CN103694314B - 一组蛇毒来源活性肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一组蛇毒来源的活性肽的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。具体涉及一种用化学方法制备N端为焦谷氨酸的肽类化合物，以及这类肽化合物在抗肿瘤领域的具体用途。本发明还涉及焦谷氨酰赖氨酰色氨酸（pyroGlu-Lys-Trp）、焦谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸（pyroGlu-Asn-Trp）或焦谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸（pyroGlu-Gln-Trp）的化学合成方法，以及该三肽化合物在抗肿瘤领域的应用。
Description
本申请是申请日为2010年4月29日，申请号为201010158898.7，发明名称为一组蛇毒来源的活性肽的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用化学方法制备N端为焦谷氨酸的肽类化合物，以及这类肽化合物在抗肿瘤领域的具体用途。
背景技术
蛇毒是由毒蛇的毒腺分泌的天然混合物，包括蛋白、多肽和酶类，具有抗凝、镇痛、促进神经生长和抑制肿瘤细胞生长等生物活性，是研究开发新药的重要天然化合物库之一。蛇毒中的抗肿瘤组分主要有解离素、细胞毒素和能诱导细胞凋亡的酶类及其他蛋白和多肽因子。CN101177452A公开了从断尾蝮蛇中制备具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移活性的解离素的方法；CN101270159A公开了一种抗肿瘤细胞毒素，分子量为6kDa；CN101429525A公开了表达抗肿瘤转移的蛇毒金属蛋白酶抑制剂的方法，该抑制剂分子量为46kDa；CN1781551A公开了一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制肿瘤细胞侵袭，其分子量约为100kDa。这类大分子蛋白在发挥其抗肿瘤活性的同时，也表现出了强免疫原性以及易被蛋白酶水解，半衰期短等缺点，故而制约了其临床应用。因此，有必要利用蛇资源，开发蛇毒中的小分子抗肿瘤药物。
Kai-Fa Hang等曾报道了在竹叶青蛇毒中发现了3个分子量在1000以下的具有抑制金属蛋白酶活性的小肽，参见：Kai-Fa Hang，Chin-Chun Hang，Shih-Hsiung Wu等，Characterization of Three Endogenous Peptide Inhibitors for Multiple Metalloproteinases with Fibrinogenolytic Activity from the Venom of Taiwan Habu(Trimeresursu mucrosquamatus)，Biochemical And Biophysical Research Communications.1998，248：562-566。这三个具有抑制金属蛋白酶活性的小肽均为三肽，且其N末端均是焦谷氨酸。CN101058572A公布了从皖南尖吻蝮蛇中分离具有抑制肝肿瘤细胞增殖活性小肽的方法，其分子量为429，与上述Kai-Fa Hang等报道的三个多肽中的其中一个为同一物质。总体上目前对蛇毒中小分子活性肽，特别是3KDa以下的短肽的研究开发还远不及大分子蛋白深入。同时小分子活性多肽在粗毒中含量非常低，因而从少量粗毒样品中提取活性肽往往达不到研究用量，从大量粗毒原料中虽然能够获得足够量的活性肽，但是显然增加了研究和开发成本。鉴于小分子肽类化合物仅由几个到几十个氨基酸构成，序列较容易确定，因而利用多肽固相合成技术可以很容易制备大量活性肽，解决了从粗毒中提取量少的难题。但是某些蛇毒活性肽的N端常为焦谷氨酸，具体参见：梁宁生，蛇毒中的降压组分-血管紧张素转化酶抑制剂，中国《蛇志》杂质，1993，5(3)2-5。焦谷氨酸是谷氨酸通过环化后形成的，该步反应是在蛇毒的毒腺中通过焦谷氨酸化酶催化完成的，但是目前暂没有从蛇的毒腺中提取焦谷氨酸化酶或利用其它手段将多肽N端谷氨酸环化的报道。由于现有的固相合成技术通常只能够提供N端是谷氨酸的多肽，因而需要对N端谷氨酸进行环化处理，以达到预期的活性。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种制备N端为焦谷氨酸的寡肽的方法，该方法包括：
