CN103127055A - 桔皮素作为制备治疗实体瘤化疗药物增敏剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了桔皮素在作为制备治疗实体瘤的化疗药物增敏剂中的应用。体外细胞实验表明：当5-氟尿嘧啶的浓度为25μg/ml及50μg/ml时，与桔皮素联合用药均可显著增强5-氟尿嘧啶的抗肿瘤活性，对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制发挥协同作用，当桔皮素浓度为25μg/ml时，与5-氟尿嘧啶联合用药的效果最佳。动物实验表明：桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对小鼠移植性瘤S180肉瘤的生长抑制作用明显，且能明显降低因化疗药物5-氟尿嘧啶毒性过大所致的小鼠死亡率；桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药能降低5-氟尿嘧啶的剂量，从而可缓解化疗药物5-氟尿嘧啶所致的小鼠体重降低的副作用，降低5-氟尿嘧啶对小鼠的毒性。

Description

桔皮素作为制备治疗实体瘤化疗药物增敏剂的应用

技术领域

本发明涉及黄酮类化合物桔皮素的用途，特是在制药中的用途。

背景技术

肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病，实体瘤即指有形瘤，临床可通过检查如X射线、CT扫描、B超或触诊等手段检测到的有形瘤块，分良性、恶性两类。恶性瘤块通常又称为癌症，其中临床常见恶性实体瘤包括肺癌、神经瘤、结直肠癌、肉瘤等。

结直肠癌是一种严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤。全球每年约有100万人新发结直肠癌，并且约有50万人因此死亡。结直肠癌的发病率居全球第三高，在癌症引起的死亡中排名第三，严重危害人类健康。我国结直肠癌病死率呈逐年升高的趋势，近25年来，结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤。

目前结直肠癌患者的治疗主要采取以手术为主，放化疗为辅的综合治疗模式。其中约25%～30%的结直肠癌患者在确诊时已属晚期，无法手术切除，且手术患者中约50%的患者在术后5年内会出现复发或转移。大剂量的放化疗是提高患者生存期的首选方法，但术后高复发和转移率，以及传统放化疗的巨大毒副作用是结直肠癌治疗的首要难题，使传统治疗手段在结直肠癌患者中的疗效越来越不令人满意。

肉瘤，即间叶组织的恶性肿瘤的统称。临床少见，仅占恶性肿瘤中的1%，发病者以青少年居多。目前临床治疗多以手术广泛切除为主，但易经血行转移而复发。目前常用化疗药物疗效不佳。

近年来，药理研究和临床试验表明，中药在肿瘤的临床治疗中显示出极大优势，可起到化疗增敏的作用。桔皮素（Tangeretin）可从芸香科川橘 Citrus nobilis Lour.的果皮、酸橙 C.aurantium L.的果皮以及柑橘 C.reticulata Blanco 的叶和茎中提取得到，文献报道桔皮素具有抗真菌作用，体外可抑制恶性肿瘤细胞增殖，可抑制嗜碱性细胞组胺释放；对于平滑肌的收缩亦有抑制作用。但尚未见桔皮素化疗增敏作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于证明黄酮类化合物桔皮素在制药领域中的新用途，为实体瘤的治疗提供一种化疗药物增敏剂。

本发明通过体外细胞实验证明：桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116 48小时的IC50为73.04μg/ml，5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116 48小时的IC50为63.67μg/ml；桔皮素联合浓度为50μg/ml的 5-氟尿嘧啶共同作用于人结肠癌细胞HCT-116，48小时的IC50为9.05μg/ml；桔皮素联合浓度为25μg/ml 的5-氟尿嘧啶共同作用于人结肠癌细胞HCT-116，48小时的IC50为7.45μg/ml。当5-氟尿嘧啶的浓度为25μg/ml及50μg/ml时，与桔皮素联合用药均可显著增强5-氟尿嘧啶的抗肿瘤活性，对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制发挥协同作用，当桔皮素浓度为25μg/ml时，与5-氟尿嘧啶联合用药的效果最佳。因此可将桔皮素作为制备治疗结直肠癌的化疗药物增敏剂应用。

本发明通过动物实验证明：桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对小鼠移植性瘤S180肉瘤的生长抑制作用明显，且能明显降低因化疗药物5-氟尿嘧啶毒性过大所致的小鼠死亡率；桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药能降低5-氟尿嘧啶的剂量，从而可缓解化疗药物5-氟尿嘧啶所致的小鼠体重降低的副作用，降低5-氟尿嘧啶对小鼠的免疫毒性。因此可将桔皮素作为制备治疗肉瘤的化疗药物增敏剂应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种已知化合物桔皮素的新的医疗用途，为桔皮素的应用开拓了新的领域。

