比例无明显影响。
在A2780s腹腔瘤模型中，治疗后M2型巨噬细胞比例的变化如图29所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行M2型巨噬细胞染色(CD45+CD11b+F4/80+CD206+)，并进行流式分析。
与control组(70.24±14.53)相比，vehicle组(77.61±8.868)、JRF103组(81.15±5.810)、PTX组(63.28±22.57)、JRF103+PTX组(59.67±11.26)M2型巨噬细胞的比例(％)未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.3609，control组vs JRF103组p＝0.1574，control组vs PTX组p＝0.5781，control组vs JRF103+PTX组p＝0.2346)。证明与紫杉醇组相比，JRF103联合紫杉醇对A2780s腹腔瘤模型中M2型巨噬细胞比例无影响。故而认为在A2780s卵巢癌腹腔瘤模型中，JRF103对M2型巨噬细胞的比例无影响。
同时用流式细胞术检测了A2780s腹腔瘤模型中各治疗组MDSCs的比例。结果如图30所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行MDSCs染色(CD45+CD11b+Gr-1+)，并进行流式分析。
与control组(9.010±4.407)相比，vehicle组(6.882±3.685)、JRF103组(5.636±3.678)、PTX组(4.332±2.471)、JRF103+PTX组(4.615±3.029)MDSCs的比例下降，但差异无统计学意义(control组vs vehicle组p＝0.4316，control组vs JRF103组p＝0.2252，control组vs PTX组p＝0.0722，control组vs JRF103+PTX组p＝0.1349)。可能因为组内差异较大，导致结果无统计学差异。与control组相比，JRF103联合紫杉醇对MDSCs比例无影响。
用流式细胞术检测了A2780s腹腔瘤模型中各治疗组DCs的比例(％)，结果显示图31，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行DCs染色(CD45+CD11b+F4/80-CD11c+)，并进行流式分析。
与control组(5.795±1.887)相比，vehicle组(8.265±5.090)、JRF103组(8.135±4.489)、PTX组(8.382±5.912)、JRF103+PTX组(3.744±1.628)DCs比例未见明显变化(control组vs vehicle组p＝0.3979，control组vs JRF103组p＝0.3736，control组vs PTX组p＝0.4330，control组vs JRF103+PTX组p＝0.1229)。且与PTX组相比，JRF103+PTX组DCs比例无明显变化(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.1292)。故而说明，在A2780s腹腔瘤模型中，JRF103对DCs的比例无明显影响。
用流式细胞术检测了A2780s腹腔瘤模型中各治疗组中有免疫负向调节功能的中性粒细胞的比例(％)，结果如图32所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行中性粒细胞染色(CD45+CD11b+Ly6G+)，并进行流式分析。
与control组(5.520±1.476)相比，vehicle组(4.442±0.9982)、JRF103组(4.810±2.497)、JRF103+PTX组(6.5±3.665)中性粒细胞的比例未见明显变化(control组vsvehicle组p＝0.2130，control组vs JRF103组p＝0.5991，control组vs JRF103+PTX组p＝0.5943)。但与control组相比，PTX组(3.652±1.032)中性粒细胞的比例下降，差异有统计学意义(control组vs PTX组p＝0.0490)。因此认为，在A2780s腹腔瘤模型中，JRF103联合紫杉醇对中性粒细胞比例无明显作用。
用流式细胞术检测了A2780s腹腔瘤模型中各治疗组中有免疫抑制作用的单核细胞的比例(％)，结果如图33所示，给药结束后处死裸鼠，每组随机取5只裸鼠的腹腔瘤进行单核细胞染色(CD45+CD11b+Ly6C+)，并进行流式分析。