方法（一）：将N端为谷氨酸的寡肽样品溶解在pH值2~6的缓冲液中，加入催化量的CuCl2，于60~95℃加热，将溶液冷冻干燥后即得相应的N端为焦谷氨酸的寡肽。或
方法（二）：将N端为谷氨酸的寡肽样品在固相下均匀加热，得到相应的N端为焦谷氨酸的寡肽。其中，均匀加热的方式例如：将样品在导热良好的金属板上铺成薄层然后加热，为达到此目的可以采取其他类似的加热手段，如微波加热、铺成薄层光照加热等。
上述方法中，其中寡肽是指氨基酸数目少于等于10的多肽，优选氨基酸数为3的寡肽。
上述方法（一）中，缓冲液的pH优选为3.5~4.5，缓冲液可以是甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液等，所述甲酸铵缓冲液是指甲酸铵和甲酸构成的缓冲溶液；所述乙酸铵缓冲液是指乙酸铵和乙酸构成的缓冲溶液；所述的磷酸盐缓冲液是指阴离子为PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -，阳离子为H＋、Na+或/和K+构成的缓冲溶液。优选使用磷酸盐缓冲溶液，更优选磷酸的纳盐缓冲溶液或磷酸的钾盐缓冲溶液。缓冲液中样品浓度为0.1~10mg/ml，优选为0.5~3mg/ml。催化量的CuCl2可以以固体的形式加入，也可以配置成溶液滴加，优选配置成0.05-0.2mol/l的CuCl2滴加1~10滴。加热温度优选为60~90℃，更优选80~90℃，加热时间1~4h，优选1.5~3h。
上述方法（二）中，优选在100~150℃加热0.5~4h，更优选在120~130℃加热1~2h。
本发明的另一个方面在于提供了下述三个三肽化合物的制备方法。本发明所称的“三肽化合物”，如无特别说明即是指下述三个具体的三肽中的一个或全部：焦谷氨酰赖氨酰色氨酸（pyroGlu-Lys-Trp）、焦谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸（pyroGlu-Asn-Trp）、焦谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸（pyroGlu-Gln-Trp）。所述的三肽化合物均为现有技术公开过的从蛇毒中提取的寡肽。所述的“原料三肽”是谷氨酰赖氨酰色氨酸（Glu-Lys-Trp）、谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸（Glu-Asn-Trp）、谷氨酰谷氨酰胺酰色氨酸（Glu-Gln-Trp）。
上述三个三肽化合物的制备方法包括：
方法（一）：将N端为谷氨酸的原料三肽样品溶解在pH值2~6的缓冲液中，加入催化量的CuCl2，于60~95℃加热，将溶液冷冻干燥后即得相应的N端为焦谷氨酸的三肽化合物。或
方法（二）：将N端为谷氨酸的原料三肽样品在固相下均匀加热，得到相应的N端为焦谷氨酸的三肽化合物。其中，均匀加热的方式例如：将样品在导热良好的金属板上铺成薄层然后加热，为达到此目的可以采取其他类似的加热手段，如微波加热、铺成薄层光照加热等。
上述方法（一）中，缓冲液的pH优选为3.5~4.5，缓冲液可以是甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液等，所述甲酸铵缓冲液是指甲酸铵和甲酸构成的缓冲溶液；所述乙酸铵缓冲液是指乙酸铵和乙酸构成的缓冲溶液；所述的磷酸盐缓冲液是指阴离子为PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -，阳离子为H＋、Na+或/和K+构成的缓冲溶液。优选使用磷酸盐缓冲溶液，更优选磷酸的纳盐缓冲溶液或磷酸的钾盐缓冲溶液。缓冲液中样品浓度为0.1~10mg/ml，优选为0.5~3mg/ml。催化量的CuCl2可以以固体的形式加入，也可以配置成溶液滴加，优选配置成0.05-0.2mol/l的CuCl2滴加1~10滴。加热温度优选为60~90℃，更优选80~90℃，加热时间1~4h，优选1.5~3h。
上述方法（二）中，优选在100~150℃加热0.5~4h，更优选在120~130℃加热1~2h。
本发明仅涉及N末端为谷氨酸的寡肽或原料三肽经过焦谷氨酸化成为相应的N末端为焦谷氨酸的寡肽或三肽化合物，并不涉及肽键的形成。所述的N末端为谷氨酸的寡肽或原料三肽可以通过现有多肽合成技术获得，如固相合成、液相合成、酶合成等，也可以由天然产物提取得到。