2、本发明为实体瘤的治疗提供了一种新的化疗药物增敏剂，可提高化疗药物的抗肿瘤活性，并降低化疗药物的毒副作用，具有明显的社会效益。

附图说明

图1是不同浓度桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116 48h生长抑制作用曲线；

图2是不同浓度5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116 48h生长抑制作用曲线；

图3是桔皮素联合5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制作用曲线；

图4是桔皮素与5-氟尿嘧啶联合用药的等效曲线；

图5是各实验组小鼠的肿瘤照片；

图6是各组小鼠的肿瘤体积随观察天数的变化曲线；

图7是各实验组小鼠体重随观察天数的变化曲线。

具体实施方式

实施例1：桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药的体外抗肿瘤作用

1.实验材料

1.1 细胞株：人结肠癌细胞HCT-116，购自上海细胞库，由四川大学基础医学与法医学院药理教研室冻存。

1.2 试验药物及阳性对照药

1.2.1试验药物：桔皮素，购自上海同田生物技术公司，纯度≥98%，批号12062721;

5-氟尿嘧啶注射剂，购自天津金耀氨基酸有限公司，批号1105111。

1.2.2 阳性对照药：注射用盐酸多柔比星（阿霉素），浙江海正药业股份有限公司，批号090204A。

1.3试剂及配制

RPMI-1640培养基，成都哈里生物公司分装；小牛血清，成都哈里生物公司，批号090625；青、链霉素液，成都哈里生物公司分装；四甲基偶氮唑盐（MTT），Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），天津市瑞金特化学品有限公司；台盼蓝，Sigma公司；胰蛋白酶，成都哈里生物公司分装。

磷酸盐缓冲液（PBS溶液）：将PBS粉（磷酸二氢钾：0.27g，磷酸氢二钠：1.42g，氯化钠：8g，氯化钾0.2g）溶于蒸馏水，调节pH值为7.4，后定容至1L，高压消毒备用；

MTT溶液：称取250mg MTT，加入50mL 浓度为0.1mol/L PBS溶液，配制成5g/L的MTT贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃保存，两周内有效。

1.4 仪器设备

CO2培养箱，日本SANYO公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；全自动酶标仪，北京普朗新技术有限公司，型号DNM-9602G；-20℃冰箱；液氮罐；立式压力蒸汽灭菌器；电热恒温水浴锅；隔热式电热恒温培养箱；细胞培养瓶；96孔平底板。

2.实验方法

2.1 常规培养细胞

2.1.1 细胞复苏

实验前，将超净工作台的台面用紫外线照射30min，将水浴锅加水并预热至37℃，然后将完全培养基（含10%（v/v）小牛血清的RPMI-1640培养基）置于水浴锅预热。取出冻存的人结肠癌细胞HCT-116，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出，用含75%（体积百分数）酒精的棉球擦拭冻存管的外壁。吸取冻存管内细胞，转移至15ml 离心管中，同时加入5ml 预热完全培养基，500g低转速离心3-5min，吸弃上清液，向离心管内加入10ml 完全培养基，轻柔吹打制成细胞悬液。通过台盼蓝染色细胞记数并进行活力测定后，将细胞悬液加入10cm培养皿中，于5%CO₂、饱和湿度、37℃的CO2培养箱中培养过夜。

2.1.2 细胞培养与传代

将2.1.1所得细胞使用完全培养基进行培养。将长至80%-90%汇合度细胞的培养皿中原培养液吸弃，加入2-3ml PBS缓冲液，轻柔晃动培养皿，然后吸弃，加入0.25%（w/v）的胰蛋白酶EDTA溶液(加入量：10cm培养皿为1ml)，使培养皿底细胞都浸入胰蛋白酶EDTA溶液中，30s后，置倒置显微镜下观察细胞。随着时间推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶EDTA溶液弃去，加入10ml完全培养基终止消化。将贴壁的细胞吹打成悬液，按1：2分盘，于5%CO₂、饱和湿度、37℃的CO2培养箱中培养过夜。

2.1.3 细胞冻存

配制新鲜的细胞冻存培养液，所述细胞冻存培养液的组成（v/v）为：60% RPMI-1640培养基、30% 胎牛血清（FBS）、10% DMSO。取对数生长期细胞，用0.05%（w/v）的胰蛋白酶消化，将贴壁细胞吹打至悬浮后移至15ml离心管中。1000g离心5min后吸弃上清，加入适量细胞冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀并计数，调节细胞冻存培养液中细胞的最终密度为1×10⁶个/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1ml。用程序降温盒冻存细胞后移至-80℃条件下保存。

