CN113304143B - 橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用 - Google Patents

橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用。本发明首次研究发现橘皮素能够显著提高抗肾癌药物的疗效，与抗肾癌药物联用可降低药物用量，本发明为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案，为肾细胞癌的新药研发奠定了一定的基础。

Description

橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用。
背景技术
肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC，简称肾癌)起源于肾实质泌尿小管上皮系统，起病时隐匿，接近三分之一的患者在初诊时已发生转移，20％～40％的局限性肾癌患者在肿瘤切除后仍然会发生转移，而转移性肾癌的预后极差，五年生存率不超过10％，且其对传统的化疗与放疗均不敏感，药物治疗是目前临床上的主要治疗方式。
作为血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的舒尼替尼和索拉非尼是肾细胞癌靶向治疗的重要药物(寿建忠,马建辉.肾癌的靶向治疗现状与进展[J].中国新药杂志,2010,19(17):1539-1546.)，但舒尼替尼和索拉非尼的长期服用会导致耐药，疗效降低，为了保证药效通常需要增加剂量以达到临床疗效，但药物用量的增加会对人体其他器官造成一定的毒副作用，对机体安全存在着潜在的风险，极大地限制了抗肾癌药物的临床应用。
因此，如何提升肾癌药物的治疗效果，减少肾癌药物的用量，对于肾癌的治疗具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对上述现有抗肾癌药物疗效的不足，旨在提供橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用。将橘皮素与抗肾癌药物联用，可有效提高抗肾癌药物疗效，降低药物用量，对肾细胞癌具有良好的治疗效果。
本发明的首要目的是提供橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用。
本发明的另一目的是提供橘皮素和/或其衍生物与抗肾癌药物联用在制备预防和/或治疗肾细胞癌药物中的应用。
本发明的又一目的是提供一种预防和/或治疗肾细胞癌的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明请求保护橘皮素和/或其衍生物在制备或作为抗肾癌药物增敏剂中的应用，以及橘皮素和/或其衍生物与抗肾癌药物联用在制备预防和/或治疗肾细胞癌药物中的应用。
本发明首次研究发现橘皮素能够显著提高抗肾癌药物的疗效，与抗肾癌药物联用可降低药物用量，本发明为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案，为肾细胞癌的新药研发奠定了一定的基础。
优选地，所述抗肾癌药物包括血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。
进一步优选地，所述血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂包括舒尼替尼或索拉非尼。
优选地，所述预防和/或治疗肾细胞癌包括抑制肾癌细胞的增殖、克隆或迁移的一种或几种能力。
进一步优选地，所述肾癌细胞包括OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1或ACHN的一种或几种。
优选地，所述橘皮素衍生物包括以橘皮素或其糖类、氨基酸衍生物为母核的分子、类似物或其药物可接受的盐。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肾细胞癌的药物，包括橘皮素和/或其衍生物以及抗肾癌药物。
优选地，还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型。本发明所述药物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的，如固体剂型、半固体剂型、液体制剂或气雾制剂，具体可以包括散剂、颗粒剂、丸剂、胶剂、外用膏剂、糊剂、汤剂、酒剂、注射剂、气雾剂、吸入剂、缓控释制剂或肠溶剂。
本发明的橘皮素是柑橘类水果果皮中的多甲氧基黄酮，对机体并无毒副作用，与抗肾癌药物联用，可用于日常服用，以预防特定人群的肾细胞癌变。
本发明的橘皮素别称为5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮，分子量是372.37，其计算化学数据为：ALogP值3.054；LogD值3.054；疏水参数计算参考值(XlogP)3；氢键供体数量为0；氢键受体数量为7；可旋转化学键数量为6。其结构式见图1所示，化学结构球棍图见图2所示。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次研究发现橘皮素能够显著提高抗肾癌药物的疗效，与抗肾癌药物联用可降低药物用量，本发明为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案，为肾细胞癌的新药研发奠定了一定的基础。
附图说明
图1是橘皮素的结构式。
图2是橘皮素的化学结构球棍图。
图3A是橘皮素协同索拉非尼对786-O细胞增殖的抑制情况，图3B是橘皮素协同舒尼替尼对OS-RC-2细胞增殖的抑制情况，图3C是橘皮素协同舒尼替尼对786-O细胞增殖的抑制情况，图3D是橘皮素协同舒尼替尼对786-O细胞克隆形成的抑制情况，图3E是橘皮素协同舒尼替尼对769P细胞克隆形成的抑制情况，图3F是橘皮素协同舒尼替尼对769-P细胞迁移的抑制情况，图3G是橘皮素协同舒尼替尼对786-O细胞迁移的抑制情况。其中，*表示线条所指示的组之间比较，P<0.05。
图4A是ACHN细胞中抑制Cx43表达后磷酸化EGFR、AR、MMP-9和SOD-1表达的下调情况；图4B是ACHN细胞中抑制Cx43表达后CD44分子的表达抑制情况；图4C是橘皮素对磷酸化ERK在OS-RC-2细胞中表达的抑制情况；图4D是在肾癌OS-RC-2细胞中抑制Cx43表达后磷酸化EGFR、磷酸化ERK、P65和Survivin的表达抑制情况；图4E是橘皮素对786-O细胞磷酸化Stat3、Survivin、BCL-2和磷酸化AKT的表达抑制情况。
图5A是橘皮素协同舒尼替尼对ACHN细胞克隆形成的抑制情况，图5B是橘皮素协同舒尼替尼对OS-RC-2细胞在体内裸鼠移植瘤中生长的抑制情况。
图中，Tan是指橘皮素，Sorafenib是指索拉非尼，Sunitinib是指舒尼替尼。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，且以下实施例所用试剂和材料均为市购。
1、主要试剂
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium干粉(DMEM，低糖)、胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；
橘皮素购自Selleck Chemicals(Houston,TX,USA)公司；
肾癌细胞(OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1和ACHN)购自中科院上海细胞库；
AR(androgen receptor)、EGFR、磷酸化EGFR、磷酸化ERK、CD44、MMP-9、P65、SOD1、BCL-2、Survivin、pAKT、磷酸化FoxO3a、磷酸化ERK、Cx43和Tubulin的一抗抗体购自CellSignaling Technology(Danvers,Massachusetts,USA)；
RIPA裂解液购自南京凯基生物；
其它常用的实验室试剂均为国产分析纯级。
2、细胞培养
在37℃、5％CO2及湿度饱和的条件下，用含10％胎牛血清的DMEM(低糖)培养基来培养人HK-2细胞，用RPMI-1640培养OS-RC-2、786-O、769-P和Caki-1细胞，用MEM培养基培养ACHN细胞。细胞培养在培养皿中进行，约2～3天用PBS清洗1～2次后再更换培养液。
3、实验动物
裸鼠购自于广东省医学动物实验中心。
4、MTT或MTS法检测细胞活力
首先将细胞按一定密度(约3000～5000个每孔)接种到96孔板中，待24小时细胞贴壁后，换成无血清培养液加入要测定的不同浓度的药物处理24小时。将培养基吸弃后加入配好的每孔含15μL MTT或MTS的培养基，经过一段时间后(MTT用4h，MTS用2～4h)，用酶标仪(Bio-Tek Instruments)在490nm波长时测定其吸光度A，计算其与对应空白组(不加细胞)的吸光度A0的差值，再计算对照组吸光度A1和A0的差值，将两差值的比值换算成百分率，即得细胞存活率，公式如下：细胞存活率＝(A-A0)/(A1-A0)*100％。
5、克隆形成实验
取各组对数生长期的OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1和ACHN等肾癌细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，将细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM或RMPI-1640或MEM培养液中后，分别以500个/mL细胞的密度接种到含4mL、37℃预温培养液的培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时后换液，加入含不同浓度(0、1、3、10或30μmol/L)的橘皮素、舒尼替尼、索拉非尼、及橘皮素和舒尼替尼(或橘皮素和索拉非尼)的培养基1～2周内定期观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液后用PBS小心浸洗2次，再加入4％乙醇结晶紫固定细胞并染色20分钟后，用流水缓慢洗去染色液，自然空气干燥。将平皿拍照后用肉眼直接计数克隆，或用Image pro plus16.0(Media Cybernetics,Inc.)软件计算细胞的克隆数。
6、细胞划痕法检测细胞的迁移能力
将5×105～10×105个/mL的细胞接种于6孔细胞培养板(500μL/孔)，用含10％FBS的细胞培养基培养，待细胞生长形成单层细胞后，用200μL的无菌黄色枪头在单层细胞上划“∣”字划痕，PBS洗3次后继续用含低血清(2～3％FBS)的细胞培养基进行培养，分别在划痕后的24h、48h、72h和96h(不同细胞迁移速度不同，时间上有差异)进行拍照，拍照前用PBS洗3次并更换细胞培养基，检测橘皮素对肾癌细胞迁移能力的影响。
7、Western blot检测蛋白的表达
肾癌细胞用对应浓度的不同药物处理24h之后，进行细胞标本的处理，具体步骤如下：
①将1.5mL的EP管做好标记，放置于冰上预冷。
②裂解和收集细胞：细胞用PBS洗三次后，放置在冰上；用RIPA裂解液溶解细胞，用刮板将细胞刮下后，收集到EP管中(裂解液的量根据细胞量调整，使最终测出的蛋白浓度大概一致)。
③超声破碎：使用超声破碎仪进行破碎，整个过程在冰上进行(注：保证探头放入细胞液下之后再开机，每破碎完一管后将探头用75％乙醇冲洗，再用超纯水冲洗，最后用吸水纸吸干后再用)。
④低温离心：将标记好的样品放入对应的EP管中后放入离心机，然后转移到低温离心机中进行离心，温度设为4℃，按12000rpm的转速离心30分钟。离心后转移上清液至新的EP管中，用于定量或保存在-80℃冰箱。
⑤标准蛋白定量：使用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher)按说明书进行定量。
将不同浓度的标准品加入至96孔板后，以50：1的比例将reagent A和reagent B混匀，然后在不同浓度标准品的孔中加入200μL混合液，37℃孵育30分钟后测定各孔的吸光度值，绘制吸光度与蛋白浓度的标准曲线。
待测蛋白处理同上，以50：1的比例将reagent A和reagent B混匀，37℃孵育30分钟后测定各孔的吸光度值，由上述标准曲线计算蛋白浓度。
⑥制备蛋白样品：根据定量结果里的蛋白浓度(μg/μL)，计算好(25～50μg)蛋白所需的样品量和超纯水的量(μL)，在预冷的EP管内，先加所需水，再加4×上样缓冲液5μL，最后加样品蛋白至总体积为20～30μL。将样品混匀后，在85～90℃中水浴5分钟，取出后置于冰上。
⑦配胶：先用洗洁精充分洗净玻璃板，再用自来水冲净后，用超纯水冲净，晾干或用吹风机吹干。将两块板底部对齐，保证水平，夹于模板上，加入超纯水检查是否漏胶，如不漏，则倒掉水，用滤纸吸干水。先将玻璃板装入到模具中，按照分离胶比例的对应配方将分离胶(5mL/板)配好，倒入玻璃板中至浓缩胶的分离线，然后加入1mL 0.1％SDS进行压胶，待分离胶凝固并出现分界线后，倒掉上层的0.1％SDS，用滤纸吸干残余的0.1％SDS。按照配方配好浓缩胶，倒入分离胶上方，插入梳子。待分离胶凝固后，用吸水纸包好整个胶，使之湿润，外层再用保鲜膜包裹，放到4℃冰箱中保存备用。
⑧上样，跑电泳和转膜
先将玻璃板固定好，然后放在电泳槽内，加入电泳液，将插在浓缩胶中的梳子拔出。
上样：第一泳道加Marker 4μL，最后泳道加Marker 1μL，待检测蛋白的上样体积为20～30μL。
电泳：样品在浓缩胶时将电压设在80V，当Marker前沿进入分离胶后，将电压提高到100V，继续电泳至Marker到达分离胶底部。
转膜：首先在黑色筛板处放一块海绵垫，再放入滤纸，将凝胶放在滤纸的上方，用PVDF膜与凝胶紧贴，保持两者之间无气泡，然后依次在PVDF膜的上方放滤纸和海绵垫，最后将筛板固定，插入已有预冷的电转液的电转槽。于冰浴中设定电压为100V，电转90分钟。
⑨封闭，孵抗体
将PVDF膜按照Marker的分子量剪好并标记，然后在含5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)中室温孵育60～150分钟。根据说明书按照Cx43(1：1000)、磷酸化ERK(1：1000)、tubulin(1：1000)和anti-CD44(1：1000)等抗体于4℃孵育，摇床振摇过夜。第二天在回收一抗后，用TBST洗三次膜，3次×5分钟；二抗的稀释比例为1：7500，然后将二抗加入至PVDF膜中，在室温下摇床摇60分钟；最后用TBST/PBST洗三次膜3次，每次10分钟。
⑩凝胶图像分析
通过双色红外荧光蛋白分析系统扫描PVDF膜，扫描时的曝光强度设为自动，用LI-COR Image Studio Ver5.2工作软件扫描完成后，将扫描后的图像导出，然后用Image J软件并进行灰度分析。
8、动物实验：
20只裸鼠(体重18～22g)购进后经过一周的适应性喂养后，进行移植瘤的接种。在吹打细胞悬液后，与Matrigel基质胶(Corning,Inc.；cat.no.354248)按一定比例混匀，用戊巴比妥钠将裸鼠进行麻醉，麻醉后用注射器将150μL肾癌OS-RC-2细胞悬液注入裸鼠的皮下，每只裸鼠注射的细胞数约为2×106个。皮下注射一周后将移植瘤长的较好的20只裸鼠分成4组：(1)对照组(溶剂，DMSO)；(2)100mg/kg橘皮素；(3)20mg/kg舒尼替尼；(4)100mg/kg橘皮素和20mg/kg舒尼替尼混合。分组后第8～26天每只裸鼠给予一定剂量的溶剂、橘皮素或舒尼替尼，每隔3～4天后测量裸鼠皮下肿瘤的尺寸，并待术后肿瘤长到一定体积后用过量的戊巴比妥钠麻醉后处死各组裸鼠，取肿瘤组织进行体积测定和计算。肿瘤体积的计算采用公式：体积＝(a x b2)/2；a和b分别是长径和短径。
切片做完免疫组化染色后，用PathScope 4S scanner(DigiPath,USA)组织扫描仪进行扫描。
9、统计学方法
实验数据以SPSS16.0软件统计分析，2组的组间比较采用Student test比较，3组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*表示与相应的组比较，P<0.05。图中的柱状图以均值和标准误的形式表示；柱状图和散点图用GraphPad Prism 6.0软件。
实施例1橘皮素联用肾癌药物对肾癌细胞增殖、克隆、迁移的抑制作用
一、实验方法
根据前述“MTT或MTS法检测细胞活力”、“克隆形成实验”、“细胞划痕法检测细胞的迁移能力”中的方法，检测肾癌细胞的增殖、克隆和迁移的能力。
二、实验结果
结果显示，橘皮素能作为血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼和舒尼替尼的增敏剂，提高其对肾癌细胞的增殖、克隆和迁移能力的抑制作用。
具体的，
从图3A可以看出，将橘皮素与索拉非尼(1μmol/L)联用，当橘皮素的浓度为3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L时，细胞相对活性依次减弱，即对786-O细胞的增殖抑制作用依次增强，说明橘皮素可增强索拉非尼对786-O细胞的增殖抑制作用，并且随着橘皮素浓度的增加，其对索拉非尼的增敏作用更强。
从图3B可以看出，将橘皮素与舒尼替尼(1μmol/L)联用，当橘皮素的浓度为10μmol/L、30μmol/L时，细胞相对活性依次减弱，即对OS-RC-2细胞增殖的抑制作用依次增强，说明橘皮素可增强舒尼替尼对OS-RC-2细胞增殖的抑制作用，并且随着橘皮素浓度的增加，其对舒尼替尼的增敏作用更强；将橘皮素与舒尼替尼(3μmol/L)联用，同样符合上述结果，进一步说明了橘皮素可增强舒尼替尼对OS-RC-2细胞增殖的抑制作用，并且随着橘皮素浓度的增加，其对舒尼替尼的增敏作用更强。
从图3C可以看出，将橘皮素(10μmol/L)与舒尼替尼(10μmol/L)联用时，其细胞相对活性明显低于单用橘皮素(10μmol/L)和单用舒尼替尼(10μmol/L)，说明橘皮素可增强舒尼替尼对786-O细胞增殖的抑制作用。
从图3D可以看出，将橘皮素(10μmol/L)与舒尼替尼(1μmol/L)联用时，其细胞克隆体的数量少于单用橘皮素(10μmol/L)和单用舒尼替尼(1μmol/L)时的数量，说明橘皮素可增强舒尼替尼对786-O细胞克隆形成的抑制作用。
从图3E可以看出，将橘皮素(10μmol/L)与舒尼替尼(1μmol/L)联用时，细胞克隆体的数量少于单用橘皮素(10μmol/L)和单用舒尼替尼(1μmol/L)时的数量，说明橘皮素可增强舒尼替尼对769P细胞克隆形成的抑制作用。
从图3F可以看出，将橘皮素(30μmol/L)与舒尼替尼(3μmol/L)联用时，其划痕两侧的细胞迁移至中央划痕区的速度明显低于单用橘皮素(30μmol/L)和单用舒尼替尼(3μmol/L)时的速度，说明橘皮素可增强舒尼替尼对769-P细胞迁移的抑制作用。
从图3G可以看出，将橘皮素(10μmol/L)与舒尼替尼(1μmol/L)联用时，其划痕两侧的细胞迁移至中央划痕区的速度明显低于单用橘皮素橘皮素(10μmol/L)和单用舒尼替尼(1μmol/L)时的速度，说明橘皮素可增强舒尼替尼对786-O细胞迁移的抑制作用。
实施例2橘皮素联用肾癌药物对肾癌细胞相关分子表达的抑制
一、实验方法
根据前述“Western blot检测蛋白的表达”中的方法，利用Cx43的小分子干扰RNA、橘皮素和舒尼替尼对不同的肾癌细胞进行处理给药，考查橘皮素与舒尼替尼联用，以及Cx43的表达对肾癌细胞增殖、克隆、迁移密切相关的分子(磷酸化EGFR、AR、MMP-9、SOD-1、CD44、磷酸化ERK、磷酸化Stat3、BCL-2、P65、磷酸化AKT和Survivin)表达的影响。
二、实验结果
将橘皮素与舒尼替尼联用抑制ACHN细胞中Cx43的表达后，磷酸化EGFR、AR、MMP-9和SOD-1的表达下调(图4A)，且抑制了ACHN细胞中CD44的表达(图4B)；橘皮素可增强舒尼替尼对磷酸化ERK在OS-RC-2细胞中表达的抑制作用(图4C)，且将橘皮素与舒尼替尼联用，可抑制Cx43的表达，且降低了磷酸化EGFR、磷酸化ERK、P65和Survivin在肾癌OS-RC-2细胞中的表达(图4D)；橘皮素可增强舒尼替尼对磷酸化Stat3、Survivin、BCL-2和磷酸化AKT在786-O细胞中表达的抑制作用(图4E)。
实施例3橘皮素在体内作为舒尼替尼的增敏剂
根据前述“动物实验”中的方法，构建裸鼠皮下移植瘤模型，把构建好的细胞模型(OS-RC-2)及相应不同剂量的橘皮素进行灌胃或腹腔注射给药。观察橘皮素对移植瘤增殖体积、重量等情况的影响，结果如图5所示。
结果显示，橘皮素可有效增强舒尼替尼对ACHN细胞克隆形成的抑制作用(图5A)；橘皮素可增强舒尼替尼对肾癌OS-RC-2细胞在裸鼠移植瘤中生长的抑制作用(图5B)。
综上实验结果可以得到：橘皮素与抗肾癌药物(舒尼替尼、索拉非尼)联用，可有效提高抗肾癌药物靶向敏感性，增强抗肾癌药物疗效，降低药物用量，对肾细胞癌具有良好的治疗效果。抑制肾癌细胞(OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1或ACHN)的增殖、克隆、迁移，可实现对肾细胞癌良好的防治效果，为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.橘皮素在制备抗肾癌药物增敏剂中的应用，其特征在于，所述抗肾癌药物为舒尼替尼或索拉非尼。
2.橘皮素与抗肾癌药物联用在制备预防和/或治疗肾细胞癌药物中的应用，其特征在于，所述抗肾癌药物为舒尼替尼或索拉非尼。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗肾细胞癌包括抑制肾癌细胞的增殖、克隆或迁移的一种或几种能力。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述肾癌细胞包括OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1或ACHN的一种或几种。
5.根据权利要求2～4任一所述应用，其特征在于，所述肾细胞癌药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述剂型为固体剂型、半固体剂型、液体制剂或气雾制剂。
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