本发明所述三肽化合物的结构确证：经过质谱分析采用本方法制备得到的三个三肽化合物的相对分子质量分别为：443、429和443。紫外吸收光谱扫描结果显示，三个样品均在280nm有最大吸收。对三个样品分别进行茚三酮反应检测，结果均不显色，提示样品N端-NH2封闭，即N端为焦谷氨酸。氨基酸测序表明：三个样品从C端到N端的氨基酸分别为Trp和Lys，Trp和Asn或Trp和Gln。综上数据分析得到的三个三肽化合物分别为：pyroGlu-Lys-Trp，pyroGlu-Asn-Trp，pyroGlu-Gln-Trp。
本发明所述的制备方法还可以包括如下的纯化步骤，所述的纯化步骤包括将反应产物进一步用制备型HPLC进行反相层析纯化。其中所用的层析柱可以为本领域常用的反相介质为填料的层析柱；优选硅胶为骨架，表面键合有C18或C8反相层析介质的层析柱；最优选硅胶为骨架，表面键合C18反相层析介质的层析柱。纯化所采用的洗脱方式优选为梯度洗脱。流动液优选由三氟乙酸( TFA) 水溶液和三氟乙酸( TFA) 乙腈溶液组成，更优选三氟乙酸( TFA) 水溶液的浓度为0.05-0.2%，三氟乙酸( TFA) 乙腈溶液的浓度为0.05-0.2%的流动相；最优选三氟乙酸( TFA) 水溶液的浓度为0.1%，三氟乙酸( TFA) 乙腈溶液的浓度为0.1%的流动相。
本发明所述的制备方法简便易行、所用的原料易于获得，成本低廉。并且该方法所得到产品易于后续处理，能够得到纯度很高的产品。
本发明的再一个方面在于提供所述寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用。发明人通过体外肿瘤细胞增殖抑制试验进行筛选，发现本发明方法所制备的pyroGlu-Lys-Trp、pyroGlu-Asn-Trp和pyroGlu-Gln-Trp三肽化合物对胃腺癌细胞、乳腺癌细胞和人肝癌细胞均有较强的抑制活性。
附图说明
图1：pyroGlu-Lys-Trp三肽质谱图
图2：pyroGlu-Asn-Trp三肽质谱图
图3：pyroGlu-Gln-Trp三肽质谱图
图4：pyroGlu-Asn-Trp 高分辨率质谱图
图5：pyroGlu-Lys-Trp三肽的RP-HPLC图谱
图6：pyroGlu-Asn-Trp三肽的RP-HPLC图谱
图7：pyroGlu-Gln-Trp三肽的RP-HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1：N端为谷氨酸的多肽样品的合成
称取Fmoc-Trp-Wang Resin 0.6779g（0.59mmol/g）置于多肽合成仪的反应器中，加入10mlDMF混合1小时，使树脂充分溶胀。加入25%PIP（DMF）溶液10ml，混合30min后，用 DMF洗涤，洗涤结束后即可进行偶联反应。混合反应器中加入0.7591g Fmoc-Lys(Trt)-OH，0.64mol/L HOBT（DMF）溶液2.5 ml，0.53mol/L DIC（DMF）溶液3 ml和DMF 3ml进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应确定反应终点，得到Fmoc-Lys(Trt)-Trp-Wang Resin。
偶联反应结束后，用10ml DMF洗涤，加入25% PIP的DMF溶液10ml，进行脱保护30min，反应结束后用 DMF洗涤，向反应器加入0.6831g Fmoc-Glu(OtBU)-OH，以及0.64mol/L HOBT（DMF）溶液2.5 ml，0.53mol/L DIC（DMF）溶液3 ml和DMF 3ml进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应确定反应终点，最终得到Fmoc -Glu(OtBU)-Lys(Trt)-Trp-Wang Resin。
真空干燥合成的树脂肽，加入裂解试剂进行裂解。裂解试剂的配比为：TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS=82/3/5/5/4/1，室温搅拌反应3小时，裂解结束后，用石英漏斗进行抽滤，树脂加少量TFA洗涤，合并抽滤液，向裂解抽滤液中，按10倍量加入冰乙醚，沉淀多肽，离心，弃上清，沉淀再加乙醚洗涤离心6次，真空干燥，称重得Glu-Lys-Trp 0.40241g。