本实施例中，每次IC50测定实验均使用同一代次的细胞。

2.2 拟定及配置药物浓度

根据桔皮素及5-氟尿嘧啶（5-Fu）对人结肠癌细胞HCT-116预实验结果，拟定如表1所示的试验药物（桔皮素、5-氟尿嘧啶）及阳性对照药（阿霉素）的作用浓度。

表1 各试验药物及阳性对照药对人结肠癌细胞HCT-116的作用浓度

2.3实验分组

2.3.1 空白对照组：不含人结肠癌细胞HCT-116的完全培养基；

2.3.2 阴性对照组：未经药物处理的人结肠癌细胞HCT-116；

2.3.3 阳性对照组：按表1中的浓度梯度添加阿霉素处理的人结肠癌细胞HCT-116；

2.3.4 桔皮素实验组：按表1中的浓度梯度添加桔皮素处理的人结肠癌细胞HCT-116；

2.3.4 5-氟尿嘧啶实验组：按表1中的浓度梯度添加5-氟尿嘧啶处理的人结肠癌细胞HCT-116。

上述桔皮素实验组、5-氟尿嘧啶实验组及阳性对照组中，每个浓度梯度设3个复孔。

2.4 MTT法测试细胞活力

MTT法测试细胞活力的步骤如下：

(1) 收集对数生长期细胞，每孔加入100μl细胞悬液，每孔细胞数为优化后数量（约5×10³个/孔），孔边缘孔用无菌PBS溶液填充；

(2) 将上述步骤（1）中的细胞在5%CO₂、饱和湿度、37℃的CO₂培养箱中孵育至细胞单层铺满96孔平底板的孔底，24h后分别向阳性对照组、桔皮素实验组、 5-氟尿嘧啶实验组按表1中的浓度梯度加入含药物的RPMI-1640培养基，每孔加入200μl；

(3) 将步骤（2）加入药物后的人结肠癌细胞HCT-116在5%CO₂、饱和湿度、37℃的CO2培养箱中孵育，分别在孵育24h和48h时用倒置显微镜进行观察；

(4) 在加入药物孵育满48h后，吸弃含药物的RPMI-1640培养基，每孔加入100μl无酚红RPMI-1640培养基、10μl 浓度为5mg/ml的MTT溶液，在5%CO₂、饱和湿度、37℃的CO₂培养箱中继续培养4h；

(5) 步骤（4）的培养时间届满后，终止培养，小心吸弃孔内培养液及MTT溶液；

(6) 每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；

(7) 在全自动酶标仪上测定OD570nm 处的吸光值，同时以等体积的空白DMSO设定调零孔。

2.5 数据分析

细胞生长抑制率=（1-OD样品/OD阴性）×100%，其中OD样品为加药孔或阳性对照孔的OD值，OD阴性为不加药孔的OD值，采用SPSS17.0 数据处理软件处理数据。

2.6等效应法测定桔皮素与5-氟尿嘧啶联合用药效果

本实施例采用如下方法测定桔皮素与5-氟尿嘧啶联合用药效果：根据5-氟尿嘧啶单独对人结肠癌细胞HCT-116的IC50，分别固定其IC50和1/2IC50联合桔皮素7个浓度（具体浓度同2.2中表1）共同作用于人结肠癌细胞HCT-116，采用MTT法检测5-氟尿嘧啶与桔皮素联合用药对人结肠癌细胞HCT-116的抑制效果。

3.实验结果

3.1 桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制作用

不同浓度桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116生长抑制率及IC50（48h）如表2所示，不同浓度桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116 48h生长抑制作用曲线如图1所示。

表2 桔皮素对人结肠癌HCT-116细胞生长抑制率及IC50（48h）

从表2可以看出，桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116 48小时IC50为73.04μg/ml。

3.2  5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制作用

不同浓度5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116生长抑制率及IC50（48h）如表3所示，不同浓度5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116 48h生长抑制作用曲线如图2所示。

表3  5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞HCT-116生长抑制率及IC50（48h）

从表3可以看出，5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT-116 48小时IC50为63.67 μg/ml。

3.3 桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制作用

按照2.6所述方法，分别固定5-氟尿嘧啶的浓度为25μg/ml和50μg/ml，与桔皮素的不同浓度联合用药，测定得到5-氟尿嘧啶联合桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116的IC50分别为7.49μg/mL、9.05μg/mL，具体结果如表4和表5所示。

