CN102269766B - 人类基因fam96a及其蛋白质的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测FAM96A-vl蛋白质表达的试剂在制备检测乳腺癌的检测剂中的应用，检测FAM96A蛋白质表达的试剂在制备检测上皮来源肿瘤预后的检测剂中的应用。也公开了FAM96A-vl基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备用于治疗乳腺癌的药物中的应用，及FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备用于抑制细胞发生上皮-间质变迁的药物中的应用。

Description

人类基因FAM96A及其蛋白质的应用

技术领域

本发明涉及人类基因FAM96A及其蛋白质的应用。

背景技术

人类基因FAM96A(family with sequence similarity 96，memberA)，又名FLJ22875，人类FAM96A染色体定位于15q22.31。FAM96A基因拥有5个外显子和4个内含子，形成两个可变剪接体NM_032231.4(下称FAM96A-v1)和NM_001014812.1(下称FAM96A-v2)，二者均有核心结构域一功能未知结构域59(DUF59)，剪接符合GT-AG规律。

FAM96A-v1拥有该基因的全部外显子。其mRNA全长为1108bp，翻译起始密码子ATG位于第一外显子中段，mRNA的第241-243位。开放读码框架ORF全长483bp，编码160个氨基酸(NP_115607)。Uniprot数据库提示，全长形式V1在蛋白水平明确存在。FAM96A-v1mRNA序列及其蛋白质序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

FAM96A-V2，起始密码子ATG与FAM96A-v1一致，较FAM96A-v1仅缺失第3外显子，由2-4外显子连接导致蛋白质翻译在第4外显子提前终止。ORF全长309bp，编码102个氨基酸(NP_001014812)。FAM96A-v2mRNA序列及其蛋白质序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

美国国立生物技术信息中心(NCBI)Genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)用于获取及分析上述FAM96A genomicDNA、mRNA和cDNA序列和蛋白质序列。

但，作为较早发现，并且命名基因，FAM96A并未进行过系统性功能研究与分析。迄今为止，在Pubmed数据库中，检索不到关于该基因的任何系统性功能研究报道。正是在这样的背景下，我们着手研究了FAM96A的功能及其应用。

另外，上皮-间质变迁(EMT)现象在1982年由已故奥地利女科学家ElizabethHay在角膜上皮细胞三维培养中发现首先发现并系统阐述(Jiri Zavadil et al.，“Epithelial-mesenchymal transition，”Cancer Research 68，no.23(December 1，2008)：9574-9577)。人们亲昵地称这位令人尊敬的前辈Betty Hay。此后20余年的系统性研究中，EMT现象在胚胎发育、纤维化疾病及肿瘤发生与发展中的重要而广泛的作用，经过无数科学家的努力和论证，逐渐由争议走向共识。可以毫不夸张的说，EMT研究领域已经成为生命科学领域最引人瞩目和炙手可热的研究焦点之一。

上皮-间质变迁是多重胞内、胞外因素诱发并调控的一系列复杂而影响深远的变化。简而言之，就是在分子水平上皮细胞通过多种因素上调一个或多个EMT核心转录因子(如TWIST1、SNAI1、ZEB1、ZEB2、TCF3-E47、Goosecoid、FOXC2等)或改变核心转录因子的功能状态(如β-连环蛋白(β-Catenin)的核转位)，这些转录因子一方面直接或间接上调间质细胞特征性分子的表达(如波形蛋白、α-SMA、S100A4、CDH2等)，另一方面抑制上皮细胞特征性分子的表达(如CDH1、KRT18、TJP-1/ZO-1、桥粒蛋白(Desmoplakin)、MUC1等)；同时通过RhoA、Racl、Cdc42等Rho家族激酶重塑细胞微丝，使细胞骨架由上皮细胞特征性的皮质(Cortical)细胞骨架转变为间质细胞特有的应力纤维样(Stress-Fiber Like)细胞骨架。这一系列分子水平的事件，使得细胞由原本上皮细胞的卵石样(Pebble-Like)形态转变为成纤维细胞样的梭形，同时失去原有的极性和粘附特性。最终由相对静止和稳定的典型上皮细胞转变为具有强大侵袭和运动能力的间质样细胞(MarcelloGuarino，“Epithelial-mesenchymal transition and tumour invasion，”The InternationalJournal ofBiochemistry & Cell Biology 39，no.12(2007)：2153-2160)。

EMT现象有着重要的生理与病理学意义。在发育生物学领域，其对中胚层的发生和神经管、心脏瓣膜、继发腭的形成有至关重要的作用。其也参与了炎症、愈合过程和纤维化疾病的发生与发展(Jonathan M Lee et al.，“Theepithelial-mesenchymal transition：new insights in signaling，development，and disease，”The Journal of Cell Biology 172，no.7(March 27，2006)：973-981)。

最为引人瞩目的是EMT在肿瘤发生、恶变和转移中的重要作用。既往的研究主要集中在EMT与肿瘤转移的关系上。相当多的证据证实，肿瘤细胞一旦具有EMT的能力与特征，其侵袭与转移能力将大大增加；多中心研究实验与临床调查也提示，EMT核心转录因子的显著上调和/或核心转录因子相关microRNA异常的病人，其远期预后很差(Sohail F Tavazoie et al.，“Endogenous human microRNAs that suppressbreast cancer metastasis，”Nature 451，no.7175(January 10，2008)：147-152和KorneliaPolyak and Robert A Weinberg，“Transitions between epithelial and mesenchymal states：acquisition of malignant and stem cell traits，”Nature Reviews.Cancer 9，no.4(April 2009)：265-273)。这些证据都明确都肯定了EMT是肿瘤恶变、转移的充分条件。但是研究人员对于EMT是否是肿瘤转移的必要条件既往存在着争议。但随着近来EMT和肿瘤干细胞的关系、癌巢侵袭缘显著的EMT特征、以及EMT与肿瘤多效耐药的关系、EMT与肿瘤免疫逃逸的联系逐渐被发现与阐明，学术界开始形成共识：EMT现象非但在肿瘤转移过程中发挥着核心环节的作用，其对于肿瘤的发生、发展与治疗也有着十分重要的意义。

进一步，众所周知，CDH1是介导上皮细胞之间形成粘合连接(Adherent Junction)的核心分子，并且参与与粘附-运动相关的一系列生理过程并伴有极为复杂的信号转导机制(G Berx and F Van Roy，“The E-cadherin/catenin complex：an importantgatekeeper in breast cancer tumorigenesis and malignant progression，”Breast CancerResearch：BCR 3，no.5(2001)：289-293)。在发育生物学领域，上皮-间质变迁(EMT)直接参与了神经管的发育过程，期间CDH1下调且为CDH2(N-Cadherin)替代对于粘合带收缩使得原外胚层上皮内卷形成正确的管状结构具有极为重要的意义(Jing Yang and Robert A Weinberg，“Epithelial-mesenchymal transition：at thecrossroads of development and tumor metastasis，”Developmental Cell 14，no.6(June2008)：818-829)。此外，CDH1还是一个典型的抑癌基因，其表达水平与功能状态与上皮来源的肿瘤预后程度息息相关(G Berx and F Van Roy，“The E-cadherin/catenincomplex：an important gatekeeper in breast cancer tumorigenesis and malignantprogression，”Breast Cancer Research：BCR 3，no.5(2001)：289-293)。

近期肿瘤生物学领域已发表的多篇高水平学术论文均使用肺腺癌细胞系A549作为EMT现象的研究模型(Ke-Hua Zhang et al.，“Ferritin Heavy Chain-Mediated IronHomeostasis and Subsequent Increased Reactive Oxygen Species Production Are Essentialfor Epithelial-Mesenchymal Transition，”Cancer Research(June 16，2009)；Jian Shi et al.，“Insulin Receptor Substrate-1Suppresses Transforming Growth Factor-{beta}1-MediatedEpithelial-Mesenchymal Transition，”Cancer Research(September 8，2009)；Roy-AkiraSaito et al.，“Thyroid transcription factor-1inhibits transforming  growthfactor-beta-mediated epithelial-to-mesenchymal transition in lung adenocarcinoma cells，”Cancer Research 69，no.7(April 1，2009)：2783-2791.)。相比于来自于正常细胞的MDCK与NMuMG细胞系，以A549作为研究模型对于肿瘤EMT现象的研究有着特别的意义。我们使用A549和CDH1功能同样完整，恶性程度相对较低且上皮特征明显的MCF7细胞进行后续研究。