以0.7011g Fmoc-Trp-Wang Resin（0.59mmol/g）、0.9426g Fmoc-Asn(Trt)-OH和0.704gFmoc-Glu(OtBU)-OH 为原料，同法合成可得到Glu-Asn-Trp 0.18803g。
以0.7124g Fmoc-Trp-Wang Resin（0.59mmol/g）、1.027g Fmoc-Gln(Trt)-OH和0.715gFmoc-Glu(OtBU)-OH 为原料，同法合成可得到Glu-Gln-Trp 0.22254g。
实施例2
将实施例1得到的Glu-Lys-Trp三肽溶解在pH为2的磷酸钠盐缓冲液中，控制样品浓度为1mg/ml，加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于60℃水浴加热4h，将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Lys-Trp。产物使用Q-Tof mirco（Waters公司）质谱仪进行质谱分析，见附图1。
实施例3
将实施例1得到的Glu-Gln-Trp溶解在pH为6的磷酸钠盐缓冲液中，控制样品浓度为3mg/ml，加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于85℃水浴加热2h，将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Gln-Trp。产物使用Q-Tof mirco（Waters公司）质谱仪进行质谱分析，见附图3。
实施例4
将实施例1得到的Glu-Asn-Trp溶解在pH为4磷酸钾盐缓冲液中，控制样品浓度为10mg/ml，加入0.2mol/l的CuCl2三滴。于90℃水浴加热2h，将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Asn-Trp。进一步纯化后可得纯度大于98%的终产物。
纯化条件：
层析柱：Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm)；1.9×150mm
柱体积（CV）：42.5 ml
流速：10.0 ml/min
流动液组成 A：0.2%TFA水溶液 B：0.2% TFA的乙腈溶液
检测波长：215nm
梯度洗脱并收集洗脱液，利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析，根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。反相高效液相（RP-HPLC）色谱图见附图6。
产物使用Q-Tof mirco（Waters公司）质谱仪进行质谱分析，见附图2。
产物使用Q-Tof mirco（Waters公司）质谱仪进行高分辨率质谱分析，见附图4。
实施例5
将实施例1得到的Glu-Lys-Trp溶解在pH为3.5的乙酸铵缓冲液中，控制样品浓度为0.5mg/ml，调节，加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于80℃水浴加热2h，将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Lys-Trp。进一步纯化后可得纯度大于98%的终产物。
纯化条件：
层析柱：Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm)；1.9×150mm
柱体积（CV）：42.5 ml
流速：10.0 ml/min
流动液组成 A：0.1%TFA水溶液 B：0.1% TFA的乙腈溶液
检测波长：215nm
梯度洗脱并收集洗脱液，利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析，根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。反相高效液相（RP-HPLC）色谱图见附图5。
实施例6
将实施例1得到的Glu-Gln-Trp溶解在pH为4.5的甲酸铵缓冲液中，控制样品浓度为8mg/ml，加入0.1mol/l的CuCl2三滴。于75℃水浴加热3h，将溶液冷冻干燥后即得pyroGlu-Gln-Trp。进一步纯化后可得纯度大于98%的终产物。
纯化条件：
层析柱：Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm)；1.9×150mm
柱体积（CV）：42.5 ml
流速：10.0 ml/min