表4  5-氟尿嘧啶（25μg/mL）联合桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116

生长抑制率及IC50

表5  5-氟尿嘧啶（50μg/mL）联合桔皮素对人结肠癌细胞HCT-116

生长抑制率及IC50

桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制作用曲线如图3所示，由图3可知，当桔皮素浓度为25μg/ml时，与5-氟尿嘧啶联合用药的效果最佳。桔皮素与5-氟尿嘧啶联合用药的等效曲线如图4所示，在该等效曲线的直方坐标系中，横、纵坐标分别为5-氟尿嘧啶及桔皮素单独对人结肠癌细胞HCT-116的IC50，将5-氟尿嘧啶及桔皮素单独对人结肠癌细胞HCT-116的IC50用直线连接即为相加线。把固定5-氟尿嘧啶浓度为25μg/ml联合桔皮素用药时的IC50（7.49μg/ml）代入图4所示的曲线中，该值位于相加线的左下方，说明当5-氟尿嘧啶浓度为25μg/ml时，与桔皮素联合用药对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制发挥协同作用；同样，把固定5-氟尿嘧啶浓度为50μg/ml联合桔皮素用药时的IC50（9.05μg/ml）代入图4所示的曲线中，该值也位于相加线的左下方，说明当5-氟尿嘧啶浓度为50μg/ml时，与桔皮素联合用药对人结肠癌细胞HCT-116的生长抑制也发挥协同作用。

实施例2：桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对小鼠移植性瘤S180肉瘤生长抑制作用

1.实验材料

1.1实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，共180只，动物合格证SCXK（川）2008-24，购自成都达硕生物科技有限公司。

1.2  S180肉瘤：购自上海细胞库，由四川大学基础医学与法医学院药理教研室冻存。

1.3实验药物及试剂

1.3.1试验药物：桔皮素，购自上海同田生物技术公司，纯度≥98%，批号12062721；5-氟尿嘧啶注射剂，购自天津金耀氨基酸有限公司，批号1105111。

1.3.2阳性对照药：环磷酰胺粉针剂，购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号11030621。

1.3.3 试剂

0.9%氯化钠注射液（生理盐水）：购自成都青山利康药业有限公司，批号A1201082；

食用油：成都仙餐牌营养纯香压榨菜籽油，购自市场。

1.4实验药物配制

环磷酰胺：将规格为0.2g/瓶的环磷酰胺粉针剂溶于10ml生理盐水中，配制成环磷酰胺浓度为20mg/ml的溶液，临用前抽取1.5ml该溶液与3.5ml生理盐水混匀，得环磷酰胺浓度为6mg/ml的溶液；

桔皮素：分别按每毫升食用油中加入5mg的比例将桔皮素溶于食用油中，按每毫升食用油中加入2.5mg的比例将桔皮素溶于食用油中，配制后立即使用；

5-氟尿嘧啶：将规格为10ml：0.25g 的5-氟尿嘧啶注射剂在临用前用生理盐水分别稀释成5-氟尿嘧啶浓度为5mg/ml及5-氟尿嘧啶浓度为2.5mg/ml的溶液。

2.实验方法

2.1荷瘤模型的制备

将接种了移植性肉瘤S180肉瘤的小鼠在水和饲料充足的条件下喂养7-10d ，待腹水长出后，在无菌条件下抽取瘤液，按瘤液与生理盐水的体积比=1:2的比例稀释瘤液并充分混合得到细胞悬液。用台盼兰染色后，在血细胞计数器上计数，其中活细胞数大于95%，用生理盐水调整细胞悬液的浓度为1×10⁷个瘤细胞/ml。然后将调整好浓度的细胞悬液按0.2 ml/只接种于被试动物腋下，构建实体瘤动物模型（S180荷瘤小鼠）。

2.2动物分组及给药方法

小鼠接种S180肉瘤1天后，按随机数字表示将小鼠分为6组，每组10只；各组按照下述给药方法给药：

阴性对照组：腹腔注射给予等体积的食用油和生理盐水，给予食用油和生理盐水的体积分别与联合用药组I中给予的桔皮素溶液和5-氟尿嘧啶溶液的体积相同，隔天注射1次，共计注射5次，连续饲养10天；

阳性对照组：腹腔注射给予环磷酰胺溶液（浓度6mg/ml），环磷酰胺的剂量为60mg/kg小鼠体重，每周给药1次，共计给药2次；

联合用药组I：腹腔注射给予桔皮素溶液（浓度5mg/ml）和5-氟尿嘧啶溶液（浓度5mg/ml），桔皮素和5-氟尿嘧啶的剂量均为50mg/kg小鼠体重，隔天给药1次，共计给药5次，连续饲养10天；

联合用药组II：腹腔注射给予桔皮素溶液（浓度2.5mg/ml）和5-氟尿嘧啶溶液（浓度2.5mg/ml），桔皮素和5-氟尿嘧啶的剂量均为25mg/kg小鼠体重，隔天给药1次，共计给药5次，连续饲养10天；

5-氟尿嘧啶对照组I：腹腔注射给予5-氟尿嘧啶溶液（浓度5mg/ml），5-氟尿嘧啶的剂量为50mg/kg小鼠体重，隔天给药1次，共计给药5次，连续饲养10天；

5-氟尿嘧啶对照组II：腹腔注射给予5-氟尿嘧啶溶液（浓度2.5mg/ml），5-氟尿嘧啶的剂量为25mg/kg小鼠体重，隔天给药1次，共计给药5次，连续饲养10天。

2.3  检测指标及方法

2.3.1 一般情况

每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应。

2.3.2瘤体积

隔天用游标卡尺测量瘤块的长径a、短径b，按V=1/2×a×b²计算瘤体积，绘制小鼠瘤块生长曲线。

2.3.2体重

隔天称小鼠体重，绘制小鼠体重随观察天数的变化曲线。

2.3.3 死亡率

死亡率=（各组死亡动物数量/各组动物总数）×100%

2.3.4 肿瘤抑制率及免疫脏器系数的测定

于末次给药24h后，脱颈椎处死小鼠，称取各小鼠的体重。用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤，手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤，用手术剪钝性剥离肿瘤并称重，然后手术剪开腹腔，依次分离各组小鼠的脾脏及胸腺，分别称取脾脏及胸腺的重量，按下式计算肿瘤抑制率、脾脏系数及胸腺系数。

肿瘤抑制率(%) = [1-(平均实验组瘤重/平均阴性对照组瘤重) ]×100%

脾脏系数=[脾脏重量(mg)/体重(g)]×100%

胸腺系数=[胸腺重量(mg)/体重(g)]×100%

2.4统计方法

本实施例的动物实验共重复三次，结果以平均值±标准差表示，双侧t检验验证各组差异，P≤0.05认为具有统计学意义。

3.实验结果

3.1桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对小鼠S180肉瘤的肿瘤抑制率及死亡率的影响

各实验组的瘤重、肿瘤抑制率及死亡率数据如表6所示，各实验组小鼠的肿瘤照片如图5所示，由表6及图5可知，桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对小鼠移植性肿瘤S180肉瘤的生长抑制作用明显，且能明显降低因化疗药物5-氟尿嘧啶毒性过大所致的小鼠死亡率。

表6 各实验组小鼠的瘤重、肿瘤抑制率及死亡率

3.2 桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对小鼠S180肉瘤的生长抑制作用

各实验组小鼠给药期间肿瘤体积如表7所示，图6是各组小鼠的瘤体积随观察天数的变化曲线，由表7及图6可知，桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药能减缓小鼠移植性肿瘤S180肉瘤的生长速度，对肿瘤生长曲线有阻碍作用。

表7 各实验组小鼠给药期间肿瘤体积

3.3 桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对S180荷瘤小鼠体重的影响

各实验组小鼠给药期间平均体重如表8所示，图7是各实验组小鼠体重随观察天数的变化曲线，由该图可知：当5-氟尿嘧啶的剂量为50mg/kg（5-氟尿嘧啶对照组I）时，小鼠的体重降低较明显；当5-氟尿嘧啶的剂量降低为25mg/kg（5-氟尿嘧啶对照组II）时，对小鼠体重无明显影响；而当桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药时，能缓解因化疗药物5-氟尿嘧啶所致的小鼠体重降低。

表8 各实验组小鼠给药期间平均体重

3.4 桔皮素联合5-氟尿嘧啶用药对S180荷瘤小鼠免疫器官影响

各实验组小鼠的脾脏系数及胸腺系数如表9所示，由表9可知，5-氟尿嘧啶对小鼠的免疫器官影响较大，桔皮素能够逆转5-氟尿嘧啶对小鼠免疫系统的损伤，降低化疗药物5-氟尿嘧啶对小鼠的免疫毒性。

表9 各实验组小鼠的脾脏系数及胸腺系数

Claims (2)

1.桔皮素在制备治疗实体瘤的化疗药物增敏剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述实体瘤为结直肠癌或肉瘤。

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