CN102127166A

CN102127166A - 一种从生物组织或工程菌中分离纯化铁蛋白的方法

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Publication number: CN102127166A
Application number: CN2010100342087A
Authority: CN
Inventors: 曹长乾; 田兰香; 潘永信
Original assignee: Institute of Geology and Geophysics of CAS
Current assignee: Institute of Geology and Geophysics of CAS
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2011-07-20

Abstract

一种从生物组织或工程菌中分离纯化铁蛋白的方法，以富含铁蛋白的动物组织或器官或发酵收集含有重组铁蛋白基因的工程菌作为提取铁蛋白的原料，机械研磨或超声破碎成匀浆液，过滤好的匀浆液经过70-75℃水中热变性处理20min，离心取上清液，获得粗蛋白液。将得到的粗蛋白液透析平衡后，进行镍柱亲和层析，用竞争性250mM咪唑缓冲液，洗脱获得电泳纯的铁蛋白。再将铁蛋白进一步进行sepHarose 6B分子筛排阻层析，获得分离的单体铁蛋白和多聚体铁蛋白。本发明所纯化的铁蛋白在不需要任何标签的条件下，直接进行镍柱亲和层析即可得到电泳纯的铁蛋白，因而极大地省略了铁蛋白的纯化步骤。

Description

一种从生物组织或工程菌中分离纯化铁蛋白的方法

技术领域

本发明涉及从生物组织样品或工程菌体中分离纯化铁蛋白的技术，属蛋白质纯化技术领域。

背景技术

铁是生物有机体必需的金属元素之一，对于维持细胞的正常生长和代谢起着重要的作用。体内大部分铁离子都与其它蛋白质紧密结合，在生理pH值下，游离Fe²⁺浓度不多于10^-8M，Fe³⁺浓度不高于10^-18M。过量的游离态的铁会与体内过氧化物发生反应而产生活性自由基，这些活性自由基会对细胞脂膜、DNA链以及其它生物大分子产生致命的毒性。因此生物体通过铁蛋白将体内多余的铁离子暂时储存起来，以供机体需铁时再利用；同时也可以解除游离态铁离子的毒性。可见，铁蛋白在生物体铁代谢平衡中起着关键作用。目前发现铁蛋白存在于几乎所有的生物体中，包括动物、植物和微生物。铁蛋白的三维结构在真核生物和原核生物中都高度保守以维持其相同的功能。铁蛋白在结构上通常由两部分组成：外部是由24个蛋白质亚基构成的具有432点对称的高度保守笼状蛋白壳，内部空腔为水合氧化铁的磁性纳米颗粒，最大直径为7-8nm。机体内铁蛋白通常以单体和少量多聚体形式存在，且具有耐高温(＞80℃)和极端PH值(2-12)等特性。

作为储存铁的主要蛋白质，铁蛋白除了可以作为吸收利用率极高的生物补铁源外，可用于贫血人群以及铁代谢疾病的天然补铁原料。另外近年来还成为生物学家和材料学家的理想仿生合成模板。利用生物矿化原理，以铁蛋白的笼型蛋白壳作为模板，仿生合成具有磁学、电学和光学等特殊属性的重要材料是当前的热点。并且铁蛋白具有特征的磁性铁核、蛋白壳可经化学或生物修饰偶联多种配体以及对抗体具有高亲和等特点，这正是生物医学等可应用的重要特征。尤其是合成的纳米磁学材料，包括铁磁性(亚铁磁性)以及反铁磁性两大类。铁磁性(亚铁磁性)颗粒目前在影像学检测，药物靶向，细胞磁分离和磁热疗等多方面都具有重要的应用前景。反铁磁性颗粒由于具有高矫顽力，成为理想的磁记忆材料。此外由于单体铁蛋白具有无相互作用、粒度均一、室温下具有超顺磁等重要特性，是理论磁学研究的理想模式材料。

针对铁蛋白在生物医学以及材料学上的重要应用，分离纯化高纯度、高产量的单体铁蛋白和多聚体铁蛋白已经成为各种研究的前提和基础。鉴于购买商品化铁蛋白的价格极高，进一步限制了进行扩大规模的合成生产。而且目前国内基本上没有自己的铁蛋白商品，当前仅为Sigma等少数几家公司垄断。尤其重要的是对于磁学研究来说，当前没有进一步分离纯化的单体铁蛋白商品，因此利用大量廉价的原料分离纯化高产量、高纯度的单体铁蛋白具有重要的经济价值，也是本发明的意义所在。

国际上有关铁蛋白分离纯化方法有一些文献报道，但主要都沿用或参考于Granich(1946)和May and Fish(1977)所建立的方法。这些文献中所说主要的实验技术路线为：组织研磨成匀浆液-高温热变性(75℃)-硫酸铵沉淀-超速离心-琼脂糖凝胶层析。近几年很多文献报道在此基础上稍微改进，例如：Kong等(2003)和Huang等(2004)改进的实验技术路线为：组织研磨成匀浆液-高温热变性(75℃)-硫酸铵沉淀1次-硫酸铵反向提取2次-DEAE离子交换层析-SepHacryl S-300凝胶层析。Morisaka等(2009)最新报道利用高压液相色谱(HPLC)在硅胶整体柱上快速分离铁蛋白等多种蛋白。

上述分离方法都存在步骤繁琐或者对仪器要求高的不足。一般来说，分离步骤越多，目的蛋白质的损失量越大，产率越低；而且某些纯化步骤对仪器要求高，例如：超速离心需要高速离心机、高压液相色谱仪等一般实验室都没有配备。为解决仿生合成所需的大量高纯度铁蛋白模板以及贫血人群对天然补铁产品的需求，需要建立一套高效、低成本的生物分离纯化技术，利用极易获得的动物脾脏、肝脏等富含铁蛋白的组织或者大规模发酵培养的工程菌株为原料，经热变性和层析等关键技术相结合而获得廉价的、高产量和高纯度的单体铁蛋白以及多聚体铁蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从生物组织或工程菌中分离纯化铁蛋白的方法，以利用极易获得的动物脾脏、肝脏等富含铁蛋白的组织或者大规模发酵培养的工程菌株为原料，经热变性和层析等关键技术相结合而获得廉价的、高产量和高纯度的单体铁蛋白以及多聚体铁蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的从生物组织或工程菌中分离纯化单体铁蛋白的方法，其主要步骤如下：

1)将生物组织或工程菌按质量1∶1.5-2的比例加入去离子水，冰水保护下，研磨成匀浆，过滤得到匀浆液；

2)将匀浆液在70-75℃中搅拌热变性处理去除非耐热蛋白，收集上清液；在上清液中加入硫酸铵沉淀蛋白质，沉淀完全后离心收集沉淀；用缓冲液溶解沉淀，获得粗蛋白液；

3)将粗蛋白液依次进行镍柱亲和层析-分子筛层析，进行分离纯化；镍柱亲和层析获得的蛋白液中所含的铁蛋白为电泳纯，分子筛层析以分离单体和多体铁蛋白；

4)蛋白质浓缩，除盐；电泳检测单体和多体蛋白质纯度。

所述的方法中，生物组织为新鲜或-80℃至-40℃冷冻保存动物的组织或器官；工程菌为表达重组人铁蛋白的H链、重组人铁蛋白的L链、重组人铁蛋白的H链和L链的组装体、重组人铁蛋白的H链的突变体或融合蛋白和重组人铁蛋白的L链的突变体或融合蛋白的表达菌株。

所述的方法中，步骤1中的研磨包括机械匀浆、液氮匀浆或超声破碎。

所述的方法中，步骤1中机械匀浆和超声破碎需用冰水降温，防止局部温度过高蛋白质降解。

所述的方法中，步骤2中的热变性处理时间为15-20分钟。

所述的方法中，步骤2中的离心条件为0-4℃，离心机转速为10,000g，时间为20-30分钟。

所述的方法中，步骤2中的缓冲液为pH＝7.25的Tris-Hcl缓冲液。

所述的方法中，步骤3中的层析是在10倍体积的pH＝7.25的50mMTris-Hcl中透析24-36小时，温度为0-4℃。

所述的方法中，步骤3中的亲和层析填料采用商品Ni-NTA亲和层析介质。

所述的方法中，步骤3中的分子筛层析填料采用琼脂糖sepHarose 6B或者superose 6。

本发明具有如下优点：

1)本发明原料成本低，动物的脾脏、肝脏等免疫器官多不为人们所食用，是极其低廉的下水产物，但是这些动物组织中富含铁蛋白，具有极高附加值。另外基因工程菌所表达的重组人铁蛋白也可进行大规模发酵。

2)本发明利用常规的镍柱亲和层析就可实现电泳纯的铁蛋白的纯化，而且这种亲和层析不需要加入His标签，因而可以很方便地纯化生物组织中的铁蛋白，因为这些铁蛋白没有天然的His标签。对于基因工程表达的铁蛋白也具有明显的优势，因为不需要His标签，所以纯化后不需要用酶切除标签这一繁琐步骤。而亲和层析在蛋白纯化工艺中往往具有损失蛋白少，载量高，纯化快速简单以及对蛋白损伤小等优点，因而降低了铁蛋白纯化所需要的成本和时间。

3)本发明所利用的分子筛层析可以很好地分离铁蛋白中所存在的单体和多聚体，因而可以利用单体铁蛋白制备分散性更高的纳米材料。

附图说明

图1a是本发明实施例1纯化的单体猪脾铁蛋白透射电镜(TEM)负染照片。

图1b是本发明实施例1纯化的多聚体猪脾铁蛋白透射电镜(TEM)负染照片。

图2是按实施例1所纯化的猪脾铁蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中的条带1是猪脾破碎匀浆液上清；条带2是猪脾破碎匀浆液沉淀；条带3是硫酸铵沉淀溶解后以及透析后的粗蛋白液；M是Marker，从下往上大小分别为14.4、18.4、25.0、35.0、45.0、66.2、116.0kD；条带5是50mM Tris-Hcl洗脱杂蛋白；条带6、7、8是250mM咪唑洗脱铁蛋白；条带9是通过分子筛sepHarose 6B层析后的铁蛋白。

图3是按实施例1所纯化的单体猪脾铁蛋白活性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图。图中条带1为Ni-NTA亲和层析纯化的铁蛋白的活性电泳图；条带2为过分子筛sepHarose 6B层析后分离得到的单体铁蛋白。

图4是按实施例2所纯化的重组人源铁蛋白H亚基的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中条带1是工程菌破碎液上清；条带2是工程菌破碎液沉淀；条带3是75℃加热后上清；条带4是硫酸铵沉淀溶解后以及透析后的粗蛋白液；M是Marker，从下往上大小分别为14.4、18.4、25.0、35.0、45.0、66.2、116.0kD；条带6、7是50mM Tris-Hcl洗脱杂蛋白；条带8、9是250mM咪唑洗脱铁蛋白；条带10是通过分子筛sepHarose 6B层析后的铁蛋白。

图5是按实施例2所纯化的单体重组人源H亚基铁蛋白透射电镜(TEM)负染照片

具体实施方法

本发明是一种从生物组织样品或工程菌中分离纯化单体和多聚体铁蛋白的技术。针对以前铁蛋白的分离方法存在步骤繁琐或者对仪器要求高的不足，利用研究中发现在不需要组氨酸标签的前体下，铁蛋白本身对镍柱就具有特异性的亲和性的特点，发明了镍柱亲和层析技术，镍柱具有结合量大，洗脱方法简单省时，且可多次再生利用等优点，大大的缩短了纯化时间和实验成本。这是本发明区别于公知技术的关键步骤。此外，本发明采用琼脂糖sepharose 6B更加适合分离分子量为450KD-505KD的铁蛋白分子(不同物种由于铁蛋白所含的H、L两种亚基的比例不同，所以分子量有所差异)，能够很好地分离单体和多聚体，从而能够分离得到纯度较高的单体铁蛋白和多聚体铁蛋白，这也是本发明的重点改造之处。

本发明的技术方案是：

原料-前处理-提取粗蛋白-镍柱亲和层析-琼脂糖分子筛层析-蛋白质除盐、浓缩-成品

本发明的技术方案，具体按以下顺序操作：

1)原料：市场上购买富含铁蛋白的动物组织或器官，或发酵收集含有重组铁蛋白基因的工程菌作为提取铁蛋白的原料。

2)前处理：组织原料先剔除筋膜等结缔组织，然后切碎成尽可能小的块，或发酵培养后离心获得的菌体，按1∶1.5-2比例加入去离子水，在低温的冰水保护下研磨或超声破碎成组织匀浆，用5-10层纱布过滤除掉未匀浆好的组织块、筋膜等结缔组织，获得匀浆液。对于表达铁蛋白的工程菌采用超声破碎或者挤压破碎，获得匀浆液，离心收集上清液。

3)提取粗蛋白：将步骤2离心所得的上清液热变性处理，离心去除沉淀的变性杂蛋白质，收集上清液。按一定比例在上清液中加入硫酸铵沉淀蛋白质，在4℃放置6-12小时。待沉淀完全后离心收集沉淀。用50mMTris缓冲缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀，并进行透析除去硫酸铵，获得粗蛋白液。

4)分离纯化：获得的粗蛋白液依次进行镍柱(Ni-NTA)亲和层析-sepHarose 6B分子筛层析，进行分离纯化。

a)His镍柱亲和层析：

①将获得粗蛋白液加入到Ni-NTA层析柱中，使蛋白与Ni-NTA充分结合。

②将结合铁蛋白的Ni-NTA用50mM Tris缓冲液洗涤，约10-15个柱体积。目的去除非特异性结合的杂蛋白。

③加入竞争性咪唑缓冲液，洗脱目的铁蛋白。

④用蛋白质浓缩管浓缩铁蛋白粗提液。

b)琼脂糖sepharose 6B分子筛层析分离单体和多体(包括二聚体以及多聚体)铁蛋白：

①首先用0.025M Tris-Hcl(pH＝7.25)缓冲液平衡分子筛。

②将镍柱亲和层析纯化所得的蛋白液加入到层析柱中，然后用0.25MTris-Hcl(PH 7.25)缓冲液洗脱，紫外检测蛋白质的洗脱峰。

③收集对应于不同洗脱峰的蛋白质，浓缩除盐后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色以及铁染检测纯度。

5)对产品进行蛋白质定量(BCA法)。

按照本发明所纯化的铁蛋白在经过一步镍柱亲和层析后就能达到电泳纯，在SDS-PAGE中显示为单条蛋白带。然后通过琼脂糖sepHarose 6B的分子筛纯化可以进一步分离得到单体铁蛋白和多聚体铁蛋白。

应用上述技术得到的铁蛋白开辟了廉价动物组织或工程菌蛋白资源的高产值化开发途径。该技术路线结合铁蛋白的耐热特性以及两种层析技术、能够实现工业化的大规模高产量的纯化生产。纯化获得的铁蛋白均为电泳纯级别(经Native和SDS-PAGE检测均呈现铁蛋白特征条带)。而且获得的单体纯度高，可达90-95％，仅含极微量多聚体。整个分离纯化周期短，约3-4天。相对前人的分离纯化技术来说，整个实验流程费用低，产量高。目前尚未见到有关上述技术路线的相关报道。仅见国际专利DE3927139(A1)和中国专利CN101461440(A)涉及铁蛋白和铁蛋白酶解多肽的分离纯化。其中国际DE3927139使用酶解法纯化铁蛋白，实验技术与本发明完全不同。中国专利CN101461440(A)发明内容是酶解获得铁蛋白的多肽片断，而不是完整的铁蛋白分子，这也与本发明内容不同。目前文献报道的铁蛋白纯化流程存在操作步骤繁琐造成产率低、耗时长以及试验费用高等缺点。本发明利用在实验过程中发现铁蛋白在不需要His标签的条件下，直接就可以对镍就有高度的亲和性，从而利用镍柱亲和层析进行高结合量、快速简洁地分离。解决了离子交换层析结合量有序，需要分段洗脱的不足；并且分子筛层析中改选sepharose 6B填料，非常适合分离分子量为450KD-505KD的铁蛋白分子(不同物种由于铁蛋白所含的H、L两种亚基的比例不同，所以分子量有所差异)，分离单体和多聚体的效果极佳。上述本发明不同于前人文献报道或专利之处，也是本发明纯化技术的核心步骤。因此，目前尚未见有关上述技术的相关报道。

以下结合附图作进一步说明。

实施例1

1)原料：市场上购买新鲜的猪脾脏1-2条，颜色为深红色，富含铁蛋白。

2)前处理：使用干净的手术剪刀将脾脏腹面的白色筋膜等结缔组织剔除，然后切碎成小块。按质量1∶1.5-2的比例加入去离子水。在低温的冰水的保护下，用组织捣碎机高速研磨脾脏组织成匀浆，约20-30分钟。用10层纱布过滤除掉未匀浆好的组织块、筋膜等结缔组织和脂肪组织，获得匀浆液。

3)提取粗蛋白：将匀浆液在70-75℃恒温水浴锅中，搅拌热变性处理20min，可看见大部分非耐热蛋白变性沉淀。迅速将匀浆液置于4℃冰浴至室温，在4℃，10,000g下离心20-30min，收集上清液备用。然后按52g/100ml的比例在上清液中加入事先研磨成粉末的硫酸铵，加入时要求极其缓慢且边搅拌边加入，放置在4℃冰箱6-12小时，具体时间视蛋白质浓度而定。待沉淀完全后，于4℃，10,000g下离心30min，收集沉淀。用50mM Tris-Hcl(pH 7.25)缓冲液溶解沉淀，获得粗蛋白液。置于透析袋中充分透析(4℃，24-36h)，于4℃，10,000g下离心20min，取上清液，去除杂蛋白和硫酸铵。

4)分离纯化：

获得的粗蛋白液首先进行镍柱亲和层析。将获得粗蛋白液加入到Ni-NTA层析柱中，使蛋白与Ni-NTA充分结合。将结合铁蛋白的Ni-NTA用50mM Tris缓冲液洗涤，约10-15个柱体积。目的去除非特异性结合的杂蛋白。然后加入竞争性250mM咪唑缓冲液，洗脱目的铁蛋白，收集洗脱液并浓缩纯化的铁蛋白。再进行琼脂糖sepharose 6B分子筛层析分离单体和多体(包括二聚体以及多聚体)铁蛋白：首先用0.25M Tris-Hcl(pH为7.25)缓冲液平衡分子筛。平衡好分子筛后，使用一次性注射器外连接0.22μm滤膜将蛋白液过滤后直接上柱。然后用0.025M Tris-Hcl(pH为7.25)缓冲液洗脱，紫外检测蛋白质的洗脱峰。收集对应于不同洗脱峰的蛋白质。分布收集单体和多聚体进行浓缩除盐，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色检测纯度。图1a是纯化的单体猪脾铁蛋白的负染透射电镜照片，由图可知所纯化得到的猪脾铁蛋白具有完整的蛋白壳和铁核，具有很好的单分散性，无聚集现象。图1b是纯化的多聚体猪脾铁蛋白的负染透射电镜照片，由图可知多聚体显示为单个铁蛋白聚集在一起。图2是猪脾铁蛋白经过镍柱亲和层析后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图，由图可知所纯化的猪脾铁蛋白已经基本达到电泳纯。图3是经过分子筛SepHarose6B分离前后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，由图可知经过分子筛后很好地分离得到高纯度的单体铁蛋白。

实施例2

在LB培养基中发酵培养含有重组人源铁蛋白H亚基质粒的大肠杆菌BL21菌株，离心收集菌体。将菌体用去离子水混匀，使用超声破碎，将细胞破碎液在4℃下10,000g离心30min，收集上清。将上清在70-75℃恒温水浴锅中，搅拌热变性处理20min，可看见大部分非耐热蛋白变性沉淀。迅速将匀浆液置于4℃冷却至室温，在4℃，10,000g下离心20-30min，收集上清液备用。然后按52g/100ml的比例在上清液中加入硫酸铵沉淀蛋白，放置在4℃冰箱中6-12小时。待沉淀完全后，于4℃，10,000g下离心30min，收集沉淀。用50mM Tris-Hcl(pH为7.25)缓冲液溶解沉淀，获得粗蛋白液，再经过透析去除硫酸铵。获得的粗蛋白液首先进行His镍柱亲和层析。将获得粗蛋白液加入到Ni-NTA层析柱中，使蛋白与Ni-NTA充分结合。将结合铁蛋白的Ni-NTA用50mM Tris缓冲液洗涤，约10-15个柱体积。目的去除非特异性结合的杂蛋白。然后加入竞争性250mM咪唑缓冲液，洗脱目的铁蛋白，收集洗脱液并浓缩纯化的铁蛋白。再进行琼脂糖sepHarose 6B分子筛层析分离单体和多体(包括二聚体以及多聚体)铁蛋白：首先用0.25M Tris-Hcl(pH为7.25)缓冲液平衡分子筛。平衡好分子筛后，使用一次性注射器外连接0.22μm滤膜将蛋白液过滤后直接上柱。然后用0.025M Tris-Hcl(pH为7.25)缓冲液洗脱，紫外检测蛋白质的洗脱峰。收集对应于不同洗脱峰的蛋白质。分布收集单体和多聚体进行浓缩除盐，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色检测纯度。图4是重组人源铁蛋白H亚基的纯化图，由图可知所纯化的重组人源铁蛋白为电泳纯。图5是重组人源H亚基铁蛋白的单体电镜照片，由图可知所纯化的单体重组人源铁蛋白的蛋白壳完整，无内部铁核。单体铁蛋白分散性极好，没有聚集行为。

Claims

1.一种从生物组织或工程菌中分离纯化单体铁蛋白的方法，其主要步骤如下：

3)将粗蛋白液依次进行镍柱亲和层析-分子筛层析，进行分离纯化；镍柱亲和层析获得的蛋白液中所含的铁蛋白为电泳纯，分子筛层析以分离单体和多体铁蛋白；分子筛为琼脂糖sepharose 6B或者superose 6；

4)蛋白质浓缩，除盐；电泳检测单体和多体蛋白质纯度。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的生物组织为新鲜或-80℃至-40℃冷冻保存动物的组织或器官；工程菌为表达重组人铁蛋白的H链、重组人铁蛋白的L链、重组人铁蛋白的H链和L链的组装体、重组人铁蛋白的H链的突变体或融合蛋白和重组人铁蛋白的L链的突变体或融合蛋白的表达菌株。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤1中的研磨包括机械匀浆、液氮匀浆或超声破碎。

4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤1中机械匀浆和超声破碎需用冰水降温，防止局部温度过高蛋白质降解。

5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2中的热变性处理时间为15-20分钟。

6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2中的离心条件为0-4℃，离心机转速为10,000g，时间为20-30分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2中的缓冲液为pH＝7.25的Tris-Hcl缓冲液。

8.如权利要求1所述的方法，其中，步骤3中的层析是在10倍体积的pH＝7.25的50mM Tris-Hcl中透析24-36小时，温度为0-4℃。

9.如权利要求1所述的方法，其中，步骤3中的亲和层析填料采用商品Ni-NTA亲和层析介质。