发明内容

本发明的目的是提供检测FAM96A-v1蛋白质表达的试剂在制备检测乳腺癌的检测剂中的应用。

本发明的目的是提供FAM96A-v1蛋白质的单克隆或多克隆抗体在制备检测乳腺癌的检测剂中的应用。

本发明的另一目的是提供FAM96A-v1基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备用于治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供检测FAM96A蛋白质表达的试剂在制备检测上皮来源肿瘤预后的检测剂中的应用。所述的上皮来源肿瘤是人类食管癌和人类肺腺癌。

本发明的另一目的是提供FAM96A蛋白质的单克隆或多克隆抗体在制备检测上皮来源肿瘤预后的检测剂中的应用。

本发明的另一目的是提供FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备用于抑制细胞发生上皮-间质变迁的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备抑制上皮来源肿瘤细胞的迁移与侵袭的药物中的应用。其中所述的上皮来源肿瘤是人类食管癌、人类肺腺癌和人类乳腺癌。

本发明的另一目的是提供检测FAM96A蛋白质表达的试剂在制备检测多器官纤维化或硬化疾病中分级诊断及预后判断的检测剂中的应用。

本发明的另一目的是提供FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备治疗多种器官纤维化或硬化疾病的药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明人利用能够识别FAM96A-v1的抗体进行免疫组化实验证明：与癌旁/正常组织对照相比，约半数以上的乳腺癌病例FAM96A的表达水平显著降低；乳腺癌组织FAM96A表达强度与癌旁、正常组织对照存在显著性差异(p＝0.04)；FAM96A入核水平的降低对与乳腺癌的发生与发展有极其重要意义。在我们观察的19例病例中，肿瘤灶细胞核内FAM96A水平显著低于癌旁-正常组织对照(p＝2.62*10^-6)；Finak侵袭性乳腺癌基因芯片数据提示，侵袭性乳腺癌FAM96A表达水平显著降低。即，乳腺癌的发生与FAM96A-v1蛋白表达量有统计学上的显著相关性。因此，检测FAM96A-v1蛋白质表达的试剂可以用于制备检测乳腺癌的检测剂中。进一步，本发明的FAM96A-v1蛋白质的单克隆和多克隆抗体可以用于制备检测乳腺癌的检测剂中。进一步可知，FAM96A-v1蛋白质可以用于制备用于治疗乳腺癌的药物；促使FAM96A-v1基因正常表达或超表达的激动剂可以用于制备治疗乳腺癌的药物。

我们通过实验也发现，人类新基因FAM96A的下调可以显著改变上皮细胞的形态，究其本质，是发生了上皮-间质变迁(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)。因此，FAM96A基因所表达的蛋白质或该促使基因正常表达或超表达的激动剂可以用于制备抑制细胞发生上皮-间质变迁的药物中。并且检测FAM96A蛋白质表达的试剂可以用于制备检测上皮来源肿瘤预后的检测剂中。进一步，FAM96A蛋白质的单克隆或多克隆抗体可以用于制备检测上皮来源肿瘤预后的检测剂中。

本发明的有益效果是：检测FAM96A或FAM96A-v1蛋白质表达的试剂，如该蛋白质的单克隆或多克隆抗体应用于乳腺癌及上皮来源肿瘤预后的检测剂中，用于检测乳腺癌及判断上皮来源肿瘤预后。并且FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂用于抑制细胞发生上皮-间质变迁的药物中。FAM96A-v1蛋白质用于制备用于治疗乳腺癌的药物中；促使FAM96A-v1基因正常表达或超表达的激动剂用于制备治疗乳腺癌的药物中。

为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施方式对本发明进行详细的说明。需要说明的是，所述的实施例仅仅是示例本发明的目的，而不应该理解为对本发明的任何限制。

附图说明

图1是兔抗FAM96A多克隆抗体的鉴定，所示为免疫印迹实验结果。其中1-6号条带分别表示：1.免疫前AA2#兔血清对照1∶10002；免疫后AA2#兔血清1∶1000；3.免疫前AB2#兔血清对照1∶1000；4.免疫后AB2#兔血清1∶1000；5.过表达pcDBHEK293T裂解液；6.过表达FAM96A-v1HEK293T细胞裂解液。

图2是纯化兔抗FAM96A多克隆抗体PAGE电泳图。

图3是纯化后FAM96A多克隆抗体用于免疫印迹实验的图。其中1-6号条带分别表示：1.野生型HUVEC细胞裂解液；2.转染FAM96A-V1-Myc-His₆(25kD)HeLa细胞裂解液；3.转染FAM96A-V1-Myc-His₆HeLa细胞裂解液；4.转染pcDB HeLa细胞裂解液；5.转染FAM96A-V1(18.4kD)HepG2细胞裂解液；6.转染pcDB HepG2细胞裂解液；↑：向上箭头标注的为内源性FAM96A-V1条带。

图4是肿瘤组织FAM96A免疫组化分析结果图，Bar＝25uM。其中：(A)胃癌组织：兔IgG同型对照；(B)胃癌组织：AA2#pAb 1∶120；(C)肾透明细胞癌：兔IgG同型对照；(D)肾透明细胞癌：AA2#pAb 1∶120。

图5是HeLa细胞间接免疫荧光染色的结果图。其中(A)AB2#pAb 1∶100；(D)AA2#pAb 1∶100；(G)兔IgG同型对照；(B)-(E)-(H)细胞核DAPI染色；(C)-(F)-(I)共聚焦叠加图像。

图6是组织芯片组化染色整体染色强度统计分析的结果图。

图7是乳腺癌组织芯片组化染色细胞核着色分析的结果图。

图8是FAM96A-AB2#pAb乳腺癌组织芯片免疫组化示例的图示：其中(A/B/C)同一病例免疫组化染色，显示总体染色强度差异；(D/E)另一病例免疫组化染色，显示整体染色强度差异不大，肿瘤核特异低染；(A)肿瘤灶低着色；(B)癌旁深染色；(C)远隔正常组织深染色；D)肿瘤灶，胞质深染，核低染；(E)远隔正常组织，核深染。

图9是pEGFP-N1-FAM96A-v1siRNA共转染验证实验的结果图。

图10是FAM96A siRNA RT-PCR验证实验的结果图。

图11是沉默FAM96A诱导A549细胞发生形态学改变的结果图。

图12是沉默FAM96A诱导A549细胞发生形态学改变的结果图。

图13是沉默FAM96A改变H1299(A)、MCF7(B)细胞铺展面积的图示。

图14是沉默FAM96A改变A549细胞CDH1分布与功能状态的图示。

图15A和图15B是沉默FAM96A改变MCF7CDH1分布(图15A)与细胞连接方式(图15B)的图示。

图16是沉默FAM96A诱导A549细胞骨架变化的图示。

图17是沉默FAM96A诱导MCF7细胞骨架的图示。

图18是半定量RT-PCR验证敲减FAM96A EMT相关分子表达情况的结果图。

图19是敲减FAM96A显著增加A549细胞核异型率的结果图。

图20是FAM96A shRNA有效性验证的结果图。

图21是半定量RT-PCR鉴定FAM96A-shRNA稳定转染A549细胞克隆的结果图。

图22是FAM96-shRNAA549稳定转染株的相差显微镜照片的结果图。其中(A)Ctrl CL.B、(B)Ctrl CL.C、(C)Ctrl CL.E、(D)sh3CL.A、(E)sh3CL.C、(F)sh3CL.E、(G)sh4CL.C、(H)sh4CL.D。

图23是FAM96A-shRNAA549稳定转染株EMT标志基因半定量RT-PCR分析。

图24是FAM96A-shRNAA549稳定转染细胞株的划痕试验。

图25是FAM96A-shRNA A549稳定转染细胞株划痕后33H示意细胞迁移方式。

图26是sV1-Myc-His₆蛋白纯化的图。(A)PAGE电泳，考马斯蓝检测纯化后sV1-Myc-His₆蛋白纯度；(B)His-Tag抗体免疫印迹检测sV1-Myc-His₆，条带1是sV1-Myc-His6，条带3是36ng sVSTM1阳性对照。

图27是纳克级sV1-Myc-His₆显著拮抗TGF-B1对FN1的上调的图示。

具体实施方式

本发明所使用的材料与方法如下：

1.1生物信息学分析

美国国立生物技术信息中心(NCBI)Genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)用于获取及分析FAM96A基因组DNA、mRNA及cDNA序列。NCBI Map Viewer程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)用于获取不同种属(小鼠、大鼠、人类)FAM96A基因染色体定位及相关信息。FAM96A蛋白质序列及相关功能结构域分析使用UniprotKB蛋白质信息数据库(http://www.uniprot.org/)、NCBI CDD数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)。其它蛋白相关分析与预测使用ExPASy在线程序集(http://us.expasy.org/)，主要包括：TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/用于蛋白质穿膜区预测；Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于经典分泌蛋白信号肽预测；WoLFPSORT(http://wolfpsort.org/)、LOCTree(http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/loctree/query)用于亚细胞定位预测；PredictNLS(http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl)、NucPred(www.sbc.su.se/～maccallr/nucpred/)用于核定位信号预测；Pfam 24.0(http://pfam.sanger.ac.uk/)、Simple Modular Architecture Research Tool(http://smart.embl-heidelberg.de/)用于结构域预测分析；ELM数据库(http://elm.eu.org/)和Minimotif数据库(http://mnm.engr.uconn.edu/)用于模体分析预测；GNF SymAtlas(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/)、BioGPS(http://biogps.gnf.org/)数据库用于表达谱分析。EMBL-EBI ArrayExpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/)用于芯片表达分析；哈佛大学PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES抗原肽在线预测程序(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)及DNAstar软件包用于分析蛋白质抗原性、亲疏水性、表面暴露性等。

1.2主要试剂、仪器

限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶-快速连接试剂盒(Fast Ligation Kit V2.0)购自TaKaRa公司和碱性磷酸酶CIAP购自Promega公司。质粒提取试剂盒购自Axygen公司、Qiagen公司及优晶公司。PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒均购自Vigorous公司。

TRI Reagent及TRIzol^TM试剂购自Ambion公司和Invitrogen公司；RevertAid^TMcDNA第一链合成试剂盒(Cat.#K1622)购自Fermentas公司；Taq耐热DNA聚合酶；Pfu保真耐热DNA聚合酶购自北京博迈德公司；LA Taq^TM耐热保真DNA聚合酶、DNA Ladder 2K购自TaKaRa公司；PCR反应引物由北京奥科生物、北京三博远志生物公司和上海生工公司合成。

组织芯片购自陕西超英公司。DAKO cytomation Envision+TM System HRP免疫组化试剂盒为Dako公司产品。

正常组织和免疫系统组织cDNA文库购自Clontech公司。

重组人表皮生长因子rhEGF购自PEPROTECH公司；重组人转化生长因子rhTGF-β1(Cat.240-B)购自R&D公司。

10-ounce玻璃爬片购自美国VWR公司；L-多聚赖氨酸购(30-70kD)自Sigma公司；四甲基罗丹明标记鬼笔环肽(TRITC conjugated-phalloidin)购自Invitrogen公司；DAPI购自日本和光纯药公司。

Fibronectin1单克隆抗体(Cat.F0916)、c-myc标签单克隆抗体(Cat.M 5546)、ACTB单克隆抗体(Cat.A 5316)为Sigma公司产品；TJP1/ZO-1单克隆抗体(Cat.339100)购自Invitrogen公司；CDH1/E-Cadherin单克隆抗体(Cat.610181)、β-Catenin单克隆抗体(Cat.610153)购自BD公司；GAPDH单克隆抗体、TRITC及DyLight488标记荧光二抗购自中杉金桥公司。免疫印迹实验所有IRDye^TM偶联的荧光二抗购自Rockland公司。

复合蛋白酶抑制剂Cocktail购自Roche公司。BCA蛋白质定量试剂盒为Pierce公司产品。硝酸纤维素膜(NC膜)购自Amersham-Pharmacia biotech公司。

ABI 9700型、2700型和2400型PCR扩增仪，美国ABI公司

T-Gradient Thermoblock PCR仪，德国Biometra公司

PTC-100、PTC-200Thermo-Cycler PCR仪，美国MJ Research公司

Polystat恒温水浴箱，美国Cole Parmer公司

恒温制冷水浴箱，北京博医康技术公司

EL-311SX ELISA Reader，美国Bio-TEK公司

垂直蛋白电泳装置，美国Bio-Rad公司，Tanon公司

蛋白质湿式电转移装置，美国Bio-Rad公司，Tanon公司

Infrared Imager，美国LI-COR Bioscience公司

倒置相差/荧光显微镜，日本Olympus公司

SP2、SP5激光共聚焦荧光显微镜，德国Leica公司

BTX电穿孔仪，美国BTX公司

Beckman GS-15R离心机，美国Beckman公司

Beckman UV-640分光光度计，美国Beckman公司

GENE Snap凝胶成像系统，日本Olympus公司

AUTO FLOW CO2Water-Jacketed Incubator，美国NUAIRE公司

UV交联仪美国Upland公司

恒温CO2细胞培养箱，Heraeus及日本SANYO公司

1.3质粒载体、siRNA、shRNA质粒及E.coli菌株

T载体pGEM-Teasy购自Promega公司；T载体pMD-18T购自TaKaRa公司；原核表达载体pGEX-4T-2购自GE Health公司。绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1、pEGFP-C3、pDsRed2-N1购自Clontech公司；真核表达载体pcDNA3.1-Myc-his(-)B(以下简称pcDB)购自Invitrogen公司。

FAM96A小干扰RNA(siRNA)由上海吉玛公司设计并化学合成，经HPLC纯化，具体核苷酸序列如下：

非沉默的对照(下称siRNA-Ctrl)：

正义链：SEQIDNo.：5

反义链：SEQ IDNo.：6

siRNA-FAM96A位点22#(下称si22)：

正义链：SEQIDNo.：7

反义链：SEQIDNo.：8

siRNA-FAM96A位点107#(下称si107)：

正义链：SEQIDNo.：9

反义链：SEQIDNo.：10

siRNA-FAM96A位点132#(下称si132)：

正义链：SEQIDNo.：11

反义链：SEQIDNo.：12

TR30015scrambled negative control non-effective shRNA(下称shRNA-ctrl)及对应HuShTM 29mer shRNA Constructs against FAM96A inpRFP-C-RS(CatalogNo：TF313072)shRNA系列表达载体购自美国ORIGENE公司。具体干扰序列如下：

shRNA#1(下称sh1)：SEQ ID No.：13

shRNA#2(下称sh2)：SEQ ID No.：14

shRNA#3(下称sh3)：SEQ ID No.：15

shRNA#4(下称sh4)：SEQ ID No.：16

FAM96A-pZeroT质粒购自宝赛公司。

大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞购自北京全式金公司；大肠杆菌DH10B、JM109感受态细胞购自北京博迈德公司；大肠杆菌BL21菌株购自天津天有利科技有限公司。

1.4FAM96A表达质粒的构建

FAM96A-pEGFP-N1、FAM96A-pcDB和FAM96A-Myc-His6(pcDB)真核细胞表达质粒的构建(表1)：以FAM96A-pZERO T为模板进行PCR扩增，引物5’端添加所需限制酶识别位点(表1)；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，与纯化后质粒载体经对应限制性核酸内切酶消化；酶切产物经酚-氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue或JM109，挑取菌落经PCR初步鉴定筛选克隆，经测序验证准确无误。

表1FAM96A表达质粒构建所用引物

附注：FAM96A-V1-pGEX-4T-2FP自第28位氨基酸(预测信号肽切割位点)起始

1.5质粒抽提与纯化

实验用质粒由Qiagen Maxiprep 500纯化柱制备，过程简述如下：待纯化质粒转化大肠杆菌XL1-Blue后涂至相应抗性的细菌培养皿上，14-16小时后挑单细菌菌落于1ml抗性培养基中，37℃摇床(300转/分钟)培养8小时，扩大培养体系至100ml，继续培养14-16小时；6,000g离心10分钟收获细菌，加入10ml P1(含0.5mg/mlRNase)，充分重悬后加入10ml P2，轻柔翻转3-4次，液体澄清后加入10ml 4℃预冷的P3，轻柔翻转3-4次，冰浴10分钟后20,000g离心15分钟；用15ml QBT预先平衡Qiagen纯化柱，将离心上清经滤纸过滤后上柱，用30ml QC洗涤纯化柱，重复1次；加入10ml QF洗脱质粒，重复1次，在洗脱液中加入12ml异丙醇，翻转充分混匀后4℃离心30分钟；弃上清，加入70％乙醇洗涤，离心15分钟；弃上清，空气干燥10分钟后加入400μl的超纯水，待沉淀完全溶解后移入EP管；紫外分光光度计定量，调整浓度为1μg/μl，并进行琼脂糖凝胶电泳检测质量，高速离心除菌并分装备用。Axygen试剂盒提纯质粒与前述类似，但是按照说明书要求省略异丙醇沉淀步骤。

1.6细胞培养与转染

胎牛血清为Biochrom及Hyclone公司产品。RPMI1640及DMEM、Opti-MEM-I培养基，G418抗生素均购自Gibco公司。嘌呤霉素盐酸盐(Puromycin-Di-HCl)购自Amresco公司。

人类脐静脉内皮细胞系HUVEC、人胚肾脏细胞系HEK293T；人宫颈癌细胞系HeLa、人类乳腺癌细胞系MCF7[ATCC HTB-22]、MDA-MB-231[ATCC HTB-26]；人类结肠癌细胞系HT29、人类肺腺癌细胞系A549、人类肺癌细胞系H1299、人类肝癌细胞系HepG2；人类胰腺癌细胞系：MIA PaCa-2[ATCC CRL-1420]、PANC-1[ATCC CRL-1469]、Bx-PC3[ATCC CRL-1687]；人类前列腺癌细胞系：PC3及其高转移亚株PC3M、DU145、LNCap；人类食管癌细胞系TE-1、人类胃癌细胞系AGS；人类胃癌细胞系SGC7901、MGC803均商购得到。

阳离子转染试剂VigoFect购于北京威格拉斯公司，脂质体转染试剂Lipofectamine2K购于Invitrogen公司。

HeLa、HepG2、MDA-MB-231细胞采用电击穿孔转染法，操作步骤如下：

(1)细胞培养：将HeLa细胞用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s modifiedEagle′s medium)培养基(Gibco)以4.0×10⁵个/10mm平皿传代，在5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。

(2)转染：胰酶消化HeLa细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗细胞2遍，调整细胞浓度为1-5×10⁶/ml，取细胞300μl/样品，加10μg DNA，混匀后移入2mm电转杯，电击条件HeLa 120V/MDA-MB-231&HepG2130V，20ms；使用相同总量的pEGFP-N1质粒表达绿色荧光蛋白以监测转染效率。转染后室温放置10分钟，吸出并重悬于2-5ml含10％胎牛血清的DMEM培养基中，铺于对应细胞培养板，6-8小时细胞贴壁后更换新鲜的培养基。转染24小时后于荧光显微镜下检测pEGFP-N1孔的转染效率。

HEK293细胞采用VigoFect阳离子试剂转染，操作步骤简述如下：

A液：实验组及对照组质粒按照按说明书使用对应剂量生理盐水稀释；使用相同总量的pEGFP-N1质粒表达绿色荧光蛋白以检测转染效率。

B液：VigoFect阳离子转染试剂按转染规模要求以生理盐水稀释，轻柔混匀，室温静置5分钟。

将B液缓慢逐滴加入到A液中，混匀，室温静置15分钟。按转染规模对应剂量逐滴加入培养体系中。细胞置于37℃，5％CO₂孵箱培养。转染24小时后于荧光显微镜下检测pEGFP-N 1孔的转染效率。

A549/H1299/MCF7/TE-1细胞采用Lipofectamine 2K试剂转染，操作步骤简述如下：

转染试剂Lipofectamine^TM2K与待转染的质粒或siRNA首先分别加入Opti-MEM中并混匀，室温孵育5分钟。然后将上述含Lipofectamine^TM 2K与待转染的质粒或siRNA的Opti-MEMI混匀，室温孵育20分钟，使质粒或siRNA与Lipofectamine^TM2K充分结合。最后，将上述复合物均匀加入细胞培养基中。细胞置于37℃，5％CO₂孵箱培养，5-6小时后，更换新鲜培养基次。转染试剂Lipofectamine^TM2K与待转染的质粒或siRNA之间的比例参考Invitrogen公司提供的说明。

A549稳定转染株构建同样采用前述方法转染，转染后24小时按照1∶8-1∶15比例进行细胞传代，等量野生型细胞平行传代；传代24小时后根据质粒抗性分别加入含G418抗生素(1000ug/ml)或嘌呤霉素(当量1.5ug/ml)的抗性培养基进行筛选。G418实验组野生型细胞于加入抗生素第11日全部死亡，其后常规传代扩增混合克隆稳定株，G418维持浓度1000ug/ml；嘌呤霉素实验组野生型细胞于加入抗生素后第5日全部死亡，转染后第10日，用有限稀释法选取单细胞克隆，即胰酶消化后计数细胞，按(单细胞：100ul培养基)比例稀释，接种入96孔板，1日后镜检确认单细胞克隆，选取不同单克隆正常传代扩增，嘌呤霉素当量维持浓度1.0ug/ml。

1.7间接免疫荧光染色与相差显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察

相差显微镜摄像由常规培养细胞经Olympus荧光显微镜相差镜头拍摄照片，至少3个随机视野图像分析由Image J软件完成。

免疫荧光实验组细胞在24孔板内接种于L-多聚赖氨酸包被玻璃爬片，包被浓度5ug/ml。于对应时间点收取细胞爬片，4％多聚甲醛室温固定15min，冰冷PBS清洗2次；用含0.1％TritonX-100室温通透10min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；用含1％BSA OR山羊封闭血清的PBST室温封闭30min；用前述封闭液稀释的一抗室温结合1小时或在保湿盒内4℃过夜，冰冷PBS清洗5min，重复3次；用前述封闭液稀释的TRITC/Dylight488标记二抗避光室温结合45-60min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；0.2ug/ml DAPI做计数避光染色5-10min，冰冷PBS清洗5min，重复3次；用PBS稀释的90％丙三醇封片。由Olympus荧光显微镜及Leica SP2/SP5激光共聚焦显微镜观察、摄像。前述IIF实验步骤参考Abcam公司和Santa Cruz公司实验资料。

1.8逆转录PCR反应(RT-PCR)

TRIzol^TM试剂提取细胞总RNA：。收获对数生长期的细胞，在12孔板内加入400ulTRIzol^TM试剂，反复吹打辅助破碎细胞，转移到1.5ml无RNase的离心管中；室温静置5分钟，加入80ul氯仿，振荡混匀15秒，室温静置2-3分钟后，于4℃12000g离心15分钟，收集上层水相；加入200μl异丙醇沉淀RNA，室温静置10分钟，12000g离心10分钟后，弃尽上清；400ul 75％乙醇洗盐后，7500g离心5分钟，弃尽上清，室温干燥后，溶于DEPC处理的H₂O中，58-60℃温育10分钟，混匀后取小样，分光光度计定量后用于逆转录。

逆转录反应合成cDNA第一链。利用RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链。首先配制逆转录反应体系：取提纯的总RNA 1-5ug，加入Oligo(dT)₁₈引物1ul，DEPC traeated-water补至总体积12ul；继续加入5X ReactionBuffer 4ul，Ribolock^TM RNase抑制剂1μl(20u)，10mM dNTP Mix2ul，RevertAid^TMM-MuLV逆转录酶1ul(200u)。轻柔混匀后，在PCR仪上42℃温育60分钟后70℃5分钟终止反应。合成的cDNA文库短期冻存于-20℃，长期保存于-70℃。

1.9细胞蛋白抽提及免疫印迹分析(Immuno-Blotting)

细胞总蛋白提取：冰冷PBS洗细胞2次后，用细胞刮刀刮下帖壁细胞，并转移入EP管。3500RPM离心10分钟，弃尽上清；将细胞重悬于细胞裂解液(20mMTris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EGTA，1％Triton X-100，Cocktail)，P-200枪尖吹打80次辅助裂解，冰浴30分钟；14,000g离心15分钟，收集上清，BCA法定量。

免疫印迹/Immuno-Blotting检测：收集蛋白定量均衡后，加入SDS加样缓冲液(β巯基乙醇，甘油，20％SDS，0.1溴酚蓝)，99℃保温7分钟，离心后取上清，12.5％～15％的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳分离蛋白样品后，用100v，1.5小时湿式电转印至硝酸纤维素膜上，以TBST(Tris-HCl，NaCl，0.1％Tween-20)配制5％脱脂牛奶4℃封闭过夜后，分别与一抗室温结合1小时或4℃过夜，之后用TBST洗膜三次，每次10分钟；再加入相应的IRDye^TM 800/700conjugated二抗避光反应一小时，TBST重复洗膜后三次后用Odyssey Imaging System仪器扫描成像分析。

1.10免疫组织化学染色(Immunohistochemistry)

脱蜡：石蜡切片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次；

再水化：将脱腊后的组织切片于100％乙醇中浸泡5分钟×2次，95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、蒸馏水各浸泡5分钟×1次；

去除内源性过氧化物酶：新鲜配置3％H₂O₂，滴片覆盖，室温避光孵育10分钟；

抗原修复：抗原修复液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高火加热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高火加热5分钟，自然冷却至室温；

封闭：用10％正常山羊血清，室温封闭10分钟；

一抗反应：滴片，分别加1∶50兔抗CCDC134多抗、用免疫原(多肽)吸收后的兔抗CCDC134多抗作为实验阴性对照(以PBS稀释)，4℃过夜反应(12-16h)；

PBS洗5分钟，共3次，不时晃动；

二抗反应和显色：按照DAKO cytomation Envision^+TM System HRP试剂盒的说明书进行；

最后苏木精复染细胞核，中性树胶封片后，光学显微镜下观察并记录结果。

1.11划痕试验(Wound-Healing Assay)

在12孔板背面用文具刀刻平行直线做镜下标志线。FAM96A-shRNA稳定转染株等量细胞克隆接种于12孔板内，控制接种后18-24小时细胞汇合度为100％。用等宽P-200枪头垂直于镜下标志线划痕，分别在划痕后0小时、12小时、24小时、33小时、36小时以标志定位线为参照，同一视野拍摄相差显微镜照片进行追踪观察。ImageJ软件处理分析。

实施例1：FAM96A蛋白抗原多肽合成

我们选择合成FAM96A蛋白质一级结构45→66、112→140两条多肽序列作为抗原多肽：

多肽编号AA#：V1、V2共有(SEQ ID No.35)

多肽编号AB#：V1独有(SEQ ID No.36)

合成多肽AB#在其氨基端额外添加一个半胱氨酸，AA#多肽则直接利用其羧基端的半胱氨酸偶联KLH(keyhole limpet hemocyanin，钥孔血蓝素)。

将前述AA#与AB#多肽分别与弗氏佐剂混合后，各自单独免疫2只新西兰白兔制备多克隆抗体。根据免疫多肽不同，依次编号为：AA1#、AA2#、AB1#、AB2#。三次免疫后，ELISA检测显示兔血清效价均升至1∶10000以上。采集兔血清，1∶1000稀释后进行免疫印迹检测，结果证实：AA2#和AB2#两组抗血清可以在过表达FAM96A-V1-Myc-His₆的HEK293T细胞裂解液中识别出特异性条带(25kD)(图1条带2、4)，免疫前兔血清对照则无特异性条带(图1条带1、3)。细胞裂解液经Anti-His标签抗体做免疫印迹实验证实过表达真实有效(图1条带5、6)。

用CNBr活化的Sepharose 4B亲和层析柱耦联的相应多肽，亲和层析纯化AA2#和AB2#抗体。纯化后抗体PAGE电泳后经考马斯蓝染色鉴定(图2)，所获得抗体纯度较好，可用于后续试验。

用纯化后的抗体进行免疫印迹实验(图3)，证实AB2#抗体可以识别过表达的FAM96A-V1-Myc-His₆条带(理论分子量25kD)、过表达FAM96A-V1条带，也可以识别内源性FAM96A-V1条带(理论分子量18.4kD)。

将纯化后的抗体试用于免疫荧光与免疫组化实验(图4与图5)，结果表明，AA2#、与AB2#兔抗FAM96A多克隆抗体特异性较好，可以应用于免疫荧光与免疫组化实验。

实施例2：FAM96A在乳腺癌组织标本中的表达特点

为了研究FAM96A与侵袭性肿瘤的关系，我们选择购买了陕西超英公司的“同正常-癌旁-肿瘤灶”三点比对式乳腺癌芯组织芯片，用能够识别FAM96A-v1的AB2#多克隆抗体进行免疫组化染色。

该组织芯片总计有19对有效配对点样组织，抗体染色特异性好。

首先，我们比较分析了FAM96A-V1整体着色规律(图6)。

在所有病例中，有11例肿瘤灶着色明显低于癌旁及远隔正常组织；在这11例样品中，有4例肿瘤灶完全不着色，癌旁及正常组织则依次呈现阳性或强阳性着色；7例肿瘤轻度着色，癌旁和正常组织则呈现强阳性着色。

有5位病例肿瘤灶与癌旁及远隔正常组织整体染色强度未见明显差异。

仅有4位患者的肿瘤灶着色强于癌旁或远隔正常组织。

统计学分析提示，乳腺癌组织的FAM96A-V1表达水平显著低于癌旁或远隔正常组织。差异具有显著的统计学意义(p＝0.04)。

前述实验证实，在乳腺癌、胃癌、肾透明细胞癌的免疫组织化学染色标本中，FAM96A着色主要出现在上皮细胞细胞核内(图4)。令人惊讶的是，18例明确诊断的乳腺癌标本(有一例小叶癌远隔组织点样脱片)，其细胞核着色强度表现出了鲜明而独特的规律(图7、图8)-仅有一位病例的肿瘤组织核着色与癌旁/正常对照没有差异。其余所有病例的肿瘤灶内，其细胞核着色都显著低于癌旁及远隔正常组织。差异具有极其显著的统计学意义(p＝2.62*10^-6)。非常有趣的是，即便在那一粒核着色无差异的肿瘤灶内，其胞质着色呈现强阳性，胞核着色亦明显弱于胞质。事实上，所有前述4例肿瘤灶着色强于癌旁/远隔正常的病例，其肿瘤灶胞核着色均弱于胞质，即出现“核质着色倒置”现象。这一特殊而鲜明的规律提示我们，FAM96A整体下调或入核水平降低可以用于检测乳腺癌的发生，对其进行预测。即，可以制备一种检测乳腺癌的检测剂，该检测剂可以仅仅包含检测FAM96A-v1蛋白质表达的试剂，诸如其单克隆和多克隆抗体。当然该检测剂也可以包含本领域人员所熟知的检测剂所包含的其它常规添加剂和辅剂。即，FAM96A-v1蛋白质的单克隆和多克隆抗体可以应用于制备检测乳腺癌的检测剂中。并且，FAM96A-v1基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂可以用于治疗乳腺癌的药物的制备中。

实施例3：FAM96A下调诱导肿瘤细胞发生上皮-间质变迁

1.1siRNA敲减内源FAM96A诱导多种上皮来源肿瘤细胞发生上皮-间质变迁(EMT)

1.1.1FAM96A siRNA有效性验证

FAM96A的小干扰RNA(siRNA)由上海吉玛公司设计合成。

敲减靶点均设计在FAM96A的开放读码框架内。其中编号为si22的序列仅敲减FAM96A-v1，而si107、si132两条siRNA则同时敲减FAM96A-v1、FAM96A-v2两种可变剪接体。

我们首先使用siRNA与pEGFP-N1-FAM96A-v1质粒共转染，在人肺腺癌细胞系A549细胞中验证siRNA对外源性FAM96A mRNA的敲减效果(图9)。荧光显微镜观察结果表明，三条siRNA均能够有效沉默外源性FAM96A的表达。

用si22与si132两条siRNA转染A549细胞，进行半定量RT-PCR实验验证(图10)。实验结果表明si22与si132两条siRNA均能敲减内源性FAM96A。si22仅敲减FAM96A-V1约50％，si132能够同时敲减FAM96A-V1与V2两种可变剪接体，沉默效率优于si22。

1.1.2siRNA敲减内源FAM96A诱导多种上皮来源肿瘤细胞发生形态学改变

我们使用前述的三条siRNA转染A549细胞。敲减内源性FAM96A的表达可以使A549细胞发生显著的形态学改变。从上皮细胞典型的卵石状(pebble-like)形态转变为类成纤维细胞样的形态(图11)。FAM96A敲减组细胞形态明显增大，长宽比例显著增加；伪足数目显著增多，提示细胞运动能力增强。与此同时，细胞与细胞间的接触方式也由上皮细胞的紧密带状连接转变为疏松的点状接触，提示细胞的粘附方式发生改变。

值得注意的是，仅敲减FAM96A-v1的si22与与同时敲减FAM96A-v1/v2的si107/si132两条siRNA引起的实验现象基本一致。一方面提示FAM96A-V1对于细胞形态调控具有重要意义；另一方面，v1/v2在调节细胞形态方面其功能有协同作用，而非彼此拮抗。

在多种上皮来源的肿瘤细胞中重复这一实验，得到了一致的实验结果(图12)。在人类食管癌细胞系TE-1中敲减内源性FAM96A，细胞的长宽比显著增大，部分细胞铺展面积增加，同时伸出极为纤长的丝状伪足。沉默FAM96A使人类乳腺癌细胞MCF7出现前述改变的同时，细胞出现了典型的细胞微棘(Microspikes)与膜皱褶(Membrane Ruffles)结构。伪足结构与膜皱褶提示细胞F-Actin骨架的活跃变化与其运动能力的大幅增强，分子水平Rho家族Cdc42、Rac1、RhoA激酶活性升高(Jiri Zavadil and Erwin P“TGF-beta and epithelial-to-mesenchymaltransitions，”Oncogene 24，no.37(August 29，2005)：5764-5774)；另一方面，在人类非小细胞肺癌细胞系H1299、MCF7细胞中沉默FAM96A后，细胞铺展面积也显著增加(图13)，这一点与转化生长因子(TGF)超家族成员骨形态发生蛋白4(BMP4)诱导卵巢癌细胞发生上皮-间质变迁时的现象颇为类似(Brigitte L.Theriault et al.，“BMP4induces EMT and Rho GTPase activation in human ovarian cancer cells，”Carcinogenesis 28，no.6(June 1，2007)：1153-1162)。

1.1.3siRNA敲减内源FAM96A诱导A549细胞和MCF7CDH1(E-Cadherin)重分布与细胞-细胞接触方式改变

在前述的实验中，我们观察到敲减内源性FAM96A在诱导人类肺腺癌细胞A549发生形态学改变的同时，细胞间的接触方式有所变化，细胞-细胞间粘附结构略显松散。

基于背景技术所述的实验提示，我们用siRNA沉默内源性FAM96A，诱导A549细胞发生形态学改变，使用CDH1抗体做间接免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜实验观察CDH1分子表达量与分布的变化(图14)。

实验结果证实：siRNA-Ctrl阴性对照组，CDH1明显分布于细胞膜周，而在FAM96A敲减组，部分细胞的铺展面积明显增大，伸出明显伪足。与对照组不同，其CDH1荧光信号主要出现在胞质近核周区。提示CDH1功能状态改变与细胞粘合连接(AJ)功能异常。值得注意的是，与转录因子SNAI1、TWIST1诱导EMT时，直接结合启动子区E-Box，在转录水平抑制CDH1不同；转录因子FOXC2诱导上皮细胞发生EMT时，能使CDH1自胞膜转移至胞质，从而改变CDH1的分布状态，进而使细胞的粘附功能发生改变(Sendurai A Mani et al.，“Mesenchyme Forkhead 1(FOXC2)plays a key role in metastasis and is associated with aggressive basal-like breastcancers，”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America104，no.24(June 12，2007)：10069-10074)。这与我们的实验现象类似。

我们在MCF7细胞中重复这一实验，得到了类似的实验结果(图15A，15B)。与对照组相比，敲减FAM96A实验组在同样改变了CDH1的亚细胞空间分布。与此同时细胞间的连接方式也发生明显变化，从siRNA-Ctrl对照组典型的带状连接转变为实验组的点状接触，前者系上皮细胞的连接方式，而后者是间质细胞的连接特征。这一区别正是判断上皮-间质变迁(EMT)的重要指标(Erik W Thompson，DonaldF Newgreen，and David Tarin，“Carcinoma invasion and metastasis：a role forepithelial-mesenchymal transition？，”Cancer Research 65，no.14(July 15，2005)：5991-5995；discussion 5995)。

1.1.4siRNA敲减内源FAM96A诱导A549细胞和MCF7细胞骨架F-ACTIN重塑

细胞表面的许多特化结构以细胞微丝(MF)作为支架，其中板状/片状伪足(lamellipodia)、丝状伪足(filopodia)、细胞微棘(Microspikes)与膜皱褶(MembraneRuffles)都属于典型的动态微丝结构。与细胞的运动、迁移、侵袭密切相关。既往认为，纤维母细胞、白细胞和某些胚胎细胞才拥有形成伪足的能力(周柔丽等《医学细胞生物学》第二版北京大学医学出版社)。敲减FAM96A的肿瘤细胞出现上述结构，一方面提示这些原本来自于上皮的肿瘤细胞开始具有这些原本仅属于间质细胞的特点，其运动与迁移的能力显著增强，另一方面也提示我们其细胞微丝形态发生了显著变化。

细胞微丝的基本组分是肌动蛋白actin。据此，我们用鬼笔环肽特异染色纤维状肌动蛋白F-ACTIN，用激光共聚焦显微镜观察沉默FAM96A表达的A549细胞其F-ACTIN的变化情况(图16)。

实验结果显示敲减内源性FAM96A，使A549细胞的细胞骨架发生显著变化：F-ACTIN由阴性对照组典型的上皮细胞皮质区细胞骨架(Cortical MF)转变为间质细胞样胞内放射状排列的应力纤维样细胞骨架(Stress Fiber-Like MF)。

我们在MCF7细胞中重复这一实验，得到了一致的实验结果(图17)。

上述发现提示，内源性FAM96A降低可以使上皮细胞骨架由皮质细胞骨架转变为间质细胞特有的应力纤维样骨架，从而为细胞运动与迁移能力的显著增强提供了结构基础(Derek C Radisky，“Epithelial-mesenchymal transition，”Journal of Cell Science118，no.Pt 19(October 1，2005)：4325-4326)。

1.1.5siRNA敲减内源FAM96A显著抑制A549细胞EMT上皮标志分子表达，显著上调多组EMT核心转录因子

敲减内源性FAM96A引起多种细胞发生形态学变化，同时粘附分子CDH1与细胞骨架发生的显著变化都与上皮-间质变迁(EMT)现象相符。为了进一步证实沉默FAM96A引起变化就是上皮-间质变迁，我们在A549细胞中用siRNA敲减FAM96A，转染后24H收取细胞总RNA制备cDNA文库，用半定量RT-PCR法检测EMT相关分子的表达变化情况(图18)。

实验结果表明，在A549细胞中敲减FAM96A后，上皮细胞特征性分子，诸如桥粒连接分子Desmoplakin、上皮细胞特征性中间纤维(Intermediate Filaments)分子KRT18、上皮细胞紧密连接(Tight Junction)分子TJP-1/ZO-1均在转录水平明显下调。与此同时，介导EMT的多个核心转录因子TWIST1、SNAI1、ZEB1、ZEB2、TCF3-E47均在转录水平显著上调。

半定量RT-PCR实验进一步证实FAM96A的降低能够迅速且有力地直接在转录水平上调多个EMT核心转录因子，进而显著抑制上皮特征分子的表达。作为EMT影响上皮细胞功能的里程碑式分子-CDH1，虽然在转录水平未见明显下调，但是前述实验证实其亚细胞分布及功能状态的显著变化。如前所述，我们用的siRNA敲减效果非常有限，这恰恰说明FAM96A轻度的变化就足以引起EMT相关分子的剧烈波动，从而证实FAM96A是EMT敏感且强有力的抑制因素和关键调控分子。

1.1.6瞬时转染FAM96A siRNA显著改变A549细胞细胞核的异型性

我们在实验中还观察到，用siRNA沉默FAM96A的表达，可以使A549细胞的核异型性显著提高。核体积显著增大，且核分叶相明显增多。核异型性是病理学上判断肿瘤分化程度的金指标，核异型性增加提示：敲减FAM96A后，A549细胞发生间变(anaplasia)，其恶性程度显著升高(图19)。

2.2稳定转染FAM96A短发卡RNA(shRNA)诱导A549细胞发生上皮-间质变迁(EMT)并显著增强其体外迁移能力

2.2.1FAM96A shRNA的有效性验证

为了进一步研究FAM96A持续下调对于肿瘤细胞EMT现象的影响，尤其是伴随EMT发生的细胞迁移与侵袭能力增强，我们尝试利用FAM96A的shRNA稳定转染A549细胞，筛选FAM96A稳定敲减的细胞克隆作为后续研究的细胞模型。

首先，我们从Origene公司购入pRFP-V-RS-FAM96A shRNA成套质粒载体系统，共包含4条shRNA候选质粒(下称sh1/sh2/sh3/sh4)和阴性对照质粒Scramble-shRNA(下称shRNA-Ctrl)。因质粒较为巨大，我们首先在人肝癌细胞系HepG2中电穿孔瞬时转染上述质粒，shRNA质粒自带红色荧光证实转染效率均一无误。转染48H后收取总RNA，用半定量RT-PCR法对shRNA有效性进行筛选鉴定(图20)。

实验结果表明，sh3与sh4能够在mRNA水平有效敲减FAM96A，据此我们选择sh3与sh4两组shRNA质粒用于后续稳定转染实验。

2.2.2FAM96A shRNA稳定转染A549细胞株的筛选与验证

我们使用脂质体试剂Lipofectamine2000转染A549细胞。实验组分别转染sh3、sh4两组shRNA质粒，阴性对照组则转染shSC质粒。转染后加入含Puromycin当量1.5ug/ml(参考Invitrogen网站)的抗性培养基进行筛选，每2-3日更换一次抗性培养基。野生型细胞对照组在加入抗性培养基5天后全部死亡。在持续培养10日后，转染组出现明显可见的细胞克隆。

我们采用有限稀释法选取单细胞克隆。镜下估计细胞总数，胰酶消化后调整细胞浓度约为每100ul培养基仅含一个细胞，按100ul/well接种入96孔板，次日镜检选取仅含有1个细胞克隆的培养孔，每2-3日更换抗性培养基，持续培养扩增。转染后18日，降低Puromycin当量至维持浓度1.0-1.2ug/ml，继续培养单细胞克隆用于后续半定量RT-PCR鉴定及功能试验。

根据RT-PCR鉴定实验结果(图21)，选择稳定转染A549克隆(表2)作为后续实验的细胞模型。

表2A549FAM96A-shRNA稳定转染细胞克隆选择表

2.2.3FAM96A shRNA稳定转染诱导A549细胞发生EMT样形态学变化

我们发现，所有的FAM96A-shRNA稳定转染A549克隆相比对照组，均呈现明显的形态学变化(图22)。在相同的培养密度条件下，细胞呈显著分散性生长，提示其分散能力(Cell Scattering Ability)增加；细胞纵横比显著增大，由卵石形转变为近梭形，可见极为明显的丝状伪足结构，部分实验组出现明显的膜皱褶(MembraneRuffles)结构，如(图22I&J)箭头标示所示，提示细胞的运动迁移能力的大幅度增强。上述变化与发生EMT时的细胞形态变化特征相符。

2.2.4A549FAM96A-shRNA稳定转染株EMT相关标志分子的系统性研究

上皮-间质变迁具有相当复杂的分子生物学机制。上皮细胞，特别是上皮来源的肿瘤细胞可以通过多条信号转导通路的交叉整合诱导发生上皮-间质变迁。为了进一步证实shRNA稳定敲减内源FAM96A的确诱导A549细胞发生上皮-间质变迁，并且初步探索其分子生物学机制，为后续机制研究指明线索，我们制备了前述稳定转染株的cDNA文库，采用半定量RT-PCR与实时定量Quantitative PCR的办法检测了EMT相关的多种分子在转录水平的变化情况。(图23)

半定量RT-PCR证实，通过稳定转染shRNA持续敲减FAM96A，代表上皮细胞特征的KRT18分子、CDH1分子均显著下调，后者正是上皮细胞特征丧失里程碑式的分子；而间质细胞特有骨架成分α-SMA/ACTA2则显著上调。

2.2.5FAM96A shRNA稳定转染显著增强A549细胞体外迁移与侵袭能力

我们通过划痕试验(Wound-Healing Assay)来观察稳定敲减FAM96A后，A549细胞体外迁移能力与迁移方式的变化。

Wound-Healing实验结果(图24)证实：稳定敲减FAM96A后，一方面，A549细胞的迁移能力显著增强；另一方面细胞的迁移方式(图25)也发生显著的变化。shRNA-Ctrl阴性对照组的数个克隆迁移方式都是上皮细胞典型的片层式(sheet-like)整体迁移，其迁移前缘极少有游离细胞出现；而FAM96A敲减组则呈现类似NIH 3T3等成纤维细胞式的迁移模式，迁移前缘可见明显游离细胞，且伸出纤长的细胞伪足。

上述实验结果说明，FAM96A的下调可以在诱导EMT的同时，显著增强上皮来源肿瘤细胞的迁移与侵袭能力。肿瘤细胞可以通过下调FAM96A或抑制其分子功能获得强大的转移播散能力。肿瘤组织低表达FAM96A提示其预后不佳。

实施例4

分泌型FAM96A-V1以浓度依赖的方式显著抑制TGF-β1引起的FN1上调

培养并转染HEK293T细胞，纯化得到分泌型FAM96A-V1-Myc-His₆(下称sV1-Myc-His₆)真核重组蛋白。

纯化所得的FAM96A-V1-Myc-His₆经PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测证实纯化所得分泌蛋白纯度不佳。免疫印迹实验证实纯化产物的确含有分泌型FAM96A-V1-Myc-His₆蛋白，根据阳性对照半定量估计，纯化后sV1-Myc-His₆蛋白浓度约为0.5ng/ul(图26)。

我们用前述纯化产物在TGF-β1诱导A549细胞EMT模型中尝试性研究了sFAM96A-V1的功能。

与之前的实验结果一致，在诱导A549细胞EMT过程中，TGF-β1可以上调FN1的表达。分泌型FAM96A-V1则以浓度依赖的方式拮抗这一作用，最适作用浓度为5ng/ml，临近浓度呈现倒钟型作用曲线(图27)。提示我们分泌型FAM96A可以部分拮抗TGF-β1，且有负向调控EMT作用，进而在生长发育、炎症性疾病、创伤愈合、纤维化疾病和肿瘤转移中发挥作用。

序列表

<110>北京大学

<120>人类基因FAM96A及其蛋白质的应用

<130>CNC1F100036143

<160>36

<210>1

<211>1108

<212>RNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(241)...(723)

<400>1

cgagccgcga agattgtttt tgtcccgccg aaatcgagca aagcacgctg gaacttgtag    60

tccttgaggc cccttcccta ggtccttcga gctactccgt ctggccccgc cttttctctg    120

ctctcctgaa cctttaggct tgtctcggcc catttgaaga ccaggaagtt gatcaatccc    180

gaggctgctg agagacggtg gcgcgattgg gacagtcgcc agggatggct gagcgtgaag    240

atgcagcggg tgtccgggct gctctcctgg acgctgagca gagtcctgtg gctctccggc    300

ctctctgagc cgggagctgc ccggcagccc cggatcatgg aagagaaagc gctagaagtt    360

tatgatttga ttagaactat ccgggaccca gaaaagccca atactttaga agaactggaa    420

gtggtctcgg aaagttgtgt ggaagttcag gagataaatg aagaagaata tctggttatt    480

atcaggttca cgccaacagt acctcattgc tctttggcga ctcttattgg gctgtgctta    540

agagtaaaac ttcagcgatg tttaccattt aaacataagt tggaaatcta catttctgaa    600

ggaacccact caacagaaga agacatcaat aagcagataa atgacaaaga gcgagtggca    660

gctgcaatgg aaaaccccaa cttacgggaa attgtggaac agtgtgtcct tgaacctgac    720

tgatagctgt tttaagagcc actggcctgt aattgtttga tatatttgtt taaactcttt    780

gtataatgtc agagactcat gtttaataca taggtgattt gtacctcaga gtatttttta    840

aaggattctt tccaagcgag atttaattat aaggtagtac ctaatttgtt caatgtataa    900

cattctcagg atttgtaaca cttaaatgat cagacagaat aatattttct agttattatg    960

tgtaagatga gttgctattt ttctgatgct cattctgata caactatttt tcgtgtcaaa    1020

tatctactgt gcccaaatgt actcaattta aatcattact ctgtaaaata aataagcaga    1080

tgattcttat aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                       1108

<210>2

<211>160

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>2

Met Gln Arg Val Ser Gly Leu Leu Ser Trp Thr Leu Ser Arg Val Leu

1               5                   10                  15

Trp Leu Ser Gly Leu Ser Glu Pro Gly Ala Ala Arg Gln Pro Arg Ile

            20                  25                  30

Met Glu Glu Lys Ala Leu Glu Val Tyr Asp Leu Ile Arg Thr Ile Arg

         35                 40                  45

Asp Pro Glu Lys Pro Asn Thr Leu Glu Glu Leu Glu Val Val Ser Glu

     50                 55                   60

Ser Cys Val Glu Val Gln Glu Ile Asn Glu Glu Glu Tyr Leu Val Ile

65                  70                 75                  80

Ile Arg Phe Thr Pro Thr Val Pro His Cys Ser Leu Ala Thr Leu Ile

                85                  90                  95

Gly Leu Cys Leu Arg Val Lys Leu Gln Arg Cys Leu Pro Phe Lys His

            100                 105                 110

Lys Leu Glu Ile Tyr Ile Ser Glu Gly Thr His Ser Thr Glu Glu Asp

        115                 120                 125

Ile Asn Lys Gln Ile Asn Asp Lys Glu Arg Val Ala Ala Ala Met Glu

     130                 135                140

Asn Pro Asn Leu Arg Glu Ile Val Glu Gln Cys Val Leu Glu Pro Asp

145                 150                 155                 160

<210>3

<211>1058

<212>RNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(241)...(549)

<400>3

cgagccgcga agattgtttt tgtcccgccg aaatcgagca aagcacgctg gaacttgtag     60

tccttgaggc cccttcccta ggtccttcga gctactccgt ctggccccgc cttttctctg    120

ctctcctgaa cctttaggct tgtctcggcc catttgaaga ccaggaagtt gatcaatccc    180

gaggctgctg agagacggtg gcgcgattgg gacagtcgcc agggatggct gagcgtgaag    240

atgcagcggg tgtccgggct gctctcctgg acgctgagca gagtcctgtg gctctccggc    300

ctctctgagc cgggagctgc ccggcagccc cggatcatgg aagagaaagc gctagaagtt    360

tatgatttga ttagaactat ccgggaccca gaaaagccca atactttaga agaactggaa    420

gtggtctcgg aaagttgtgt ggaagttcag gagataaatg aagaagaata tctggttatt    480

atcaggttca cgccaacagt acctcattgc tctttggcga ctcttattgt tggaaatcta    540

catttctgaa ggaacccact caacagaaga agacatcaat aagcagataa atgacaaaga    600

gcgagtggca gctgcaatgg aaaaccccaa cttacgggaa attgtggaac agtgtgtcct    660

tgaacctgac tgatagctgt tttaagagcc actggcctgt aattgtttga tatatttgtt    720

taaactcttt gtataatgtc agagactcat gtttaataca taggtgattt gtacctcaga    780

gtatttttta aaggattctt tccaagcgag atttaattat aaggtagtac ctaatttgtt    840

caatgtataa cattctcagg atttgtaaca cttaaatgat cagacagaat aatattttct    900

agttattatg tgtaagatga gttgctattt ttctgatgct cattctgata caactatttt    960

tcgtgtcaaa tatctactgt gcccaaatgt actcaattta aatcattact ctgtaaaata   1020

aataagcaga tgattcttat aaaaaaaaaa aaaaaaaa                           1058

<210>4

<211>102

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>4

Met Gln Arg Val Ser Gly Leu Leu Ser Trp Thr Leu Ser Arg Val Leu

1               5                   10                  15

Trp Leu Ser Gly Leu Ser Glu Pro Gly Ala Ala Arg Gln Pro Arg Ile

            20                   25                 30

Met Glu Glu Lys Ala Leu Glu Val Tyr Asp Leu Ile Arg Thr Ile Arg

        35                 40                   45

Asp Pro Glu Lys Pro Asn Thr Leu Glu Glu Leu Glu Val Val Ser Glu

     50                 55                  60

Ser Cys Val Glu Val Gln Glu Ile Asn Glu Glu Glu Tyr Leu Val Ile

65                 70                   75                  80

Ile Arg Phe Thr Pro Thr Val Pro His Cys Ser Leu Ala Thr Leu Ile

                 85                  90                 95

Val Gly Asn Leu His Phe

            100

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>5

ttctccgaac gtgtcacgtt t                  21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>6

acgtgacacg ttcggagaat t                  21

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>7

cagcgatgtt taccatttat t                  21

<210>8

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>8

taaatggtaa acatcgctga a                  21

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>9

gcgctagaag tttatgattt t                  21

<210>10

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>10

aatcataaac ttctagcgct t                  21

<210>11

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>11

gaactatccg ggacccagat t                  21

<210>12

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>12

tctgggtccc ggatagttct a                  21

<210>13

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<400>13

aagagaaagc gctagaagtt tatgatttg          29

<210>14

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<400>14

aagagaaagc gctagaagtt tatgatttg          29

<210>15

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<400>15

aagttggaaa tctacatttc tgaaggaac    29

<210>16

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<400>16

cggatcatgg aagagaaagc gctagaagt    29

<210>17

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

cgcggatccc ggcagccccg gatcat       26

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cgcggatcct cagtcaggtt caaggacaca c 31

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ccggaattcgccaccatgcagcgggtgtccg    31

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

cgcggatccc ggtcaggttc aaggacacac t 31

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g  31

<210>22

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cgcggatcct cagtcaggtt caaggacaca c  31

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g  31

<210>24

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

cggggtaccg agtcaggttc aaggacacac t 31

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g 31

<210>26

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

cgcggatccc ggtcaggttc aaggacacac t 31

<210>27

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g           31

<210>28

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

tatcgcggat cccggaaatg tagatttcca acaataagag  40

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g           31

<210>30

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

tatcgcggat cctcagaaat gtagatttcc aacaat                  36

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g                       31

<210>32

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

tatcggggta ccgagaaatg tagatttcca acaataagag              40

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

ccggaattcg ccaccatgca gcgggtgtcc g                       31

<210>34

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

tatcgcggat cccggaaatg tagatttcca acaataagag                  40

<210>35

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<400>35

Arg Thr Ile Arg Asp Pro Glu Lys Pro Asn Thr Leu Glu Glu Leu Glu

1               5                   10                  15

Val Val Ser Glu Ser Cys

             20

<210>36

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<400>36

His Lys Leu Glu Ile Tyr Ile Ser Glu Gly Thr His Ser Thr Glu Glu

1               5                   10                  15

Asp Ile Asn Lys Gln Ile Asn Asp Lys Glu Arg Val Ala

            20                  25

Claims (7)

1.检测FAM96A蛋白质表达的试剂在制备检测上皮来源肿瘤预后的检测剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的试剂是FAM96A蛋白质的单克隆或多克隆抗体，所述的上皮来源肿瘤是人类食管癌、人类肺腺癌和人类乳腺癌。

3.FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备用于抑制细胞发生上皮-间质变迁的药物中的应用。

4.FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备抑制上皮来源肿瘤细胞的迁移与侵袭的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述的上皮来源肿瘤是人类食管癌、人类肺腺癌和人类乳腺癌。

6.检测FAM96A蛋白质表达的试剂在制备检测多器官纤维化或硬化疾病中分级诊断及预后判断的检测剂中的应用。

7.FAM96A基因所表达的蛋白质或该基因的激动剂在制备治疗多种器官纤维化或硬化疾病的药物中的应用。