与control组(11.61±3.674)相比，vehicle组(10.43±3.194)、JRF103组(9.710±5.917)、PTX组(12.03±7.399)和JRF103+PTX组(14.49±7.811)单核细胞的比例无明显变化(control组vs vehicle组p＝0.6032，control组vs JRF103组p＝0.5584，control组vsPTX组p＝0.9131，control组vs JRF103+PTX组p＝0.4779)。与PTX组相比，JRF103+PTX组单核细胞比例未见明显变化(PTX组vs JRF103+PTX组p＝0.6232)。故而认为在A2780s腹腔瘤模型中，JRF103联合紫杉醇对单核细胞的比例无明显影响。
6.2Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤组织中HER家族及其下游信号的活化
6.2.1Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤组织中HER家族蛋白磷酸化
为了探究在动物模型中JRF103联合紫杉醇是否能影响HER家族蛋白及其磷酸化蛋白的表达，我们用免疫组化技术检测卵巢癌腹腔瘤模型中各治疗组中p-HER1、p-HER2以及p-HER4的表达，结果如图所示(图34-36)，在卵巢癌(SKOV3)腹腔瘤模型中，给药停止后对肿瘤组织进行免疫组化染色，检测p-HER1、p-HER2或p-HER4的表达情况。其中棕色为p-HER1、p-HER2或p-HER4阳性表达，蓝色为阴性。放大倍数x20。
在SKOV3卵巢癌腹腔瘤模型中，与vehicle组相比，JRF103组p-HER1、p-HER2以及p-HER4的表达量降低。且与紫杉醇组相比，JRF103+PTX组p-HER1、p-HER2以及p-HER4的表达量降低。证明JRF103在卵巢癌中抑制p-HER1、p-HER2、p-HER4的表达，且JRF103联合紫杉醇对p-HER1、p-HER2、p-HER4的表达抑制作用更强。
6.3Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤细胞的增殖
为了了解JRF103在卵巢癌中对卵巢癌细胞增殖能力的影响，我们将卵巢癌SKOV3、A2780s腹腔瘤模型中各组的肿瘤进行了Ki67染色，结果如图37所示，在卵巢癌(SKOV3、A2780s)腹腔瘤模型中，给药停止后对肿瘤组织进行免疫组化染色，检测Ki67的表达情况。(A)SKOV3腹腔瘤模型中，各治疗组肿瘤组织中Ki67的免疫组化染色结果。(B)A2780s腹腔瘤模型中，各治疗组肿瘤组织中Ki67的免疫组化染色结果，其中棕色为Ki67阳性表达，蓝色为阴性。放大倍数x20。
在SKOV3、A2780s腹腔瘤模型中，与对照组相比，JRF103单药及紫杉醇单药均能抑制Ki67的表达，且JRF103联合紫杉醇对Ki67表达的抑制作用更明显。故而认为JRF103联合紫杉醇抑制肿瘤细胞的增殖。
实施例7.Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇在人卵巢癌腹腔瘤模型中的毒副作用
7.1Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇可引起裸鼠体重轻微降低
为了评估JRF103联合紫杉醇治疗的安全性，开始给药后，每3天测量裸鼠体重，结果如图38-39所示。在SKOV3卵巢癌腹腔瘤模型中，最后一次给药时，各组裸鼠体重分别为：control组13.99±1.087g，vehicle组14.12±2.061g，JRF103组13.74±1.133g，PTX组15.52±1.625g，JRF103+PTX组14.89±1.467g。与control组相比，vehicle组、JRF103组、JRF103+PTX组裸鼠体重未见明显变化(control组vs vehicle组，p＝0.8569；control组vsJRF103组，p＝0.6217；control组vs JRF103+PTX组，p＝0.1384)。但与control组相比，PTX组裸鼠体重下降，差异有统计学意义(p＝0.0247)。给药过程中发现，JRF103组、JRF103+PTX组裸鼠出现不同程度的腹泻，但一般情况尚可，未见其他异常。故而认为，JRF103联用紫杉醇在SKOV3卵巢癌模型中对裸鼠体重无明显作用。
在A2780s卵巢癌腹腔瘤模型中，最后一次给药时，各组裸鼠体重分别为：control组21.52±3.306g，vehicle组20.46±3.741g，JRF103组18.81±2.870g，PTX组18.14±1.466g，JRF103+PTX组16.23±2.390g。与control组相比，vehicle组裸鼠体重未见明显变化(control组vs vehicle组，p＝0.4712)。但与control组相比，JRF103组、PTX组以及JRF103+PTX组裸鼠体重下降，差异有统计学意义(control组vs JRF103组，p＝0.0436；control组vs PTX组，p＝0.0038；control组vs JRF103+PTX组，p＝0.0002)。在A2780s腹腔瘤模型中，后期因裸鼠肿瘤负荷逐渐加大，对照组裸鼠体重增加明显，故而给药组裸鼠体重相对下降。但与治疗前相比，治疗组裸鼠体重未见明显变化。给药过程中发现，JRF103以及JRF103联用紫杉醇组裸鼠出现不同程度的腹泻，但一般情况尚可，未见其他异常。故而认为，JRF103联合紫杉醇在A2780s卵巢癌腹腔瘤模型中使裸鼠体重降低。
7.2Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇对裸鼠无明显肝肾功能损伤
为了了解JRF103分别联合紫杉醇在卵巢癌模型中对裸鼠肝肾功能的影响，在治疗结束后我们在每组随机取5只裸鼠眼球血，离心后用血浆进行血生化检测。检测指标包括：ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶),ALB(白蛋白)、AMY(淀粉酶)、BILT(总胆红素)、BILD(直接胆红素)、CHO(总胆固醇)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、TP(总蛋白)、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、LDH(乳酸脱氢酶)、TG(甘油三酯)、GLU(葡萄糖)、UA(尿酸)、UREA(尿素)、CRE(肌酐)。结果如图40、41所示，JRF103联合紫杉醇在SKOV3、A2780s卵巢癌腹腔瘤模型中对裸鼠肝肾功能几乎无影响。
7.3Pan-HER抑制剂JRF103联合紫杉醇对裸鼠重要脏器无明显损害
为了探索JRF103联合紫杉醇对裸鼠重要脏器组织形态的损害，在治疗结束之后，每组随机取3只裸鼠，进行心、肝、脾、肺、肾等重要脏器的H&E染色。结果如图42-43所示，在SKOV3、A2780s卵巢癌腹腔瘤模型中，各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾未见明显结果改变，放大倍数：x20，证明JRF103联合紫杉醇对裸鼠无明显毒副作用。
Claims (10)
1.Pan-HER抑制剂在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物满足以下至少一项：
所述药物抑制卵巢癌细胞的增殖和/或集落形成；
所述的药物促进卵巢癌细胞凋亡，引起凋亡相关蛋白表达量变化；
所述的药物诱导卵巢癌细胞停滞于G1期，和/或抑制卵巢癌细胞迁移；
所述的药物抑制卵巢癌细胞HER家族相关蛋白的磷酸化及其下游相关蛋白STAT3、AKT、ERK的活化。
3.Pan-HER抑制剂与卵巢癌化疗药的组合物在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征是：所述组合物是分别或同时给药的Pan-HER抑制剂与卵巢癌化疗药联合用药物。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征是：所述化疗药物包括：蔥环类药物、抗代谢类药物、抗有丝分裂药物、拓扑异构酶抑制剂、铂类药物、烷化剂；进一步地，所述化疗药包括：环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、地塞米松、顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨中至少一种；优选地，所述化疗药物为紫杉醇。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征是：所述药物抑制卵巢癌细胞集落形成，诱导卵巢癌细胞凋亡，抑制卵巢癌细胞迁移。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征是：所述药物降低M2型巨噬细胞、MDSCs、中性粒细胞的比例。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征是：所述药物使DCs比例升高，增强免疫。
9.根据权利要求1-8任一项所述的用途，其特征是：所述的药物是以Pan-HER抑制剂或Pan-HER抑制剂与化疗药的组合物作为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂；进一步地，所述的制剂为口服制剂、鼻腔给药制剂或注射制剂。
10.根据权利要求1-8任一项所述的用途，其特征是：所述Pan-HER抑制剂为式I所示化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，
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