流动液组成 A：0.1%TFA水溶液 B：0.1% TFA的乙腈溶液
检测波长：215nm
梯度洗脱并收集洗脱液，利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析，根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。反相高效液相（RP-HPLC）色谱图见附图7。
实施例7
将实施例1得到的Glu-Lys-Trp铺成薄层，于100℃加热1h，促使焦谷氨酸化，即得pyroGlu-Lys-Trp。反应后样品进一步纯化后可得纯度大于98%的焦谷氨酸化样品。
实施例8
将实施例1得到的Glu-Asn-Trp铺成薄层，于150℃加热1h，促使焦谷氨酸化，即得pyroGlu-Asn-Trp。反应后样品进一步纯化后可得纯度大于98%的焦谷氨酸化样品。
纯化条件：
层析柱：Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm)；1.9×150mm
柱体积（CV）：42.5 ml
流速：10.0 ml/min
流动液组成 A：0.2%TFA水溶液 B：0.2% TFA的乙腈溶液
检测波长：215nm
梯度洗脱并收集洗脱液，利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析，根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。
实施例9
将实施例1得到的Glu-Gln-Trp铺成薄层，于125℃加热1h，促使焦谷氨酸化，即得pyroGlu-Gln-Trp。反应后样品进一步纯化后可得纯度大于98%的焦谷氨酸化样品。
纯化条件：
层析柱：Waters公司Sunfire C18 OBD(10μm)；1.9×150mm
柱体积（CV）：42.5 ml
流速：10.0 ml/min
流动液组成 A：0.05%TFA水溶液 B：0.05% TFA的乙腈溶液
检测波长：215nm
梯度洗脱并收集洗脱液，利用反相高效液相色谱进行峰纯度分析，根据面积归一化法将纯度在98%以上的洗脱液按峰合并。减压蒸馏除去乙腈后将样品冷冻干燥。
实施例10：体外肿瘤细胞增殖抑制活性筛选
实验方法：将处于细胞对数生长期的人低分化胃腺癌细胞 BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞 SMMC-7721分别按一定的细胞量（2500-4000/孔）接种于96孔培养板内，培养24h后分别加入以上实施例制备的焦环化的三肽样品，细胞在37℃，5%CO2条件下继续培养48小时后，加入MTT后继续培养4小时，用DMSO溶解，在酶标仪490nm下进行检测。具体数据见表一。
表一：pyroGlu-Lys-Trp对人低分化胃腺癌细胞 BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞 SMMC-7721增殖的抑制率
表二：pyroGlu-Asn-Trp对人低分化胃腺癌细胞 BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞 SMMC-7721增殖的抑制率
表三：pyroGlu-Gln-Trp对人低分化胃腺癌细胞 BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞 SMMC-7721增殖的抑制率
由以上结果可知：本发明方法所制备的pyroGlu-Lys-Trp、pyroGlu-Asn-Trp和pyroGlu-Gln-Trp三肽化合物对胃腺癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MDA-MB-231和人肝癌细胞 SMMC-7721均有较强的抑制活性。
Claims (1)
1.一种三肽化合物的制备方法，特征是将N端为谷氨酸的原料三肽样品在固相下100-150℃均匀加热0.5～4h，得到相应的N端为焦谷氨酸的三肽化合物，其中所述的原料三肽样品为谷氨酰赖氨酰色氨酸、谷氨酰天冬酰胺酰色氨酸、谷氨酰谷氨酰氨酰色氨酸。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150325 Termination date: 20180429 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |